V-ATPase H表達(dá)量下調(diào)增強(qiáng)棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性

李 品, 姚 雪, 李舜佳, 楊飛帆, 孫瑩瑩,劉曉光, 魏紀(jì)珍, 安世恒

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,河南省害蟲綠色防控國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002)

棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)(Lepidoptera: Noctuidae)是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲,它為害棉花、玉米、小麥、大豆、花生和蔬菜等許多作物[1-2]。目前防治棉鈴蟲的主要手段是種植轉(zhuǎn)蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因作物。然而大面積地種植轉(zhuǎn)Bt基因棉花加劇了棉鈴蟲對Bt蛋白的抗性問題[3]。為了更好地利用Bt轉(zhuǎn)基因技術(shù)防治棉鈴蟲,需要對Bt蛋白的作用機(jī)制和棉鈴蟲的抗性機(jī)制進(jìn)行深入研究。

目前我國種植的轉(zhuǎn)Bt殺蟲蛋白基因的棉花表達(dá)的是CryAc蛋白。已鑒定的Cry1A類蛋白受體主要有鈣黏蛋白(cadherin, CAD)、氨肽酶N(aminopeptidase N, APN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP binding cassette transports),這些受體的變異也是昆蟲對Cry1A類蛋白產(chǎn)生抗性的主要原因[4]。這些研究豐富了我們對Cry1A類蛋白殺蟲機(jī)制及昆蟲對Cry1A類蛋白的抗性機(jī)制的理解,但是還不能完全解釋Cry1A類蛋白的作用機(jī)制及昆蟲對Cry1A類蛋白的抗性機(jī)制。目前報(bào)道一些液泡型H+-ATP酶(vacuolar H+-ATPase, V-ATPase)的亞基蛋白可以與Cry蛋白結(jié)合。例如Chen等[5]通過雙向電泳分離棉鈴蟲中腸BBMV(brush border membrane vesicles)蛋白,然后通過配體印跡(ligand blot)和質(zhì)譜檢測鑒定到V-ATPase蛋白是Cry1Ac蛋白的結(jié)合蛋白。鄒朗云[6]通過ligand blot證實(shí)棉鈴蟲的V-ATPase B可以與Cry1Ac,Cry2Ab和Cry1C結(jié)合。關(guān)于V-ATPase亞基蛋白與棉鈴蟲對Cry蛋白的敏感性的關(guān)系還未見報(bào)道。

V-ATPase存在于許多細(xì)胞內(nèi)腔室中,包括核內(nèi)體,溶酶體膜等,它參與細(xì)胞質(zhì)pH的調(diào)節(jié)[7]。V-ATPase是由14個(gè)亞基組成的多蛋白復(fù)合體,形成兩個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域,參與質(zhì)子跨膜易位的跨膜結(jié)構(gòu)域(V0)[8-11]和負(fù)責(zé)ATP水解的可溶性催化結(jié)構(gòu)域(V1)[12]。V0由a、c、c′、c″、d和 e共6個(gè)亞基組成,主要功能是形成允許質(zhì)子跨膜通過的孔[13]。V1由A、B、C、D、E、F、G和H 8個(gè)亞基組成,主要功能是參與ATP的水解[14]。前期我們通過轉(zhuǎn)錄組測序和數(shù)字基因表達(dá)譜(digital gene expression profiling,DGE)分析了不同Cry1Ac抗性棉鈴蟲品系的差異基因,發(fā)現(xiàn)V-ATPaseH在抗性棉鈴蟲種群中普遍低表達(dá)[15]。因此我們推測V-ATPase H可能是Bt殺蟲蛋白的一個(gè)靶標(biāo)。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)測定了該基因在Cry1Ac抗性和敏感品系棉鈴蟲幼蟲中腸中及敏感棉鈴蟲受到Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)情況;通過在昆蟲Sf9細(xì)胞中過表達(dá)該基因確定該基因的表達(dá)分布,并通過細(xì)胞毒力試驗(yàn)檢測其對Cry1Ac毒力的影響。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究V-ATPase H的作用方式和在抗性機(jī)制中的作用,以及昆蟲對Bt殺蟲蛋白的抗性治理等提供重要線索。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

棉鈴蟲敏感品系(JY)購于河南省濟(jì)源白云實(shí)業(yè)有限公司;抗性品系(LF60)為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所梁革梅研究員饋贈(zèng)。Cry1Ac原蛋白購自北京諾思特生物科技有限公司,經(jīng)胰蛋白酶活化[16]獲得活化的Cry1Ac蛋白。LF60對Cry1Ac原蛋白的抗性倍數(shù)約1 000倍[15],它是由1998年采自河北廊坊田間的野生型棉鈴蟲敏感種群,在室內(nèi)經(jīng)Cry1Ac原蛋白梯度篩選77代后,使用60 μg/mL Cry1Ac原蛋白穩(wěn)定飼養(yǎng)的抗性種群[15,17]。兩種棉鈴蟲品系均在培養(yǎng)箱內(nèi)使用人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng),培養(yǎng)條件為溫度(27±1)℃、相對濕度為(75±10)%、光周期L∥D=16 h∥8 h[18]。

1.2 昆蟲細(xì)胞系

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda卵母細(xì)胞系(Sf9 cell line)由亞利桑那大學(xué)李顯春教授饋贈(zèng),用含10%熱激失活牛血清(fetal bovine serum,FBS)(圣路易斯,美國)和0.5%青霉素-鏈霉素(Gibco,紐約,美國)的Sf-900TMⅡ SFM(1×)培養(yǎng)基(Gibco,紐約,美國)于(28±1)℃的生化培養(yǎng)箱(型號(hào):SHP-250,上海,中國)中傳代培養(yǎng)[16]。

1.3 棉鈴蟲V-ATPase H基因在不同品系中的表達(dá)量測定

分別選取齡期和大小一致的抗、感品系的棉鈴蟲,收集其3～5齡幼蟲各5～10頭。將棉鈴蟲幼蟲置于冰上10 min后解剖出全部的中腸組織,在生理鹽水中去除圍食膜及食物殘?jiān)?沖洗干凈,迅速放入液氮中備用。每組樣品均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。待樣品準(zhǔn)備完畢,使用RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(諾唯贊,南京,中國)提取中腸組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

采用雙內(nèi)參法,內(nèi)參基因分別為EF-1α(U20129.1)和β-actin(HM629442.1)。引物(表1)由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL):10 μmol/L qV-ATPase H上、下游引物或10 μmol/LEF-1α上、下游引物或10 μmol/Lβ-actin上、下游引物各0.4 μL，2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。反應(yīng)程序:95℃ 2 min;95℃ 15 s,56℃ 15 s,68℃ 20 s,38個(gè)循環(huán)(ABI 7500 Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,Eppendorf,漢堡,德國)。相對表達(dá)量的計(jì)算采用雙內(nèi)參的計(jì)算方法,公式如下[19]。得到表達(dá)量后,以對照為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行歸一化作圖。

表1 本研究所用引物

式中E為擴(kuò)增效率。

1.4 幼蟲取食Cry1Ac蛋白后其中腸V-ATPase H的表達(dá)測定

選取大小一致的4齡末期敏感品系棉鈴蟲,置于24孔養(yǎng)蟲盒中,每孔1頭,饑餓處理12 h后,進(jìn)入5齡期。然后用含25 μg/mL Cry1Ac原蛋白(大約LC30濃度)的人工飼料[20]飼喂饑餓后的5齡幼蟲,對照組為飼喂含50 mmol/L Na2CO3緩沖液(溶解Cry1Ac,作為緩沖對照,調(diào)節(jié)Cry1Ac處理的死亡率)。分別取4～5頭棉鈴蟲樣品,解剖取其中腸,每組樣品均進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。中腸的解剖、RNA的提取、cDNA的合成和qRT-PCR見1.3。

1.5 棉鈴蟲V-ATPase H的亞細(xì)胞示蹤定位

以棉鈴蟲cDNA為模板,利用V-ATPaseH基因的特異性引物[12](表1)在Mastercycle Pro S型PCR儀中完成V-ATPaseH基因編碼區(qū)(sequence coding for amino acids in protein,CDS)的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50 μL):Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、2×Phanta Max Buffer 25 μL、cDNA 1 μL、dNTP Mix 1 μL、10 μmol/L V-ATPase H CDS上、下游引物各2 μL和ddH2O 18 μL。PCR程序?yàn)?5℃ 3 min;95℃ 15 s,55℃ 20 s,72℃ 1 min 50 s,38個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。使用PCR產(chǎn)物回收試劑盒(諾唯贊,南京,中國)純化PCR產(chǎn)物,然后將其連接到克隆載體上得到ZT-4-V-ATPase H。

以克隆載體為模板,利用特異性引物V-ATPase H-SacⅠ-F和V-ATPase H-BglⅡ-R擴(kuò)增V-ATPaseH基因編碼區(qū)。PCR反應(yīng)體系(50 μL):ddH2O 18 μL、10 μmol/L V-ATPase H Sac Ⅰ-F和10 μmol/L V-ATPase H Bgl Ⅱ-R各2 μL、dNTP Mix 1 μL、ZT-4-V-ATPase H質(zhì)粒模板1 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL和2×Phanta Max Buffer 25 μL。PCR擴(kuò)增條件:95℃ 3 min;95℃ 15 s, 58℃ 20 s, 72℃ 1 min 30 s, 35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物純化后將片段連接至表達(dá)載體GFP-pIEx(His標(biāo)簽的pIEx-GFP載體為山東大學(xué)趙小凡老師饋贈(zèng))。

將9 ×105個(gè)Sf9細(xì)胞平鋪于12孔板內(nèi),于(28±1)℃黑暗靜置培養(yǎng)過夜,使細(xì)胞充分貼壁。配制A、B與C液。A液為無血清和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基,B液為A液中加入2 μg V-ATPase H-GFP-pIEx質(zhì)粒,C液為A液中加入8 μL轉(zhuǎn)染試劑。用1 mL A液清洗細(xì)胞,去除血清和抗生素后,把100 μL C液滴到100 μL B液中,最后將B和C液的混合液滴加到細(xì)胞中,培養(yǎng)箱中孵育5 h;用A液清洗細(xì)胞,去除血清和抗生素后,加入1.5 mL含10%熱激失活牛血清和0.5%青霉素-鏈霉素抗生素的Sf-900TMⅡ SFM(1×)無血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,熒光顯微鏡(萊卡顯微系統(tǒng)公司,上海,中國)下拍照。

1.6 Cry1Ac對表達(dá)V-ATPase H細(xì)胞的毒力測定

將上一步拍照的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至48 h,記錄存活細(xì)胞數(shù)量。加入含有已活化的200 μg/mL Cry1Ac蛋白處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,于(28±1)℃培養(yǎng)箱中處理4 h,記錄經(jīng)過Cry1Ac蛋白處理后的存活細(xì)胞數(shù)量。具體毒力測定方法參考文獻(xiàn)[21]。運(yùn)用Abbott公式[22]計(jì)算細(xì)胞死亡率,死亡率=(處理前的細(xì)胞數(shù)量-處理后的細(xì)胞數(shù)量)/處理前的細(xì)胞數(shù)量× 100%。

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞至1.5 mL離心管中,離心后,用1 mL 1× PBS緩沖液重懸沉淀2次,再次離心并保留沉淀,加入高效RIPA裂解液、終濃度為1 mmol/L PMSF、5× 蛋白上樣緩沖液并混勻,煮沸5 min,離心后放置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

SDS-PAGE(SDS-PAGE凝膠試劑盒,中暉赫彩,陜西,中國)電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上;5% BSA 4℃封閉過夜;加入1∶1 000稀釋的鼠抗His-Tag單克隆抗體(一抗),室溫孵育1 h,清洗。加入1∶10 000稀釋的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(二抗)(一抗與二抗,亞科因,武漢,中國),室溫孵育1 h,清洗。在Tanon4600化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(天能,上海,中國)中拍照確定V-ATPase H蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用DPS 7.05軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖1中敏感品系(JY)與抗性品系(LF60)(在進(jìn)行方差分析時(shí),先進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換)之間的差異顯著性、圖2中同一時(shí)間點(diǎn)對照組與處理組(在進(jìn)行方差分析時(shí),先進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換)之間的差異顯著性以及圖4中細(xì)胞死亡率(在進(jìn)行方差分析時(shí),先進(jìn)行平方根轉(zhuǎn)換)之間的差異顯著性均采用t測驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 V-ATPase H基因在Cry1Ac抗、感棉鈴蟲品系中的表達(dá)差異

熒光定量PCR檢測結(jié)果表明,V-ATPaseH基因在3、4齡和5齡棉鈴蟲幼蟲中腸組織中均有表達(dá),在敏感品系3齡幼蟲的中腸中相對表達(dá)量最高(圖1)。與敏感品系JY相比,抗性品系LF60的3、4齡和5齡棉鈴蟲幼蟲mRNA的相對表達(dá)量明顯降低(3齡:F= 199.81,df= 5,P= 0.000 1;4齡:F= 22.54,df= 5,P= 0.009; 5齡:F= 28.66,df= 5,P= 0.005 9)(圖1)。

2.2 敏感棉鈴蟲取食Cry1Ac后V-ATPase H的轉(zhuǎn)錄水平降低

JY品系棉鈴蟲5齡幼蟲持續(xù)取食含LC30劑量Cry1Ac原蛋白的人工飼料3～24 h后,與對照相比中腸組織內(nèi)V-ATPaseH的轉(zhuǎn)錄水平顯著下降,但36 h時(shí)無顯著差異(3 h:F= 137.17,df=5,P= 0.000 3; 6 h:F= 96.47,df=5,P= 0.000 6; 12 h:F= 8.40,df=5,P= 0.044 2;24 h:F= 326.01,df=5,P= 0.000 1; 36 h:F= 0.69,df=5,P=0.451 1)(圖2)。

圖2 取食Cry1Ac蛋白對棉鈴蟲5齡幼蟲中腸中V-ATPase H基因表達(dá)量的影響

2.3 V-ATPase H的亞細(xì)胞分布

用GFP-pIEx和V-ATPase H-GFP-pIEx質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞,熒光顯微鏡下能觀察到綠色熒光,說明相應(yīng)蛋白已經(jīng)成功在細(xì)胞中表達(dá),通過觀察可知V-ATPase H在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)(圖3)。

圖3 V-ATPase H在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和分布

2.4 表達(dá)V-ATPase H蛋白增強(qiáng)了Cry1Ac對細(xì)胞的毒力

利用Western blot證實(shí)棉鈴蟲V-ATPase H蛋白能在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖4a)。使用終濃度為200 μg/mL Cry1Ac活化蛋白處理表達(dá)了棉鈴蟲V-ATPase H的Sf9細(xì)胞,Sf9細(xì)胞的死亡率提高了30.2%(P= 0.000 1,F= 208.81,df=5,圖4b)。表明過表達(dá)V-ATPase H增強(qiáng)了細(xì)胞對Cry1Ac的敏感性。

圖4 過表達(dá)V-ATPase H對Cry1Ac細(xì)胞毒性的影響

3 結(jié)論與討論

本課題組前期通過轉(zhuǎn)錄組測序和DGE分析了不同抗Cry1Ac棉鈴蟲品系與敏感品系之間的差異基因,發(fā)現(xiàn)V-ATPaseH基因在抗性種群中普遍低表達(dá)[15]。本研究通過熒光定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了抗性棉鈴蟲品系中V-ATPase H表達(dá)量降低(圖1),這與其他V-ATPase亞基基因(V-ATPaseB基因)在Cry1Ac抗性棉鈴蟲品系中表達(dá)量顯著降低的結(jié)果一致[6,23]。此外,V-ATPase亞基基因被報(bào)道在棉鈴蟲和甜菜夜蛾中通過改變其表達(dá)量影響B(tài)t蛋白的毒力[23-24], 因此推測V-ATPase H可能通過降低表達(dá)來增強(qiáng)棉鈴蟲對Cry1Ac的抗性。

為了進(jìn)一步探索V-ATPase H在Cry1Ac毒力和棉鈴蟲抗性中的作用,本研究通過熒光定量PCR檢測了敏感棉鈴蟲受到Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí),V-ATPaseH基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明在受到Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí),棉鈴蟲V-ATPaseH基因的表達(dá)量顯著降低(圖2),在類似的V-ATPase眾多亞基中,如V-ATPaseA等受到Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量顯著降低[15，25-26]。這說明V-ATPaseH基因可能與其他V-ATPase眾多亞基一樣在受到Cry1Ac脅迫時(shí)通過降低表達(dá)來增加對Cry1Ac的耐受性。

此外,V-ATPase亞基蛋白作為Bt蛋白受體的研究也有報(bào)道。例如,甜菜夜蛾SpodopteraexiguaV-ATPase B是Cry2Aa的功能受體,RNA干擾(RNA interference,RNAi)V-ATPaseB能顯著降低甜菜夜蛾對Cry2Aa的敏感性[24]。敲除二化螟Chilosuppressalis幼蟲的V-ATPaseA基因會(huì)導(dǎo)致二化螟幼蟲對表達(dá)Cry2Aa和Cry1Ca水稻的敏感性顯著降低[27]。為了進(jìn)一步證實(shí)V-ATPase H在Cry1Ac毒力中的功能。本研究通過在Sf9細(xì)胞內(nèi)表達(dá)V-ATPase H,然后進(jìn)行細(xì)胞毒力測定,結(jié)果表明在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)V-ATPase H會(huì)增加Cry1Ac對細(xì)胞的毒力(圖4),這種現(xiàn)象與之前報(bào)道的在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)ATP合酶α亞基會(huì)增加Cry2Ab對細(xì)胞的毒力[28],以及在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)APN1和ALP2會(huì)增強(qiáng)Cry1Ac 對細(xì)胞的毒力結(jié)果類似[21,29]。

本研究首次報(bào)道了棉鈴蟲V-ATPase H參與了Cry1Ac對棉鈴蟲毒力及棉鈴蟲對Cry1Ac抗性形成。然而值得注意的是V-ATPase H與V-ATPase其他亞基的分布一致,主要分布在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器膜上[30],甚至在細(xì)胞核內(nèi)也有分布(圖3)。這與常見的Bt蛋白受體分布于細(xì)胞膜上的情況不同。V-ATPase H如何參與到Cry1Ac的毒力過程還有待進(jìn)一步的研究。