積雪草苷通過Nrf2/HO-1 信號(hào)通路對(duì)創(chuàng)傷膿毒血癥大鼠腎損傷的保護(hù)作用研究

朱恒杰，曾允富*，程少文，鄭林洋

海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診和創(chuàng)傷外科，海南 ?？?400000

膿毒血癥是一種影響全身的炎癥反應(yīng)綜合征，可由感染、創(chuàng)傷等原因?qū)е?，臨床上屬于危重癥，死亡率極高[1]。 膿毒血癥容易導(dǎo)致多組織、多器官的損傷，其中腎臟是最常見的受損器官，若不及時(shí)進(jìn)行有效處理，疾病極易通過腎損傷發(fā)展為多器官衰竭，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡[2]。 故本文以腎臟為膿毒血癥疾病進(jìn)展的代表進(jìn)行研究。 在膿毒血癥疾病進(jìn)展的復(fù)雜病理機(jī)制中，氧化應(yīng)激系統(tǒng)過度反應(yīng)而平衡失調(diào)是膿毒血癥致腎損傷的重要原因。 大量活性氧因子可通過氧化反應(yīng)引發(fā)機(jī)體嚴(yán)重的應(yīng)激損傷，造成腎小球腎小管等組織壞死，腎功能急劇下降。 因此，許多學(xué)者認(rèn)為，調(diào)控并延緩生物體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，有望成為治療膿毒血癥腎損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3-4]。

傘形科植物積雪草[Centella asiatica （L.） Urban]是一種源于中國廣西的壯族醫(yī)藥，具有消腫、促進(jìn)循環(huán)和利尿等功效[5]。三萜皂苷積雪草苷（asiaticoside,AS）是從積雪草中分離的一種天然化合物，在體外細(xì)胞培養(yǎng)和活體動(dòng)物模型等實(shí)驗(yàn)中顯示出廣泛的生物活性，目前已經(jīng)證實(shí)其具有抗氧化、抗炎、抗病毒、促進(jìn)傷口愈合等多種藥理作用[6-8]。 研究發(fā)現(xiàn)，AS可以通過降低小鼠腎組織中的誘生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）蛋白表達(dá)與血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6, IL-6）的含量，減輕炎癥反應(yīng)，改善膿毒血癥導(dǎo)致的急性腎損傷[9]。然而AS 是否能通過調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)從而對(duì)膿毒血癥腎損傷發(fā)揮治療作用，目前還未見報(bào)道。

血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1, HO-1）是一種可以催化機(jī)體生產(chǎn)抗氧化劑的酶。 核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2）作為一種主要的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活HO-1 等下游抗氧化應(yīng)激因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)[10-11]。朱時(shí)玉等[12]通過建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，證實(shí)AS 能夠減少大鼠腎組織氧化應(yīng)激水平，對(duì)腎損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與激活Nrf2/HO-1通路相關(guān)。 據(jù)此，本研究探討AS 是否可通過Nrf2/HO-1 通路影響膿毒血癥氧化應(yīng)激反應(yīng)，觀察膿毒血癥大鼠接受不同濃度AS 干預(yù)后，腎臟的功能與氧化應(yīng)激水平的變化，以期進(jìn)一步闡明AS 在膿毒血癥治療中發(fā)揮的藥理作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只雄性SPF 級(jí)SD 大鼠購自上海Sippr BK動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2021-0002，安置在屏障環(huán)境中（溫度為20～25 ℃，濕度為50%～65%，光照12 h/d），以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)至10周齡，體質(zhì)量(220±30) g。 本實(shí)驗(yàn)符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求，倫理審批號(hào)為：PZ-HNSZYY-2021-015。

1.2 主要試劑與儀器

AS （上海現(xiàn)代制藥股份有限公司，批號(hào)：CY16830）；氨芐西林鈉（國藥集團(tuán)威奇達(dá)藥業(yè)有限公司，批號(hào)：ZY0769）；丙二醛（malonic dialdehyde, MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0131）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：S0109）、RIPA裂解液（批號(hào)：R0010）、BCA 試劑盒（批號(hào)：R00011）、HE 染色試劑盒（批號(hào)：R01007）均購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；GAPDH（批號(hào)：5511）、Nrf2（批號(hào)：7023）、HO-1（批號(hào)：2897）均購自美國Cell Signal公司。

全自動(dòng)生化分析儀（瑞士Roche 公司，型號(hào)：Cobas Integra 800）；自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Biotek Winooski 公司，型號(hào)：Bio-tekELX800）；蛋白電泳儀（型號(hào)：1659001）、半干轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：Trans-Blot SD）、Western blot 成像系統(tǒng)（型號(hào)：GS-900）均購于美國Bio-Rad 公司；低溫高速離心機(jī)（德國Eppendorf 公司，型號(hào)：Centrifuge 5424R）；輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（型號(hào)：RM2035）、烤片機(jī)（型號(hào)：HI1220）均購于德國Leica 公司；生物顯微鏡（日本Nikon 公司，型號(hào)：EclipseE200）。

1.3 動(dòng)物分組及建模

將所有大鼠標(biāo)號(hào)，隨機(jī)分為對(duì)照組（n=10）和膿毒血癥組（n=50）。 膿毒血癥組大鼠采用盲腸結(jié)扎法建立疾病模型：麻醉后以仰臥位固定大鼠于手術(shù)臺(tái)上，消毒，沿中線剪開腹腔，取出盲腸，1 號(hào)線結(jié)扎，16 號(hào)線穿刺針刺穿盲腸，溢出少量糞便后，將盲腸還納腹腔，縫合。 術(shù)后若大鼠蘇醒時(shí)間較對(duì)照組明顯延長，精神萎靡，活動(dòng)與飲食減少，則認(rèn)為建模成功[13]。對(duì)照組手術(shù)中無結(jié)扎和刺穿盲腸步驟。將膿毒血癥組隨機(jī)分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽性組，每組10 只大鼠。 手術(shù)后12 h，若大鼠蘇醒則開始灌胃給藥。 以ZHU 等[14]在用AS 治療糖尿病腎病大鼠模型中采用的劑量作為參考，將AS溶于生理鹽水配制為1.0、2.5、5.0 mg/mL 的藥液，分別給予低劑量組、中劑量組、高劑量組灌胃，對(duì)照組和模型組采用生理鹽水灌胃，灌胃劑量均為10 mL/kg，陽性組腹腔注射氨芐西林鈉200 mg/kg。

手術(shù)72 h 后，處置大鼠提取標(biāo)本。 若有提前死亡大鼠，記錄其生存時(shí)間并取樣用于后續(xù)檢測(cè)。

1.4 標(biāo)本收集

硫噴妥鈉40 mg/kg 靜脈注射處死大鼠。從腹主動(dòng)脈抽血于抗凝管中，3000 r/min，4 ℃離心15 min（離心半徑40 cm）制備血清，分裝標(biāo)記后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備用。 取部分新鮮腎組織，用生理鹽水清洗，部分用4%多聚甲醛固定，脫水、透明后石蠟包埋，制成3 μm 厚連續(xù)切片備用。 其余腎組織剪碎后置于蛋白裂解液中制備為勻漿液，3000 r/min，4 ℃離心20 min（離心半徑40 cm），收集上清，BCA 法提取總蛋白質(zhì)并測(cè)定蛋白質(zhì)含量，分裝標(biāo)記后儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱備用。

1.5 腎臟病理形態(tài)觀察

3 μm 厚連續(xù)切片經(jīng)過脫蠟、脫二甲苯處理，蘇木精染色2～3 min，鹽酸乙醇分化15 s，伊紅染色1 min，梯度脫水、透明后中性樹膠封片。 在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟的組織形態(tài)和病理變化。

1.6 Scr、BUN、MDA、SOD 水平測(cè)定

全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中血肌酣（serum creatinine, Scr）和尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）含量水平。 根據(jù)ELISA 試劑盒說明檢測(cè)MDA 和SOD值。

1.7 Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平測(cè)定

采用Western bolt 法檢測(cè)Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平。 解凍前期收集蛋白樣品，制備SDS-PAGE 凝膠。 將含有100 μg 蛋白質(zhì)的樣品加入凝膠孔，電泳、轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉4 h，TBST洗滌。 加入Nrf2、HO-1 一抗（均以1∶100 稀釋），4 ℃下孵育過夜。 TBST 洗滌后，將膜放入山羊抗小鼠二抗（以1∶1000 稀釋）中孵育1 h，TBST 清洗。 ECL顯影，Western blot 成像系統(tǒng)掃描拍攝，ImageJ 軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 所有變量均為連續(xù)型變量，以“±s”表示。 根據(jù)樣本量、數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布、方差是否齊選取統(tǒng)計(jì)方法。 Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)用于分析整體差異，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。 P＜0.05 認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AS 對(duì)膿毒血癥大鼠生存狀況的影響

對(duì)照組無大鼠死亡，平均生存時(shí)間為72 h。 與對(duì)照組比較，模型組、低劑量組大鼠平均生存時(shí)間減少（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組大鼠平均生存時(shí)間增加（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組大鼠平均生存時(shí)間增加（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組大鼠平均生存時(shí)間增加（P＜0.05）；高劑量組及陽性組大鼠平均生存時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖1。

圖1 各組大鼠平均生存時(shí)間比較

2.2 AS 對(duì)膿毒血癥大鼠腎臟病理形態(tài)的影響

光鏡下可見對(duì)照組大鼠腎組織未見明顯異常。模型組則出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，包括炎癥細(xì)胞在腎組織中大量浸潤，腎間質(zhì)充血水腫，腎小管擴(kuò)張，腎小球球囊黏連、系膜增生，表明模型建立成功。 而在AS 治療各組中，腎組織炎癥反應(yīng)較模型組均明顯減輕，并呈現(xiàn)劑量依賴性，高劑量組與陽性組組織形態(tài)趨于正常。 詳見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織病理變化（HE，×200）

2.3 AS 對(duì)膿毒血癥大鼠腎功能指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，模型組Scr 和BUN 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組Scr 和BUN 水平均明顯下降（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組Scr和BUN 水平均明顯下降（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組Scr、陽性組BUN 水平降低（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性組BUN 水平升高（P＜0.05）。 詳見圖3。

圖3 各組大鼠Scr、BUN 水平比較

2.4 AS 對(duì)膿毒血癥大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠MDA 水平升高、SOD 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組MDA 水平降低、SOD水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組MDA 水平降低、SOD 水平升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組MDA 水平降低、SOD 水平升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性組MDA 水平升高（P＜0.05）。 詳見圖4。

圖4 各組大鼠MDA、SOD 水平比較

2.5 AS 對(duì)膿毒血癥大鼠Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較，模型組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組及陽性組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組、高劑量組及陽性組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組及陽性組Nrf2 和HO-1蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與高劑量組比較，陽性組HO-1 蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。 詳見圖5。

圖5 各組大鼠Nrf2 和HO-1 蛋白相對(duì)灰度值的比較

3 討論

AS 作為傳統(tǒng)中藥的提純物，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)膿毒血癥的緩解作用[9]，然而其具體藥理機(jī)制尚未明確。 本文通過盲腸結(jié)扎法建立膿毒癥大鼠模型，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組生存時(shí)間更短，腎組織炎癥反應(yīng)明顯，腎功能下降，氧化應(yīng)激水平升高，表明模型建立成功。 AS 在中醫(yī)中被用于治療腎臟疾病，多項(xiàng)研究證實(shí)了AS 具有腎臟保護(hù)作用[9，12，15]。本文結(jié)果顯示，經(jīng)AS 治療后，膿毒血癥大鼠的生存時(shí)間延長，HE 染色可見腎組織炎癥反應(yīng)減輕，Scr和BUN 水平均下降。上述結(jié)果表明腎功能以及疾病整體狀況得到了改善，AS 可以保護(hù)膿毒血癥大鼠腎功能，然而目前對(duì)于AS 治療腎臟疾病的機(jī)制仍不明確。

本研究選取了MDA 和SOD 作為氧化應(yīng)激水平的衡量標(biāo)志。MDA 屬于脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終末產(chǎn)物之一，是體內(nèi)重要的氧化應(yīng)激監(jiān)控指標(biāo)，其含量與機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16]。 SOD 是一種具有抗氧化功能的金屬酶，可催化超氧化物陰離子的歧化反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激損傷[17]。 本研究中，AS 治療各組與模型組相比，MDA 水平明顯下降，而SOD 水平上升，說明AS 具有抑制大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。

進(jìn)一步研究機(jī)制發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠Nrf2 與HO-1蛋白表達(dá)水平均較對(duì)照組更低，而AS 治療可逆轉(zhuǎn)此降低趨勢(shì)，升高Nrf2 與HO-1 蛋白表達(dá)水平。 這可能是AS 抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)的機(jī)制。Nrf2/HO-1 通路是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激通路，Nrf2 激活后，誘導(dǎo)HO-1 產(chǎn)生，催化血紅素降解成一氧化碳和亞鐵，后者具有抗氧化、抗炎作用，可抑制和拮抗氧化應(yīng)激反應(yīng)。 另外，Nrf2 還可以增加SOD 等抗氧化劑的表達(dá)，減輕機(jī)體氧化反應(yīng)[10-11]。 在多種腎臟損傷模型中，通過激活Nrf2/HO-1 通路抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)均取得了一定的治療效果[18-20]。 在小鼠的腎缺血再灌注損傷模型中，茯苓酸可降低MDA 和環(huán)氧合酶2的水平，增加谷胱甘肽等一系列抗氧化因子的表達(dá)，發(fā)揮腎損傷保護(hù)作用，其原理被認(rèn)為和直接或間接激活Nrf2，上調(diào)下游GPX4、SLC7A11 和HO-1 的表達(dá)有關(guān)[18]。劉華[19]、王文文[20]等也利用不同的藥物干預(yù)缺血再灌注腎損傷模型，證明藥物可通過Nrf2/HO-1通路緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善缺血再灌注造成的腎損傷。 此外，在葉酸誘導(dǎo)的腎損傷模型[21]、草酸鈣腎結(jié)石模型中[22]，Nrf2/HO-1 的激活可以有效降低機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激指標(biāo)含量。與本研究膿毒血癥模型中，AS 通過Nrf2/HO-1 抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)相互印證。

本研究結(jié)果顯示，不同濃度AS 的療效呈現(xiàn)劑量依賴性，其中，高劑量組與模型組對(duì)比療效最為明顯。 此外，高劑量組大鼠BUN 和MDA 水平較陽性組更低，HO-1 蛋白表達(dá)水平較陽性組更高，其余指標(biāo)與陽性組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 表明AS 對(duì)腎臟的保護(hù)作用與氧化應(yīng)激反應(yīng)的抑制作用隨劑量升高而增強(qiáng)，且較抗生素治療有一定的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，AS 可能通過Nrf2/HO-1 通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善膿毒血癥大鼠的癥狀，延緩疾病進(jìn)展，其作用呈現(xiàn)劑量依賴性，可能的機(jī)制與AS 上調(diào)Nrf2/HO-1 通路有關(guān)。