椒目油對SD 大鼠灌胃給藥的急性毒性研究

鄧羽豐，羅姝菡，何方婷，武雅婷，肖 穎，洪澤慧，裴曉方*

1.四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院，四川 成都 610041；

2.食品安全檢測與風(fēng)險評估四川省重點實驗室，四川 成都 610041

椒目（Zanthoxylum bungeanum seed）是花椒果皮生產(chǎn)過程中的主要副產(chǎn)物，產(chǎn)量占花椒總產(chǎn)量的60%～70%[1]，椒目及其提取物的深入研究與開發(fā)對花椒的綜合利用具有重要意義。椒目味苦、辛，性寒，有小毒，常作為治療哮喘的傳統(tǒng)中藥，具有利水消腫、祛痰平喘之功，主治水腫脹滿、痰飲喘逆之癥[2-3]。 椒目油是采用壓榨、有機溶劑萃取或微波輔助提取等方法，從椒目中獲取的植物油[4]。 近年研究發(fā)現(xiàn)，椒目油富含多不飽和脂肪酸[5]，其主要成分油酸、亞油酸、亞麻酸的混合含量高達57.549%～87.907%[6]，α-亞麻酸含量占17%～24%[7]。 此外，多項研究證實，椒目油具有抗炎[8]、降血脂[9]、抗骨質(zhì)疏松[10]的功效，是一種亟待開發(fā)的具有疾病防治功效的植物油。為論證椒目油灌胃給藥的安全性，本研究觀察椒目油對SD 大鼠的急性毒性作用，為椒目油后續(xù)研究中安全性評價、劑量設(shè)計和毒副反應(yīng)監(jiān)測等方面提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

56 只SD 雌鼠，SPF 級，8 周齡，體質(zhì)量（250±30） g，由浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK（浙）2019-0001。于四川大學(xué)華西第四醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（川）2018-011，溫度（23±3） ℃，濕度40%～70%，顆粒飼料由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供。 所有動物實驗操作程序均通過四川大學(xué)華西公共衛(wèi)生學(xué)院/華西第四醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：Gwll2021054）。

1.2 受試物

將烘干至恒重的紅花椒椒目過40 目篩后粉碎，取粉末轉(zhuǎn)移至濾紙筒中，以正己烷作為溶劑，料液比1∶6，采用索氏提取法于65 ℃抽提8 h，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收剩余產(chǎn)物，（103±2） ℃烘干恒重后獲得椒目油，0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌后于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

椒目（安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司，批號：2105001）；玉米油（北京索萊寶科技有限公司，貨號：C7030）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（北京萊伯泰科儀器有限公司，型號：EV311）；循環(huán)水式真空泵[鞏義市英峪予華儀器廠，型號：SHZ-D（Ⅲ）]；全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：AU480）；脫水機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JJ-12J）；包埋機（武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司，型號：RM2016）；正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon 公司，型號：Eclipse Ci-L）。

2 方法

2.1 動物分組

取健康SD 雌性大鼠56 只，隨機分為溶劑對照組（n=9）、最低劑量組（n=9）、低劑量組（n=9）、中劑量組（n=9）、高劑量組（n=10）、最高劑量組（n=10）。 以玉米油對椒目油原液進行對倍稀釋，配制成系列濃度，分別用于最低劑量組（6.25%）、低劑量組（12.5%）、中劑量組（25%）、高劑量組（50%）、最高劑量組（椒目油原液）灌胃，溶劑對照組同時給予等體積玉米油。

2.2 劑量選擇和給藥方法

椒目油比重為0.867 6 g/mL，本研究參考謝曉芳[11]研究方法，每日按照15 mL/kg 灌胃1 次，最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、最高劑量組椒目油劑量分別為0.813 4、1.626 8、3.253 5、6.507 0、13.014 0 g/kg。 灌胃劑量為 《中國居民膳食指南（2016）》[12]推薦每日成年人食用油攝入量25～30 g的1.6～26 倍。 觀察14 d，每日稱量大鼠體質(zhì)量。

2.3 大鼠血清肝腎功能相關(guān)指標(biāo)的測定

給藥后，觀察并記錄動物給藥后的毒性反應(yīng)和死亡情況。 給藥后2 h 內(nèi)每15 min 觀察1 次，2～4 h內(nèi)每30 min 觀察1 次，4～8 h 內(nèi)每1 h 觀察1 次，8～24 h 內(nèi)每4 h 觀察1 次，之后逐日觀察大鼠的精神活動，進食，大小便形態(tài)，被毛、四肢活動等，并記錄出現(xiàn)的毒性反應(yīng)表現(xiàn)及其開始和消失的時間。 觀察14 d 后，股動脈采血測定各組大鼠血液生理指標(biāo)，包括中性粒細胞百分比（neutrophil percentage,NEUT%）、淋巴細胞百分比（lymphocytes percentage,LYMPH%）、中性粒細胞絕對值（neutrophil, NEUT）、淋巴細胞絕對值（lymphocyte, LYMP）；肝腎功能相關(guān)血清生化指標(biāo)，包括血清總蛋白（total protein, TP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase, AST）、AST/ALT、尿素氮（urea nitrogen, UREA）、肌酐（creatinine, CREA）、空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）。

2.4 臟器系數(shù)測定

根據(jù)解剖當(dāng)日稱量獲得的大鼠體質(zhì)量和心臟、肝臟、左腎、右腎凈重，計算臟器系數(shù)[13]。 臟器系數(shù)=器官質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100%。

2.5 HE 染色

取大鼠臟器，包括肝臟、脾臟、腎臟、胃，用4%多聚甲醛固定24 h 后，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、蘇木精和伊紅染色、脫水，最后用中性樹膠封片。制片完成后由2 位病理學(xué)專家以盲法于每張切片中隨機挑選6 個視野在光學(xué)顯微鏡下進行讀片和拍攝。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 一般觀察

給予椒目油灌胃后無動物死亡，觀察期內(nèi)各組動物外觀、行為、排便、呼吸、腺體分泌等均無異常。

3.2 各組大鼠體質(zhì)量比較

各給藥組體質(zhì)量與溶劑對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），觀察時間與灌胃干預(yù)之間無交互作用（P＞0.05）。 詳見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（±s，g）

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化（±s，g）

組別溶劑對照組最低劑量組低劑量組中劑量組高劑量組最高劑量組n 9 9 9 9 1 0 10 1 d 245.80±17.07 252.04±21.26 253.22±14.33 254.33±14.99 259.10±15.64 257.26±12.36 4 d 263.43±16.28 263.30±17.25 265.67±18.13 265.23±12.48 264.93±19.43 271.68±16.33 9 d 268.02±22.53 273.01±20.51 273.18±19.10 278.09±15.81 273.77±22.23 277.73±19.27 14 d 254.58±20.05 256.92±20.01 256.32±18.61 262.59±15.40 258.87±21.69 258.50±11.76

3.3 各組大鼠進食量比較

與溶劑對照組比較，14 d 時，高劑量組進食量增加（P＜0.05）；其余各組間進食量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表2。

表2 各組大鼠進食量變化（±s，g）

表2 各組大鼠進食量變化（±s，g）

注：與溶劑對照組比較，*P＜0.05。

組別溶劑對照組最低劑量組低劑量組中劑量組高劑量組最高劑量組n 9 9 9 9 1 0 10 1 d 80.65±5.44 88.30±27.01 82.00±8.34 97.85±19.45 185.85±98.36 110.50±32.81 4 d 125.35±48.44 109.60±17.25 87.55±14.21 101.80±24.61 145.30±50.49 128.85±16.05 9 d 104.40±29.56 116.85±8.84 119.95±2.62 134.65±7.71 163.30±49.92 126.45±1.06 14 d 100.50±22.77 102.65±13.36 107.55±14.35 131.75±5.87 146.10±7.35*118.30±7.50

3.4 各組大鼠血液生理指標(biāo)比較

與溶劑對照組比較，最低劑量組、中劑量組、最高劑量組NEUT%水平下降、LYMPH%水平上升（P＜0.05），最高劑量組NEUT 水平下降（P＜0.05），中劑量組、最高劑量組LYMP 水平上升（P＜0.05）。與最低劑量組相比，低劑量組NEUT%水平上升、LYMPH%水平下降（P＜0.05）。 與低劑量組相比，中劑量組、最高劑量組NEUT%水平下降、LYMPH%水平上升（P＜0.05），最高劑量組NEUT 水平下降（P＜0.05）。 與高劑量組相比，最高劑量組NEUT%及NEUT 水平下降、LYMPH%水平上升（P＜0.05）。 詳見表3。

表3 各組大鼠血液生理指標(biāo)變化（±s）

表3 各組大鼠血液生理指標(biāo)變化（±s）

注：與溶劑對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與最低劑量組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與高劑量組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01。

組別溶劑對照組最低劑量組低劑量組中劑量組高劑量組最高劑量組n 9 9 9 9 1 0 10 NEUT%22.64±5.51 15.13±5.29*21.83±6.60#14.91±6.68*△17.75±9.99 9.25±5.31**△△&&LYMPH%66.79±6.04 74.61±5.73*67.06±6.52#76.36±7.94**△△70.30±10.52 79.07±8.68**△△&NEUT/（×109·L-1）1.57±0.92 1.21±1.02 1.62±0.73 1.21±0.81 1.40±0.82 0.65±0.49*△&LYMP/（×109·L-1）4.33±1.23 5.49±2.00 5.03±1.51 6.24±1.78*5.67±1.38 6.12±2.78*

3.5 各組大鼠血清生化指標(biāo)比較

與溶劑對照組比較，最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組CREA 水平下降（P＜0.01），高劑量組FPG 水平上升（P＜0.01）。 與最低劑量組相比，中劑量組、高劑量組FPG 水平上升（P＜0.05）。 與低劑量組相比，中劑量組、高劑量組FPG 水平上升（P＜0.05）。各組大鼠肝臟功能相關(guān)血清生化指標(biāo)變化兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見表4～5。

表4 各組大鼠腎臟功能相關(guān)血清生化指標(biāo)變化（±s）

表4 各組大鼠腎臟功能相關(guān)血清生化指標(biāo)變化（±s）

注：與溶劑對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與最低劑量組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與低劑量組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別溶劑對照組最低劑量組低劑量組中劑量組高劑量組最高劑量組n 9 9 9 9 1 0 10 UREA/（mmol·L-1）7.95±2.00 6.97±1.18 7.01±1.05 7.92±1.52 7.56±1.49 7.72±1.75 CREA/（μmol·L-1）32.26±4.44 26.58±3.17**27.48±3.48**26.40±1.52**27.87±2.16**27.64±3.04 FPG/（mmol·L-1）5.69±0.44 5.57±0.30 5.64±0.46 6.07±0.34#△6.40±0.49**##△△5.87±0.57

3.6 各組大鼠臟器系數(shù)比較

與溶劑對照組比較，最低劑量組心臟系數(shù)下降（P＜0.05），最高劑量組肝臟系數(shù)上升（P＜0.05），最低劑量組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、最高劑量組左腎系數(shù)上升（P＜0.05），最低劑量組、低劑量組、中劑量組右腎系數(shù)上升（P＜0.05）。與最低劑量組相比，低劑量組及最高劑量組心臟系數(shù)上升、高劑量組右腎系數(shù)下降（P＜0.05）。與低劑量組相比，高劑量組左腎系數(shù)下降（P＜0.05）。 詳見表6。

表6 各組大鼠心臟、肝臟、腎臟系數(shù)變化（±s，%）

表6 各組大鼠心臟、肝臟、腎臟系數(shù)變化（±s，%）

注：與溶劑對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與最低劑量組比較，#P＜0.05；與低劑量組比較，△P＜0.05。

組別溶劑對照組最低劑量組低劑量組中劑量組高劑量組最高劑量組n 9 9 9 9 1 0 10心臟0.39±0.06 0.34±0.03*0.39±0.04#0.37±0.04 0.37±0.04 0.39±0.02#肝臟2.76±0.19 2.92±0.16 2.89±0.20 2.88±0.16 2.89±0.24 3.00±0.14*左腎0.35±0.02 0.39±0.02*0.40±0.02*0.39±0.01*0.38±0.02*△0.39±0.03*右腎0.37±0.02 0.41±0.03*0.40±0.02*0.40±0.02*0.38±0.03#0.39±0.03

表5 各組大鼠肝臟功能相關(guān)血清生化指標(biāo)變化（±s）

表5 各組大鼠肝臟功能相關(guān)血清生化指標(biāo)變化（±s）

組別溶劑對照組最低劑量組低劑量組中劑量組高劑量組最高劑量組n 9 9 9 9 1 0 10 TP/（g·L-1）66.41±2.62 65.63±2.52 68.98±5.16 66.86±3.74 66.11±4.82 68.26±4.21 ALT/（U·L-1）25.56±3.43 28.44±8.43 23.78±4.18 26.00±4.56 24.20±5.55 25.00±4.32 AST/（U·L-1）136.67±17.77 148.67±21.81 140.78±26.60 129.00±28.01 124.80±18.28 129.00±21.86 AST/ALT 5.41±0.78 5.46±0.96 5.94±0.78 5.06±1.30 5.28±0.81 5.27±1.19

3.7 各組大鼠大體解剖及組織病理學(xué)變化

實驗結(jié)束后對所有動物進行大體解剖檢查，各組動物被毛光滑，各臟器組織結(jié)構(gòu)未見明顯異常。各組大鼠肝臟組織可見肝細胞脂肪變性、細胞質(zhì)內(nèi)存在體積微小的圓形空泡，局部血管周圍見少量炎性細胞浸潤；脾臟病理切片視野內(nèi)白髓形狀不規(guī)則，細胞排列疏松，細胞間距增寬；腎臟出現(xiàn)少量的腎小管上皮細胞壞死脫落、胞核固縮深染、胞質(zhì)嗜酸性增強，未見明顯的炎性改變；胃出現(xiàn)中等量胃腺擴張、管腔形狀不規(guī)則、上皮扁平化，黏膜肌層見少量炎性細胞浸潤。 各劑量組與溶劑對照組臟器組織病變發(fā)生率均較低，且基本一致。 詳見圖1～4。

圖1 各組大鼠肝臟病理切片（HE，×100）

4 討論

圖2 各組大鼠脾臟病理切片（HE，×100）

圖3 各組大鼠腎臟病理切片（HE，×100）

圖4 各組大鼠胃病理切片（HE，×100）

椒目作為花椒生產(chǎn)中的主要副產(chǎn)物，現(xiàn)已被貴州、四川、陜西等多個省份的中藥材地方標(biāo)準(zhǔn)收載[14]。近年來，椒目不斷被研究和開發(fā)，多數(shù)研究都集中于椒目油，天然產(chǎn)物或藥用植物在安全性未經(jīng)過科學(xué)實驗研究評估之前，進行疾病防治研究存在著較高的未知安全風(fēng)險。為評價椒目油灌胃給藥的安全性，為后續(xù)椒目油開發(fā)利用提供安全性評價和劑量設(shè)置依據(jù)，本研究采用SD 大鼠進行急性毒性實驗，觀察椒目油對SD 大鼠的急性毒性作用。

本研究關(guān)于SD 大鼠進食量的結(jié)果顯示，灌胃給椒目油之后，高劑量組、最高劑量組單日進食量較其他劑量組有明顯增加，其中高劑量組大鼠單日進食量波動較大。 劉少陽等[15]在蘋果籽油的毒理學(xué)實驗中也發(fā)現(xiàn)大鼠實驗各劑量組動物食物利用率均高于陰性對照組，并指出這可能與動物攝入油脂量有關(guān)，但具體情況有待進一步研究。許小紅等[16]在對白條黨參安全性毒理學(xué)評價中發(fā)現(xiàn)高劑量組雌性動物的總進食量高于陰性對照組，認為進食量的改變?yōu)榉怯泻π?yīng)，無毒理學(xué)意義。 另外，本實驗期間觀察到高劑量組大鼠存在啃咬飼料的情況，可能為造成高劑量組大鼠飼料消耗量增多的原因之一。 綜上可知，僅靠進食量的改變尚不能說明椒目油對SD大鼠具有毒性作用。

本研究分析血液學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，椒目油干預(yù)能夠引起大鼠外周血NEUT%、NEUT 水平下降，LYMP、LYMPH%水平上升，但其毒理學(xué)意義尚不明確。 中性粒細胞、淋巴細胞水平在一定程度上可反應(yīng)機體的生理狀況。 黃潔瑤等[17]在香連丸長期毒性實驗研究中指出，香連丸可降低SD 大鼠外周血單核細胞百分比、NEUT，升高LYMPH%，且大鼠肝臟和肺臟有明顯病變，表明香連丸可能存在一定的溶血毒性。而在本研究中，僅最低劑量組、中劑量組、最高劑量組與溶劑對照組NEUT%、NEUT、LYMPH%、LYMP差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，指標(biāo)之間存在一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，但絕對值差異較小。 此外，其余血常規(guī)指標(biāo)各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，病理組織學(xué)檢查肝臟、脾臟、腎臟、胃器官均未見明顯病變，尚不能認為椒目油對SD 大鼠具有毒性作用。

椒目油是否對SD 大鼠外周血中性粒細胞、淋巴細胞水平產(chǎn)生影響仍然值得關(guān)注。研究表明，椒目油促進哮喘動物模型肺組織中嗜酸性粒細胞的凋亡， 抑制嗜酸性粒細胞等炎性細胞的浸潤是其發(fā)揮抗哮喘作用的主要機制[18-20]。金賽紅[21]在椒目油對炎癥細胞的作用及機制研究中提出，椒目油可以抑制卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠外周血嗜酸性粒細胞增高，而對中性粒細胞、淋巴細胞水平無影響。 在椒目油對動物外周血指標(biāo)的影響方面，以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果差異較大，這可能是由于本研究椒目油干預(yù)次數(shù)較少、觀察時間較短造成的。但以上研究僅關(guān)注于椒目油對哮喘的防治作用且多為早期研究，明確椒目油能否影響中性粒細胞、淋巴細胞水平可為椒目油調(diào)節(jié)慢性炎癥反應(yīng)和外周免疫，進而發(fā)揮防治慢性疾病的作用研究提供基礎(chǔ)。

CREA 主要由肌酸代謝和肉類食物體內(nèi)代謝后產(chǎn)生，是腎功能評價的重要指標(biāo)之一[22]。本研究發(fā)現(xiàn)椒目油降低了大鼠血清CREA 水平，但由于CREA降低并無明確的毒理學(xué)意義[23]，且其他相關(guān)指標(biāo)未出現(xiàn)明顯改變，該結(jié)果并不能明確椒目油對大鼠腎臟功能的毒性作用。 魏月媛等[24]在對火麻仁油安全性的毒理學(xué)評價中也發(fā)現(xiàn)極個別臟器質(zhì)量和臟體比指標(biāo)與對照組有顯著性差異，認為數(shù)值相差不大，且無明顯劑量-反應(yīng)關(guān)系，出現(xiàn)波動屬正常現(xiàn)象。 本研究結(jié)果中大鼠腎臟功能相關(guān)指標(biāo)改變的絕對值差異也較小，且無劑量效應(yīng)關(guān)系。 此外，我們分析大鼠臟器系數(shù)增加可能是由于單次給予大劑量椒目油引起的。喬玉峰等[25]在研究中指出，給予高劑量且成分復(fù)雜的中藥復(fù)方灌胃干預(yù)，可造成肝臟、腎臟代謝負荷增大，而引起動物肝臟、腎臟質(zhì)量可逆性增加。 本研究以椒目油為供試品，其成分復(fù)雜且單次給藥量大，因此，椒目油對大鼠腎臟的影響可能并非毒性作用。 由于大鼠腎臟功能相關(guān)指標(biāo)改變絕對值差異較小、毒理學(xué)意義不明且無劑量效應(yīng)關(guān)系，同時，本研究觀察時間短，未能明確觀察到指標(biāo)改變是否為可逆，結(jié)合組織病理學(xué)切片檢查肝臟、脾臟等器官均未見明顯病變，因此，尚不能認為椒目油對SD 大鼠具有腎臟毒性作用。

綜上所述，SD 大鼠1 日內(nèi)灌胃不同濃度的椒目油，觀察期結(jié)束后，各生化指標(biāo)和組織病理學(xué)檢查未見明顯毒性異常，根據(jù)本研究結(jié)果可認為椒目油對SD 大鼠無急性毒性作用。 此外，椒目油若作為防治慢性疾病的食物來源補充劑被開發(fā)，為確定其口服安全劑量，還應(yīng)進行亞急性灌胃毒性、長期毒性試驗研究。