三種補腎方含藥血清對衰老骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化及Runx2 表達的影響

楊強健，董克芳*，王 凡，林少如，黃 勇，李 為

1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410005

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的代謝性骨病，嚴重危害公眾的健康，其特點主要是骨量減少、微結(jié)構(gòu)破壞，是老年人骨折常見的根本原因[1-2]。 骨轉(zhuǎn)換失衡是骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的基本病理機制之一，而導致這一病理過程的原因可能與骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cel1s, BMSCs）的成骨、成脂分化能力的失衡直接相關(guān)[3]。 BMSCs 存在于許多組織中，可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、神經(jīng)細胞和心肌細胞等[4]。隨著人們年齡的增長，機體逐漸衰老，骨重建逐漸處于負平衡狀態(tài)，人體的骨骼成分丟失，從而引起骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生[5]。因此，探尋促進成骨分化進而誘導衰老BMSCs 向成骨方向分化，是防治骨質(zhì)疏松癥的重要研究方向。 目前，在臨床上治療骨質(zhì)疏松癥的藥物品種繁多，作用機制各異，但都存在潛在的不良反應[6-7]，中醫(yī)藥防治骨質(zhì)疏松癥有獨特的優(yōu)勢，近年來，包括中藥在內(nèi)的食物療法防治骨質(zhì)疏松癥開始引起人們的關(guān)注。 與傳統(tǒng)化學合成藥物相比，有著幾千年用藥經(jīng)驗的中藥以不良反應較少、長期使用效果更明顯等特點而得到認可[8]。 健骨二仙丸是嶺南傷科蕭勁夫教授針對骨質(zhì)疏松癥的多年臨床驗方，由明代王三才《醫(yī)便·卷一·龜鹿二仙膠》中龜鹿二仙膠加續(xù)斷、山藥組成，并有研究證實，健骨二仙丸能有效促進成骨細胞分化而調(diào)控骨轉(zhuǎn)化失衡[9]。 金匱腎氣丸出自東漢末年張仲景《金匱要略·消渴小便不利淋病脈證并治》，六味地黃丸出自宋代錢乙所著《小兒藥證直訣》，均是溫腎補精的經(jīng)典方劑，能有效防治骨質(zhì)疏松癥等疾病[10-11]。 因此，本實驗采用健骨二仙丸、六味地黃丸和金匱腎氣丸含藥血清干預衰老BMSCs，研究3 種補腎方對衰老BMSCs 成骨分化過程中細胞形態(tài)變化和Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor2, Runx2）表達的影響，以探究其防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠40 只，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SYXK(湘)2019-0004，鼠齡3～4 周，體質(zhì)量（100±10） g，自由取食涉水，飼養(yǎng)在溫度20～22 ℃、濕度40%～70%的環(huán)境下。實驗操作均在湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心完成，動物使用許可證號SYXK(湘）2019-0009。

1.2 藥物、試劑及儀器

健骨二仙丸（由龜甲、鹿角膠、黨參、枸杞子、續(xù)斷、山藥按1∶1∶3∶6∶6∶6 比例組成，共345 g）；六味地黃丸（由熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮按8∶4∶4∶4∶3∶3 比例組成，共78 g）；金匱腎氣丸（由干地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、茯苓、牡丹皮、桂枝、附子按8∶4∶4∶4∶3∶3∶1∶1 比例組成，共81 g）。 上述中藥超微飲品均由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院提供。

DMEM/F12 培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技有限公司，批號：ZQ1318）；大鼠BMSCs（武漢普諾賽生命有限公司，批號：CP-R131）；胰酶消化液、雙抗（青鏈霉素）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0201、SV30010）；胎牛血清（美國Gibico 公司，批號：10099141）。

超凈工作臺（北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司，型號：YT-CJ-2NB）；直熱式CO2培養(yǎng)箱（上海三騰儀器有限公司，型號：DH-1601）；倒置生物顯微鏡（北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司，型號：DSZ2000X）；低速離心機（上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司，型號：SL02）；多功能酶標分析儀（深圳市會松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

40 只大鼠適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機分成4 組，制備含藥血清[12]，分別為空白血清組、健骨二仙丸組、六味地黃丸組和金匱腎氣丸組，每組10 只。 給藥劑量按體表面積方法換算[13]，含藥血清組分別按照75.9、85.8、89.1 g/kg 劑量灌胃給藥，每天2 次，連續(xù)7 d，最后1 天給藥結(jié)束后1 h 腹主動脈取血，置無菌管中。 所采集的血液在室溫下靜置2 h 后，3500 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），吸取上清，0.22 μm 一次性濾過器過濾除菌，56 ℃水浴鍋滅活30 min，-80 ℃超低溫冷凍冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 BMSCs 培養(yǎng)

將BMSCs 細胞株培養(yǎng)于含10% FBS+1%雙抗的DMEM/F-12 培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3 衰老BMSCs 制備及分組

參照相關(guān)文獻[14]方法，將培養(yǎng)好的第3 代BMSCs細胞以5×103個細胞/孔種植于96 孔板中，用濃度為500 μmol/L 的30% H2O2分別處理24 h，制備衰老BMSCs。 將其分為6 組：模型組、誘導組、空白血清組、健骨二仙丸含藥血清組、六味地黃丸含藥血清組、金匱腎氣丸含藥血清組。

2.4 衰老BMSCs 成骨誘導

分組完成后，以2.0×105/cm2的濃度接種于6 孔板中，每孔加2 mL 含10% FBS 的L-DMEM 培養(yǎng)液。 當細胞貼壁生長達到60%～70%融合時，將培養(yǎng)基更換為成骨培養(yǎng)基、含藥血清、空白血清，分別進行誘導，誘導條件分別為：（1）模型組，DMEM/F12 培養(yǎng)基；（2）誘導組，成骨培養(yǎng)基；（3）血清組，成骨培養(yǎng)基中分別加入健骨二仙丸含藥血清、金匱腎氣丸含藥血清、六味地黃丸含藥血清和空白血清，培養(yǎng)2周，每隔3 天更換1 次培養(yǎng)液。

2.5 指標檢測

2.5.1 衰老BMSCs 代謝活力檢測 500 μmol/L 的30% H2O2分別處理24 h，采用CCK-8 法[15]進行檢測。 取對數(shù)增長的BMSCs，以1×104個細胞/孔密度接種于96 孔板內(nèi)，每孔100 μL，各組均設(shè)5 個復孔。細胞貼壁后，按照如上方法處理相應的時間后，加入10 μL/孔的CCK-8，用完全培養(yǎng)基配制CCK-8溶液，去除含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有CCK-8的培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2繼續(xù)孵育4 h 后于多功能酶標分析儀分析，450 nm 處測定細胞吸光度（OD）值。

2.5.2 細胞形態(tài)學的觀察 將制備好的衰老BMSCs 誘導相應時間后，PBS 清洗細胞2 遍，加4%多聚甲醛固定30 min。 PBS 清洗2 遍，加入茜素紅染液，室溫染色30 min，PBS 清洗3 遍后于顯微鏡下拍照。 分別于培養(yǎng)后第4、8、12、16 天通過倒置顯微鏡數(shù)字攝像系統(tǒng)采集圖像，觀察并采集各孔中細胞的形態(tài)學和組織學變化圖像。

2.5.3 Western blot 法檢測Runx2 蛋白表達 冰冷PBS 洗滌細胞，加入裂解液，收集懸液，超聲破碎，裂解后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min（離心半徑10 cm）。根據(jù)BCA 蛋白定量試劑盒使用說明測定蛋白濃度。制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜切膠；轉(zhuǎn)膜后封閉（1×PBST 配制5%脫脂牛奶）；一抗孵育（Runx2 稀釋比例1∶1000）；二抗孵育（鼠抗稀釋比例1∶5000）；孵育1×PBST 緩沖液漂洗3 次，每次10 min；ECL 顯色曝光成像。

2.5.4 RT-PCR 檢測Runx2 mRNA 相對表達量 Trizol 提取總RNA，RNA 反轉(zhuǎn)錄，NCBI 上搜索目的基因序列，運用primer 5 軟件設(shè)計引物，由上海生工合成引物，引物名稱及序列見表1。

表1 引物名稱及序列

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 BMSCs 代謝活力比較

與正常BMSCs 相比，H2O2處理后的BMSCs 細胞OD 均值明顯降低（P＜0.05），可見經(jīng)H2O2處理后的BMSCs 細胞活性降低。 詳見圖1。

圖1 BMSCs 經(jīng)H2O2 處理后細胞活性情況

3.2 各組細胞形態(tài)學觀察

對比模型組，誘導組和空白血清組衰老BMSCs在分化過程中，茜素紅染色增多，即鈣離子增多，成骨分化增多；對比誘導組及空白血清組，各含藥血清組衰老BMSCs 在分化過程中，茜素紅染色增多，即鈣離子增多，成骨分化增多；且除模型組外，各組隨著時間推移，茜素紅染色不斷增加，即鈣離子增多，成骨分化增多。 詳見圖2。

圖2 各組不同時間衰老BMSCs 茜素紅染色圖（×100）

3.3 各組Runx2 mRNA 和蛋白表達比較

在第4、8、12、16 天，對比模型組，誘導組、空白血清組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；對比誘導組、空白血清組，健骨二仙丸含藥血清組、金匱腎氣丸含藥血清組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平均升高（P＜0.05）。在第4、8、16 天，對比誘導組，六味地黃丸含藥血清組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平升高（P＜0.05）。在第4、12、16 天，對比空白血清組，六味地黃丸含藥血清組Runx2 mRNA 和蛋白表達水平升高（P＜0.05）。 詳見表2、圖3～4。

圖3 各組衰老BMSCs 中Runx2 蛋白電泳圖

表2 各組衰老BMSCs 中Runx2 mRNA 相對表達量（±s，n=3）

表2 各組衰老BMSCs 中Runx2 mRNA 相對表達量（±s，n=3）

注：與模型組相比，▲P＜0.05；與誘導組相比，★P＜0.05；與空白血清組相比，■P＜0.05。

組別模型組誘導組空白血清組健骨二仙丸含藥血清組金匱腎氣丸含藥血清組六味地黃丸含藥血清組第4 天1.01±0.16 1.52±0.18▲1.70±0.21▲3.27±0.32▲★■2.93±0.10▲★■2.61±0.62▲★■第8 天1.11±0.17 2.18±0.17▲2.36±0.43▲3.86±0.49▲★■3.64±0.66▲★■2.86±0.28▲★第12 天1.23±0.07 2.90±0.08▲2.65±0.16▲4.33±0.47▲★■3.91±0.16▲★■3.17±1.04▲■第16 天1.32±0.11 3.02±0.32▲3.12±0.41▲4.93±0.50▲★■4.56±0.61▲★■4.09±0.65▲★■

圖4 各組衰老BMSCs 中Runx2 蛋白表達水平

4 討論

骨質(zhì)疏松癥是一種全身性、炎癥性的骨骼疾病，患者即使在輕微外力作用下即可發(fā)生脆性骨折，進而造成創(chuàng)傷[16]。 其發(fā)病機制與Runx2、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt 等多種影響骨代謝的信號通路有關(guān)[17-18]。Runx2 是骨發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，對成骨細胞的分化、軟骨細胞成熟、破骨細胞的分化及細胞外基質(zhì)的分泌都有重要的調(diào)控作用。 因此，研究Runx2基因的表達調(diào)控、傳導通路，對治療骨代謝疾病具有重要意義[19]。BMSCs 是成骨細胞的起源，具有自我更新及多向分化的潛能，在一定條件下可通過成骨分化促進骨生成[20]，隨著人們年齡的增長，機體最終逐漸衰老，各器官功能逐漸減退，衰老BMSCs趨向成脂分化而非成骨分化。因此，治療骨質(zhì)疏松癥及其骨折等并發(fā)癥可通過促進BMSCs 成骨分化來實現(xiàn)[21]。

中醫(yī)學無骨質(zhì)疏松癥明確命名，多將其歸類為“骨痿”“骨枯”等范疇，認為骨質(zhì)疏松癥是先天遺傳、飲食勞倦、年老體衰、六淫、情志等原因所致，病位在腎，與肝、脾有關(guān)，病機為肝腎虧虛。 大量研究表明，各種補腎單藥或合方可促進BMSCs 成骨分化，如LIN 等[22]發(fā)現(xiàn)牛膝多糖可以顯著促進MC3T3-E1 細胞增殖、分化和礦化，使成骨基因Runx2、成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子(Osterix, Osx)的mRNA 表達量有所提高。Runx2、Osx 可以調(diào)節(jié)骨橋蛋白、唾液蛋白和骨鈣素的表達，從而促進骨形成的發(fā)生。健骨二仙丸是由《醫(yī)方考》中龜鹿二仙膠加續(xù)斷、山藥組成的經(jīng)驗方，主要作用是補腎填髓。 徐衛(wèi)峰等[23]的研究表明，龜鹿二仙膠可以通過逆轉(zhuǎn)骨形成/骨吸收的不平衡來預防骨質(zhì)疏松癥。六味地黃丸方劑源自宋代《小兒藥證直決》，是治療腎陰虛證的常用、有效方劑。研究表明，六味地黃丸可提高臨床患者骨密度[24]、改善臨床癥狀[25]，對鈣的吸收和骨的重建有益。金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、附子、桂枝組成，具有溫補腎陽、化氣行水之功效。 張倩等[26]研究顯示，金匱腎氣丸通過影響堿性磷酸酶、白細胞介素-6、骨保護素的表達抑制破骨細胞活性，促進骨形成，改善骨組織微結(jié)構(gòu)，提高骨密度，以改善骨質(zhì)疏松癥。 因此，本實驗探究3 種補腎中藥對衰老BMSCs 成骨分化及Runx2 的影響，對于防止骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，健骨二仙丸含藥血清組、金匱腎氣丸含藥血清組、六味地黃丸含藥血清組在衰老BMSCs 分化過程中，均可使茜素紅染色增多，即鈣離子增多，成骨分化增多。 健骨二仙丸含藥血清組、金匱腎氣丸含藥血清組在各個時間點均能促進Runx2 的表達，對比誘導組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而六味地黃丸含藥血清亦能促進Runx2 的表達，但對比誘導組，僅在第4、8、16 天差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對比空白血清組，僅在第4、12、16天差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，使用3 種補腎方含藥血清對衰老BMSCs 進行干預，可增加鈣離子而使茜素紅染色增多，促進Runx2 表達，促進其成骨分化，增加骨量生成。今后將進一步加強其機制研究，為臨床使用補腎方藥防治療骨質(zhì)疏松癥提供理論依據(jù)。