miR-21-5p 靶向 TNFAIP3 對(duì)大鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷的影響

唐超 魏偉生 蔣永頌 陸健

骨關(guān)節(jié)炎 (osteoarthritis，OA) 是世界上導(dǎo)致殘疾的主要原因之一，其特征是炎癥引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷和軟骨細(xì)胞病死率升高[1-2]。目前，OA 的治療藥物主要是鎮(zhèn)痛藥和非甾體抗炎藥，它們只能緩解疼痛，但對(duì) OA 疾病的預(yù)防或改善沒有明顯的作 用[3-4]。因此，需要開發(fā)更好的靶向治療劑。

MicroRNA (miRNA) 是 OA 的重要調(diào)節(jié)因子[5]。據(jù)報(bào)道，miR-21-5p 在 OA 患者的軟骨組織中顯著上調(diào)并影響軟骨細(xì)胞增殖和凋亡，敲除 miR-21-5p 可顯著減輕小鼠的關(guān)節(jié)軟骨降解，減輕 OA 病理，可作為 OA 的新治療靶點(diǎn)[6]。然而，miR-21-5p 在 OA 軟骨細(xì)胞中的作用機(jī)制尚未完全明確。腫瘤壞死因子 α 誘導(dǎo)蛋白 3 (tumor necrosis factor alpha inducible protein 3，TNFAIP3)，也稱 A20，是一種預(yù)防炎癥的負(fù)調(diào)節(jié)因子，也是 OA 診斷的潛在標(biāo)志物[7-8]。研究顯示 TNFAIP3 是 miR-21-5p 的直接靶點(diǎn)，miR-21-5p 可與 TNFAIP3 的 3’-非翻譯區(qū)結(jié)合抑制 TNFAIP3 的表達(dá)[9-10]。但 TNFAIP3 是否介導(dǎo)了 miR-21-5p 對(duì) OA 的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在探索 miR-21-5p 對(duì) OA 大鼠軟骨細(xì)胞損傷的作用以及潛在機(jī)制。

材料與方法

一、主要試劑與儀器

改良 Eagle 培養(yǎng)基 (dulbecco’s modification of Eagle’s medium，DMEM)、胎牛血清、0.25% 胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；重組大鼠白介素 (interleukin，IL) -1β (ab9788) 購(gòu)自英國(guó) Abcam 公司，大鼠腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α) (ml002859)、IL-6 (ml102828) ELISA 試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；二辛可寧酸 (bicinchoninincacid，BCA) 檢測(cè)試劑盒 (P0012S)、放射免疫沉淀 (radio-immunoprecipitation assay，RIPA) 裂解液 (P0013B)、Cell Counting Kit-8 (CCK-8 試劑盒，C0038) 和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記 (terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (C1091) 購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素/ 碘化丙啶 (Annexin V-FITC/ PI) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 (abs50001) 購(gòu)自愛必信 (上海) 生物科技有限公司；番紅 O/ 固綠 (safranin O/ fast green) 軟骨染色液 (G1371) 購(gòu)自北京 Solarbio 公司；兔源一抗 TNFAIP3 (#5630)、核因子 κB p65 (nuclear factor κB p65，NF-κB p65) (#4764S)、p-NF-κB p65 (Ser536，#3031)、核因子 κB 抑制因子 α (nuclear factor κB inhibitor α，IκBα) (#4812)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH) (#5174) 和 Alexa Fluor 555 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG (H+L) (#4413)、山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗 (#14708) 購(gòu)自美國(guó) Cell Signaling Technology 公司。iMark680 多功能酶標(biāo)儀 (美國(guó) Bio-Rad 公司)；ABI Prism?7500 型熒光定量 PCR 儀 (美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)；NanoDrop-2000 分光光度計(jì) (美國(guó) Thermo Scientific 公司)；DM2500 熒光顯微鏡 (德國(guó) Leica 公司)。

二、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.軟骨細(xì)胞的分離、培養(yǎng)：從 5 只 4 周齡雄性 SD 大鼠 [ 中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所，生產(chǎn)許可證 SCXK (滬) 2020-0005，體重 (140±10) g，在室溫 23 ℃～25 ℃、相對(duì)濕度 50%～60%、12 h 光/ 暗循環(huán)下飼養(yǎng) ] 的髖關(guān)節(jié)中分離軟骨細(xì)胞。處死大鼠，并根據(jù)無菌要求分離關(guān)節(jié)軟骨并使用 0.25% 胰酶消化 30 min；然后使用含有 0.2% 膠原酶的 DMEM 培養(yǎng)基在 37 ℃ 下將組織再消化 4 h。消化后用 200 μm 過濾器去除組織碎片，并將細(xì)胞懸液以 1000 g 離心 5 min 以收獲軟骨細(xì)胞，隨后將其在 DMEM 培養(yǎng)基 (10% 胎牛血清和 1% 青霉素 -鏈霉素) 中于 37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)直至融合，培養(yǎng)基每 24 h 更換 1 次。

2.細(xì)胞分組與處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠軟骨細(xì)胞，以 5×105個(gè)細(xì)胞/ 孔的密度接種在 6 孔培養(yǎng)板中，分為對(duì)照組 (control 組)、IL-1β 組 (10 ng/ ml)、IL-1β+antagomir-NC 組、IL-1β+miR-21-5p antagomir 組、IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 組、IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組；當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到 70% 時(shí)，使用 Lipofectamine 2000 將 50 nmol/ L miR-21-5p 抑制劑 (miR-21-5p antagomir)、用于 TNFAIP3 沉默的小分子干擾 RNA (si-TNFAIP3) 及其陰性對(duì)照 (antagomir-NC、si-NC) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后在含有 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后 24 h，細(xì)胞在有或沒有重組 IL-1β (10 ng/ ml) 的培養(yǎng)基中再處理 24 h，然后收獲細(xì)胞用于進(jìn)一步研究。

3.實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (RT-qPCR) 檢測(cè)軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、Ⅱ 型膠原纖維 α1 基因 (collagen type Ⅱ alpha 1，COL2A1)、血小板反應(yīng)蛋白解整合素金屬肽酶 5 (A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin 5，ADAMTS5)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13 (matrix metalloproteinase-13，MMP-13) 的 mRNA 表達(dá)水平 (表 1)：使用 TRIzol 試劑從軟骨細(xì)胞中分離總 RNA。RNA 質(zhì)量使用瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，濃度使用 Nanodrop-2000 分光光度計(jì)檢測(cè)。根據(jù)說明使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 2 μg RNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA。在 ABI Prism 7500 型熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。熱循環(huán)條件如下：95 ℃ 初始變性 2 min；然后在 95 ℃ 30 s、62 ℃ 30 s 和 72 ℃ 25 s 下進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。使用公式 2-ΔΔCT分析基因表達(dá)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù) 3 次，U6 作為 miR-21-5p 的內(nèi)部對(duì)照，mRNA 表達(dá)水平使用 GAPDH 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 用于 RT-qPCR 的引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

4.ELISA 法檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子水平：從每組細(xì)胞中收集樣品上清液，然后將樣品上清液以 1200 g 離心 5 min 以去除細(xì)胞碎片并儲(chǔ)存在 -80 ℃ 冰箱中備用。使用大鼠 ELISA 試劑盒檢測(cè)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平。

5.CCK-8 法檢測(cè)軟骨細(xì)胞增殖活性：將 5×103個(gè)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種在 96 孔板中，并在含有 10% 胎牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行適當(dāng)處理后，向每個(gè)孔中加入 10 μl CCK-8 溶液，在 37 ℃ 下孵育 2 h。然后使用酶標(biāo)儀在 450 nm 處測(cè)定光密度 (optical density，OD)。

6.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)軟骨細(xì)胞凋亡：在轉(zhuǎn)染后 24 h，將細(xì)胞與 IL-1β 一起培養(yǎng) 24 h，然后通過胰蛋白酶消化收集細(xì)胞并用 PBS 洗滌 2 次。然后將細(xì)胞重新懸浮在結(jié)合緩沖液中，在室溫下用 5 μl annexin V-FITC 和 5 μl PI 避光孵育 15 min。通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

7.免疫熒光染色分析軟骨細(xì)胞 p-NF-κB p65 的核易位：軟骨細(xì)胞用 10 ng/ ml IL-1β 刺激 24 h 后，用冷甲醇固定 20 min，然后用 0.3% Triton X-100 透化 15 min。在室溫下用 5% 牛血清白蛋白封閉 1 h 后，將細(xì)胞與抗 p-NF-κB p65 的一抗在 4 ℃ 下孵育過夜。洗滌后，將細(xì)胞與 Alexa Fluor 555 標(biāo)記的山羊抗兔 IgG (H+L) 二抗在黑暗中孵育 1 h，DAPI 染色 5 min。使用 Leica 熒光顯微鏡查看結(jié)果。

8.Western blot 檢測(cè)軟骨細(xì)胞 TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 蛋白表達(dá)：將細(xì)胞在 RIPA 裂解液中裂解，4 ℃ 下以 12 000 g 離心 10 min，取上清。使用 BCA 蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度，進(jìn)行定量，調(diào)整至均勻濃度，并在 100 ℃ 下變性 5 min。然后用 10% SDS-PAGE 凝膠上分離等體積的蛋白質(zhì)并電轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜。用 5% 脫脂牛奶封閉 1 h 后，用相應(yīng)的一抗 GAPDH、TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 在 4 ℃ 下孵育過夜，所有抗體均以 1∶1000 稀釋度使用。然后用二抗 (1∶4000) 室溫進(jìn)一步孵育 2 h。最后使用 ECL 試劑盒觀察蛋白質(zhì)條帶，并進(jìn)行定量。GAPDH 為內(nèi)源性對(duì)照。

三、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.動(dòng)物分組與處理：將 40 只雄性 SD 大鼠 (6 周齡；180～240 g，食物和水、光/ 暗循環(huán)和飼養(yǎng)條件與上述相同) 分為 4 組：假手術(shù)組、模型組、antagomir-NC 組、miR-21-5p antagomir 組，每組 10 只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠采用內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)以誘導(dǎo) OA。用戊巴比妥鈉 (40 mg/ kg) 腹腔注射麻醉大鼠，打開右膝關(guān)節(jié)，仔細(xì)切除內(nèi)側(cè)半月板，沒有任何關(guān)節(jié)軟骨或韌帶損傷。假手術(shù)組進(jìn)行沒有內(nèi)側(cè)半月板橫斷的關(guān)節(jié)切開術(shù)。1 周后，800 pmol/ L antagomir-NC 或 miR-21-5p antagomir 注射到大鼠膝關(guān)節(jié)內(nèi)，每周 1 次。

2.RT-qPCR 檢測(cè) miR-21-5p 和 TNFAIP3 mRNA 水平：4 周后，處死大鼠，將膝關(guān)節(jié)標(biāo)本分為兩部分，一部分固定在 4% 多聚甲醛溶液中，用 10% EDTA 脫鈣 2 個(gè)月后，用乙醇梯度脫水，包埋在石蠟塊中；另一部分使用 Trizol 試劑從組織中提取總 RNA，RT-qPCR 檢測(cè) miR-21-5p 和 TNFAIP3 mRNA 水平。

3.組織病理學(xué)分析：使用切片機(jī)將膝關(guān)節(jié)石蠟塊切成 5 μm 的切片，用二甲苯脫蠟，然后用分級(jí)乙醇再水化。然后將切片用 TUNEL 和番紅 O/ 固綠 (safranin O/ fast green) 染色。光學(xué)顯微鏡下拍照并使用 Image J 軟件計(jì)數(shù) TUNEL 陽性細(xì)胞 (褐色或棕褐色) 數(shù)，并計(jì)算 TUNEL 陽性細(xì)胞百分比 (TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)/ 細(xì)胞總數(shù)×100%)；番紅 O/ 固綠染色切片用于檢查 OA 評(píng)分，根據(jù)國(guó)際骨關(guān)節(jié)炎研究協(xié)會(huì) (Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 軟骨評(píng)估系統(tǒng)進(jìn)行半定量評(píng)估 OA 的嚴(yán)重程度[11]。每個(gè)切片隨機(jī)選擇 3 個(gè)視野，取平均值。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)表示為，通過單因素方差分析和組間多重比較的 SNK-q檢驗(yàn)，來確定多個(gè)組之間的統(tǒng)計(jì)顯著性，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各組軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、COL2A1、ADAMTS5、MMP-13 的 mRNA 表達(dá)水平

與 control 組相比，IL-1β 組軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 和 ADAMTS5 mRNA、MMP-13 mRNA 水平顯著升高，TNFAIP3 mRNA 和 COL2A1 mRNA 水平顯著降低 (P＜ 0.05)；與 IL-1β 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 組軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 和 ADAMTS5 mRNA、MMP-13 mRNA 水平顯著降低，TNFAIP3 mRNA 和 COL2A1 mRNA 水平顯著升高 (P＜ 0.05)；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組細(xì)胞中 TNFAIP3 mRNA 和 COL2A1 mRNA 水平顯著降低，ADAMTS5 mRNA、MMP-13 mRNA 水平顯著升高 (P＜ 0.05) (表 2)。

表2 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、COL2A1、ADAMTS5、MMP-13 的 mRNA 水平比較 (，n=3) Tab.2 Comparison of mRNA levels of miR-21-5p and TNFAIP3,COL2A1,ADAMTS5,MMP-13 in rat chondrocytes in each group (,n=3)

表2 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 和 TNFAIP3、COL2A1、ADAMTS5、MMP-13 的 mRNA 水平比較 (，n=3) Tab.2 Comparison of mRNA levels of miR-21-5p and TNFAIP3,COL2A1,ADAMTS5,MMP-13 in rat chondrocytes in each group (,n=3)

注：與 control 組相比，aP ＜ 0.05；與 IL-1β 組相比，bP ＜ 0.05；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05

二、各組大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和IL-6 水平

與 control 組相比，IL-1β 組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平顯著升高 (P＜ 0.05)；與 IL-1β 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 組軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平顯著降低 (P＜ 0.05)；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平顯著升高 (P＜ 0.05) (表 3)。

表3 各組大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平比較 (，pg/ ml，n=3)Tab.3 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in the culture supernatant of rat chondrocytes in each group (,pg/ ml,n=3)

表3 各組大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 TNF-α 和 IL-6 水平比較 (，pg/ ml，n=3)Tab.3 Comparison of the levels of TNF-α and IL-6 in the culture supernatant of rat chondrocytes in each group (,pg/ ml,n=3)

注：與 control 組相比，aP ＜ 0.05；與 IL-1β 組相比，bP ＜ 0.05；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05

三、各組大鼠軟骨細(xì)胞增殖活性

與 control 組相比，IL-1β 組軟骨細(xì)胞增殖活性顯著降低 (P＜ 0.05)；與 IL-1β 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 組軟骨細(xì)胞增殖活性顯著升高 (P＜ 0.05)；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組細(xì)胞增殖活性顯著降低 (P＜ 0.05) (表 4)。

表4 各組大鼠軟骨細(xì)胞增殖活性比較 (，n=3) Tab.4 Comparison of proliferation activity of chondrocytes in each group of rats (,n=3)

表4 各組大鼠軟骨細(xì)胞增殖活性比較 (，n=3) Tab.4 Comparison of proliferation activity of chondrocytes in each group of rats (,n=3)

注：與 control 組相比，aP ＜ 0.05；與 IL-1β 組相比，bP ＜ 0.05；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05

四、各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡

與 control 組 (3.54±0.05) % 相比，IL-1β 組軟骨細(xì)胞凋亡率 (24.86±2.63) % 顯著升高 (P＜ 0.05)；與 IL-1β 組 (24.86±2.63) %、IL-1β+antagomir-NC (25.10±2.24) % 相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 組軟骨細(xì)胞凋亡率 (9.23±1.35) % 顯著降低 (P＜ 0.05)；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組 (9.23± 1.35) %、IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 組 (9.65±1.71) % 相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組細(xì)胞凋亡率 (18.37±2.06) % 顯著升高 (P＜ 0.05) (圖 1)。

圖1 各組大鼠軟骨細(xì)胞凋亡 (流式細(xì)胞術(shù)) a：control 組；b：IL-1β；c：IL-1β+antagomir-NC組；d：IL-1β+miR-21-5p antagomir 組；e：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 組；f：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組Fig.1 Apoptosis of rat chondrocytes in each group ( flow cytometry ) a: Control group; b: IL-1β group; c: IL-1β + antagomir-NC group; d: IL-1β + miR-21-5p antagomir group; e: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-NC group; f: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-TNFAIP3 group

五、各組大鼠軟骨細(xì)胞 p-NF-κB p65 的核易位

免疫熒光染色顯示，control 組軟骨細(xì)胞核中沒有顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光，IL-1β 組軟骨細(xì)胞核中顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光；與 IL-1β 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 組軟骨細(xì)胞核內(nèi)的綠色熒光減弱；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組軟骨細(xì)胞核內(nèi)的綠色熒光增強(qiáng) (圖 2)。

圖2 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 p-NF-κB p65 核易位的免疫熒光測(cè)定 a：control 組；b：IL-1β；：IL-1β+antagomir-NC 組；d：IL-1β+miR-21-5p antagomir 組；e：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 組；f：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組Fig.2 Immunofluorescence assay of p-NF-κB p65 nuclear translocation in rat chondrocytes in each group a: Control group; b: IL-1β group; c: IL-1β + antagomir-NC group; d: IL-1β + miR-21 -5p antagomir group; e: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-NC group; f: IL-1β + miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 group

六、各組大鼠軟骨細(xì)胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 蛋白水平

與 control 組相比，IL-1β 組軟骨細(xì)胞中 TNFAIP3 和 IκBα 蛋白水平顯著降低，p-NF-κB p65/ NF-κB p65 比值顯著升高 (P＜ 0.05)；與 IL-1β 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir 組 TNFAIP3 和 IκBα 蛋白水平顯著升高，p-NF-κB p65/ NF-κB p65 比值顯著降低 (P＜ 0.05)；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組 TNFAIP3 和 IκBα 蛋白水平顯著降低，p-NF-κB p65/ NF-κB p65 比值顯著升高 (P＜ 0.05) (圖 3、表 5)。

表5 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65/ NF-κB p65 和 IκBα 蛋白水平比較 (，n=3)Tab.5 Comparison of TNFAIP3, p-NF-κB p65 / NF-κB p65 and IκBα protein levels in chondrocytes of rats in each group (,n=3)

表5 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65/ NF-κB p65 和 IκBα 蛋白水平比較 (，n=3)Tab.5 Comparison of TNFAIP3, p-NF-κB p65 / NF-κB p65 and IκBα protein levels in chondrocytes of rats in each group (,n=3)

注：與 control 組相比，aP ＜ 0.05；與 IL-1β 組相比，bP ＜ 0.05；與 IL-1β+miR-21-5p antagomir 組相比，cP ＜ 0.05Notice: Compared with control group,aP ＜ 0.05; compared with IL-1β group, bP ＜ 0.05; compared with IL-1β + miR-21-5p antagomir group, cP ＜ 0.05

圖3 各組大鼠軟骨細(xì)胞中 TNFAIP3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 和 IκBα 蛋白印跡圖 (A：control 組；B：IL-1β 組；C：IL-1β+antagomir-NC 組；D：IL-1β+miR-21-5p antagomir 組；E：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-NC 組；F：IL-1β+miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 組)Fig.3 Western blot of TNFAIP3, p-NF-κB p65, NF-κB p65 and IκBα in rat chondrocytes in each group ( A: Control group; B: IL-1β group; C: IL-1β + antagomir-NC group; D: IL-1β + miR-21-5p antagomir group; E: IL-1β + miR-21-5p antagomir + si-NC group; F: IL-1β + miR-21-5p antagomir+si-TNFAIP3 group)

七、miR-21-5p antagomir 降低 OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡

與假手術(shù)組相比，模型組和 antagomir-NC 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 miR-21-5p 水平和 TUNEL 陽性細(xì)胞百分比顯著升高，TNFAIP3 mRNA 水平顯著降低 (P＜ 0.05)；與模型組相比，miR-21-5p antagomir 組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 miR-21-5p 水平和 TUNEL 陽性細(xì)胞百分比顯著降低，TNFAIP3 mRNA 水平顯著升高 (P＜ 0.05) (圖 4、表 6)。

表6 各組 OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 miR-21-5p、TNFAIP3 mRNA 水平和 TUNEL 陽性細(xì)胞百分比比較 (，n=10) Tab.6 Comparison of miR-21-5p,TNFAIP3 mRNA levels and percentage of TUNEL positive cells in knee articular cartilage tissue of OA model rats in each group (,n=10)

表6 各組 OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中 miR-21-5p、TNFAIP3 mRNA 水平和 TUNEL 陽性細(xì)胞百分比比較 (，n=10) Tab.6 Comparison of miR-21-5p,TNFAIP3 mRNA levels and percentage of TUNEL positive cells in knee articular cartilage tissue of OA model rats in each group (,n=10)

注：與假手術(shù)組相比，aP ＜ 0.05；與模型組相比，bP ＜ 0.05Notice: Compared with the sham operation group,aP ＜ 0.05;compared with the model group,bP ＜ 0.05

圖4 各組 OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡 (TUNEL) a：假手術(shù)組；b：模型組；c：antagomir-NC 組；d：miR-21-5p antagomir 組Fig.4 Apoptosis of knee articular chondrocytes in OA model rats in each group (TUNEL) a: Sham operation group;b: Model group;c: Antagomir-NC group;d: miR-21-5p antagomir group

八、miR-21-5p antagomir 降低 OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷

番紅 O/ 固綠染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，番紅 O 染色均勻，模型組大鼠出現(xiàn)膝關(guān)節(jié) OA 癥狀，包括表面裂隙的形成，番紅 O 染色減少以及深層出現(xiàn)肥大軟骨細(xì)胞；與假手術(shù)組 0.32±0.05 相比，模型組 5.74±0.60 和 antagomir-NC 組 5.80±0.63 大鼠 OARSI 評(píng)分顯著升高 (P＜ 0.05)；與模型組 5.74±0.60 相比，miR-21-5p antagomir 組大鼠膝關(guān)節(jié)番紅 O 染色增加，OARSI 評(píng)分 2.51±0.39 顯著降低 (P＜ 0.05) (圖 5)。

圖5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)番紅 O/ 固綠染色 a：假手術(shù)組；b：模型組；c：antagomir-NC 組；d：miR-21-5p antagomir 組Fig.5 Safranin O/ fast green staining of knee joints of rats in each group a: Sham operation group;b: Model group;c: Antagomir-NC group;d: miR-21-5p antagomir group

討 論

研究顯示，miR-21-5p 在 OA 中高表達(dá)，是 OA 潛在的治療靶點(diǎn)[6]。先前的報(bào)道稱，10 ng/ ml IL-1β 可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)和軟骨細(xì)胞凋亡[12]，IL-1β 參與 OA 進(jìn)展；并且 IL-1β 可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞 MMP (如 MMP-13) 表達(dá)增加，進(jìn)而導(dǎo)致 OA 中的軟骨降解以及軟骨細(xì)胞特異性蛋白 (如膠原蛋白 Ⅱ) 的低表達(dá)[13]。因此，本研究中使用 10 ng/ ml 作為 IL-1β 的工作濃度，刺激軟骨細(xì)胞以模擬 OA 的病理生理學(xué)。

MMP-13 可分解細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖，如蛋白聚糖和膠原蛋白，是 OA 中軟骨破壞的主要機(jī) 制[14]。ADAMTS 家族是復(fù)雜的分泌蛋白，在組織形態(tài)發(fā)生和病理生理重塑、炎癥和血管生物學(xué)中具有關(guān)鍵和廣泛的作用。有證據(jù)表明 ADAMTS5 是 OA 發(fā)病機(jī)制中裂解蛋白聚糖的主要蛋白聚糖酶，并且是 OA 治療干預(yù)的潛在靶點(diǎn)[15]。本研究結(jié)果顯示，在體外軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 的表達(dá)在 IL-1β 刺激后上調(diào)，并且 IL-1β 促進(jìn)軟骨細(xì)胞中炎癥介質(zhì)的釋放 (IL-6、TNF-α) 以及細(xì)胞凋亡，并刺激軟骨細(xì)胞產(chǎn)生高水平的 MMP-13 和 ADAMTS5 以及低水平的 COL2A1，破壞關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)。在 IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞中，下調(diào) miR-21-5p 可以改善 COL2A1、ADAMTS5 和 MMP-13 的變化，減少細(xì)胞凋亡和炎癥因子釋放，逆轉(zhuǎn)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的重塑。這與之前的研究一致，表明 miR-21-5p 是 OA 治療的重要靶點(diǎn)。

NF-κB 信號(hào)通路參與 OA 進(jìn)展過程中炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)。NF-κB 是一種定位于細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)錄因子，通過與抑制性蛋白 IκB 的組成型相互作用而失去活性。在存在 IL-1β 的情況下，NF-κB p65 與 IκB 分離并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的表達(dá)[16]。NF-κB 核易位的小分子抑制劑已顯示出對(duì)小鼠關(guān)節(jié)炎的治療效果[17]。本研究表明，miR-21-5p 的敲低抑制了 IL-1β 刺激的大鼠軟骨細(xì)胞中 NF-κB p65 的活化和核易位。提示，抑制 NF-κB 的活化可能是 miR-21-5p 敲低抑制軟骨細(xì)胞中 IL-1β 誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)。TNFAIP3 是一種有效的 NF-κB 信號(hào)抑制劑[18]，據(jù)報(bào)道，沉默 TNFAIP3 可提高 NF-κB 轉(zhuǎn)錄活性[19]；并且 TNFAIP3 可通過抑制 OA 成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中 NF-κB 信號(hào)通路的激活來抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，是治療 OA 的潛在靶點(diǎn)[20]。本研究通過生物學(xué)信息預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn) TNFAIP3 是 miR-21-5p 的靶蛋白，既往研究也證實(shí) miR-21-5p 可抑制 TNFAIP3 的表達(dá)[9-10]。在本研究中，IL-1β 刺激后軟骨細(xì)胞中 miR-21-5p 的上調(diào)，伴隨著 TNFAIP3 的降低；而敲低 miR-21-5p 后，TNFAIP3 表達(dá)上調(diào)，NF-κB 的活化和核易位減少；并且沉默 TNFAIP3 可逆轉(zhuǎn)敲低 miR-21-5p 對(duì)軟骨細(xì)胞的影響。提示，miR-21-5p 的高表達(dá)可能通過靶向下調(diào) TNFAIP3，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷。

筆者的體內(nèi)研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持 miR-21-5p 在 OA 病理生理學(xué)中的作用，RT-qPCR、TUNEL 和番紅 O/ 固綠染色結(jié)果表明，在體內(nèi)使用 miR-21-5p antagomir 敲低 miR-21-5p 表達(dá)可顯著上調(diào) OA 大鼠軟骨組織中 TNFAIP3 表達(dá)，減少軟骨細(xì)胞凋亡，并抑制由軟骨細(xì)胞凋亡引起的軟骨組織損失。

綜上所述，miR-21-5p 水平升高具有關(guān)節(jié)破壞作用，敲低 miR-21-5p 可通過靶向上調(diào) TNFAIP3，抑制關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡和手術(shù)誘導(dǎo)的 OA 模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的丟失，減輕 OA 期間的軟骨損傷。本研究結(jié)果將對(duì)開發(fā)新的 OA 治療方法具有重要意義。但本研究尚存在一些局限性，如 OA 常見于老年患者，來自老年動(dòng)物的細(xì)胞可能更適合體外研究；此外，由于本研究樣本有限，對(duì) miR-21-5p 分子機(jī)制的研究還需要進(jìn)一步證實(shí)。