廣東省羊源肺炎克雷伯菌遺傳進(jìn)化與毒力基因及耐藥性分析

張凱川，王晉宇，李守軍，賈 坤*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣東省獸醫(yī)臨床重大疾病綜合防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510642；3.廣東省寵物工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia)是腸桿菌科克雷伯菌屬的一種常見(jiàn)的條件性致病菌[1-2]，存在于人和動(dòng)物的腸道和呼吸道，可引起肺炎、支氣管炎、泌尿道系統(tǒng)和創(chuàng)傷的感染，甚至腦膜炎、腹膜炎和敗血癥等[3]。近年來(lái)，肺炎克雷伯菌引起的動(dòng)物群體性細(xì)菌性感染的疾病不斷增多[4-6]。此外，由于抗菌藥物的廣泛使用，導(dǎo)致該菌對(duì)多種抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性，從而使該菌所致疾病的預(yù)防和治療難度增大，因而其發(fā)病率和死亡率均明顯升高[7]，給養(yǎng)殖業(yè)造成的損失亦日趨嚴(yán)重。

羊感染肺炎克雷伯菌主要引起肺炎以及上呼吸道感染等，有些病羊表現(xiàn)為流鼻涕、咳嗽和呼吸急促等癥狀[8]。由于肺炎克雷伯菌病死率較高，會(huì)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失，因此對(duì)它的關(guān)注日漸增加，羊感染肺炎克雷伯菌的報(bào)道也越來(lái)越多。本試驗(yàn)從廣東省各個(gè)羊場(chǎng)采集了150份有呼吸道疾病羊的樣品，利用PCR方法分離鑒定出肺炎克雷伯菌，并對(duì)其進(jìn)行了毒力、耐藥基因和ERIC-PCR基因分析，為羊源肺炎克雷伯菌的更深入研究奠定了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為廣東羊場(chǎng)的臨床用藥提供了參考。

1 材料與方法

1.1 病料采集

采集廣東省3個(gè)不同市羊場(chǎng)的150份患呼吸道疾病病羊鼻拭子樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基均購(gòu)自青島海博試劑有限公司，DL2000 Marker、ExTaqDNA聚合酶均購(gòu)自TaKaRa公司；革蘭氏染色試劑、藥敏紙片均購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；DL2000 DNA Marker、100 bp DNA Ladder(Dye Plus)、Premix Taq (Ex Taq version 2.0 plus dye) 等購(gòu)自寶生物(大連)工程有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將采集的150份鼻拭子樣品分別接種于LB瓊脂平板上，37 ℃需氧培養(yǎng)24 h后進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.4 染色鏡檢

挑取純化后的單菌落，按常規(guī)方法進(jìn)行革蘭染色，觀察菌體形態(tài)。

1.5 PCR鑒定肺炎克雷伯菌

根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)菌DNA。肺炎克雷伯菌特異性(khe溶血酵素基因[9])引物序列如下：5′-ATGAAACGACCTGATTGCATTCGC-3′；5′-TTACTTTTTCCGCGGCTTACCGTC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段長(zhǎng)度496 bp。擴(kuò)增體系(25 μL)：2×Taq Mix Buffer 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8.5 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min， 55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，電泳時(shí)間為45 min，電壓90V，電泳結(jié)束采用凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.6 藥敏試驗(yàn)

依據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI)手冊(cè)對(duì)包括頭孢菌素類、大環(huán)內(nèi)酯類等在內(nèi)的21種常用抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[10]，測(cè)定分離菌對(duì)抗菌藥物的抑菌圈直徑，判定分離菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。

1.7 肺炎克雷伯菌毒力基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[11,12]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的毒力基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1)。分別擴(kuò)增分離菌的相關(guān)毒力基因。反應(yīng)體系為25 μL：上、下游引物各1 μL，基因組DNA 2 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，Tm(50～58 ℃)45 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)后；72 ℃延伸10 min。

表1 肺炎克雷伯菌毒力基因引物序列Table 1 Virulence gene sequence of Klebsiella pneumoniae

1.8 肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[13,14]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的耐藥基因相關(guān)序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表2),以提取的細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行耐藥基因PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq PCR StarMix 10 μL、上下游引物各1 μL、模板2 μL，剩余用ddH2O補(bǔ)齊。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，相應(yīng)Tm30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。

表2 肺炎克雷伯菌耐藥基因序列Table 2 Klebsiella pneumoniae resistance gene sequence

1.9 肺炎克雷伯菌ERIC-PCR分型

1.9.1 引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)[15]，并根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)公布的ERIC-PCR相關(guān)序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物，引物序列如下：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′，引物由天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.9.2 ERIC-PCR擴(kuò)增 以提取細(xì)菌基因組DNA為模板，進(jìn)行ERIC-PCR擴(kuò)增，采用20 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR StarMix 10 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性45 s，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min;4 ℃保存，PCR產(chǎn)物通過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.9.3 ERIC-PCR聚類圖譜分析 ERIC-PCR電泳圖譜首先采用 Quantity One(Bio-Rad，USA)軟件進(jìn)行擴(kuò)增條帶分析，識(shí)別結(jié)果記錄方法：針對(duì)某一條帶，軟件自動(dòng)識(shí)別后“有”記作“1”，“無(wú)”記作“0”，并輔助相應(yīng)的人工校對(duì)；再采用NTSYSpc 2.1軟件計(jì)算得到遺傳相似性系數(shù)矩陣和遺傳距離矩陣，隨后利用遺傳距離矩陣采用非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法對(duì)分離株進(jìn)行遺傳聚類分析；最后根據(jù)聚類結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，比較不同來(lái)源菌株間的親緣關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 肺炎克雷伯菌分離鑒定

本試驗(yàn)通過(guò)革蘭染色及PCR鑒定的方法，在150份樣品中共分離出42株肺炎克雷伯菌，總分離率為28%(42/150)，該菌在LB固體培養(yǎng)基上呈現(xiàn)白色不透明型菌落，其邊緣光滑，中央略微突起(圖1)。

圖1 肺炎克雷伯菌在LB固體平板上的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of Klebsiella pneumoniae on LB plate

革蘭染色鏡檢結(jié)果如圖2A顯示，該菌呈現(xiàn)紅色，形態(tài)表現(xiàn)為較短粗的桿菌，單獨(dú)、成雙或短鏈狀排列，無(wú)芽孢和鞭毛。PCR結(jié)果顯示(圖2B)，擴(kuò)增條帶大小為496 bp，分離得到細(xì)菌均攜帶溶血酵素基因khe，鑒定為肺炎克雷伯菌。

A.革蘭染色結(jié)果(1 000×)；B. 部分菌株P(guān)CR鑒定(M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～12. 肺炎克雷伯菌分離菌kp1、kp7、kp13、kp15、kp194-7、kp17-13、kp131、kp268、kp2、kp11、kp6、kp9；N. 陰性對(duì)照)A. Gram-negative staining results (1 000×); B. PCR identification results of some isolates (M. DL2000 DNA marker; 1-12. Klebsiella pneumonia: kp1, kp7, kp13, kp15, kp194-7, kp17-13, kp131, kp268, kp2, kp11, kp6, kp9; N. Negative control)圖2 肺炎克雷伯菌分離株的鑒定Fig.2 Identification results of Klebsiella pneumonia isolates

2.2 藥敏試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)42株肺炎克雷伯菌進(jìn)行21種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，肺炎克雷伯菌分離株對(duì)其中16種抗生素有不同程度的耐藥性，對(duì)阿莫西林、氧氟沙星、青霉素等耐藥率達(dá)100%，對(duì)恩諾沙星、阿奇霉素耐藥率達(dá)30%以上，而對(duì)頭孢吡肟、復(fù)方新諾明、氨芐西林/舒巴坦的敏感性達(dá)100%，具體詳見(jiàn)圖3。

1.頭孢吡肟；2.頭孢曲松；3.頭孢呋辛；4.阿莫西林；5.氨芐西林/舒巴坦；6.氯霉素；7.復(fù)方新諾明；8.慶大霉素；9.多黏菌素B；10.四環(huán)素；11.美羅培南；12.苯唑西林；13.阿米卡星；14.諾氟沙星；15.強(qiáng)力霉素；16.青霉素G；17.環(huán)丙沙星；18.恩諾沙星；19.阿奇霉素；20.麥迪霉素；21.氧氟沙星1. Cefepime; 2. Ceftriaxone; 3. Cefuroxime; 4. Amoxicillin; 5. Ampicillin/sulbactam; 6. Chloramphenicol; 7. Complex sulfamethoxazole; 8. Gentamycin; 9. Polymyxin B; 10. Tetracyclin; 11. Meropenem; 12. Oxacillin; 13. Amikacin; 14. Norfloxacin; 15. Doxycycline; 16. Penicillin G; 17. Ciprofloxacin; 18. Enrofloxacin; 19. Azithromycin; 20. Medemcyin; 21. Ofloxacin圖3 肺炎克雷伯菌藥敏結(jié)果Fig.3 Drug sensitivity of Klebsiella pneumoniae

2.3 毒力基因檢測(cè)

采用PCR方法對(duì)肺炎克雷伯菌12種毒力基因rmpA、aerobactin、alls、kfuBC、wcaG、iucB、iroNB、ureA、wabG、uge、fim、ybtA進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)到10種毒力基因，其中，黏液表型基因rmpA、Fe3+攝取基因kfuBC與細(xì)菌尿素酶基因ureA檢出率均>80%，分別為88.0%和85.7%、83.3%，而iroNB和ybtA沒(méi)有被檢出，這表明ureA、rmpA、kfuBC毒力基因在廣東地區(qū)感染肺炎克雷伯菌中占主導(dǎo)地位。

2.4 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

采用PCR的檢測(cè)方法對(duì)42株肺炎克雷伯菌分離株進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果顯示，42株肺炎克雷伯菌分離株均可檢測(cè)出多種耐藥基因，其中，氨基糖苷類耐藥基因aphA、aacC4、aacC2的檢出率分別為42.9%(18/42)、28.6%(12/42)、23.8%(10/42)，喹諾酮類耐藥基因qnrA的檢出率為40.5%(17/42)，β-內(nèi)酰胺類耐藥基因SHV的檢出率為35.7%(15/42)，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermC的檢出率為16.7%(7/42)，而磺胺類以及碳青霉烯類的耐藥基因未被檢出，分離所得的肺炎克雷伯菌均含有2種及2種以上的耐藥基因。

2.5 ERIC-PCR分型結(jié)果

采用ERIC-PCR對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型，42株肺炎克雷伯菌ERIC-PCR分型結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，運(yùn)用ERIC-PCR法能擴(kuò)增出較為清晰的ERIC圖譜，每個(gè)分離株的ERIC條帶大小均為100～4 000 bp，擴(kuò)增條帶數(shù)為5～8。

M. DL5000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～20. 肺炎克雷伯菌分離菌；N. 陰性對(duì)照M. DL5000 DNA marker; 1-20. Klebsiella pneumonia isolates; N. Negative control圖4 部分肺炎克雷伯菌ERIC-PCR電泳圖Fig.4 ERIC-PCR electrophoresis of part of Klebsiella pneumonia

運(yùn)用NTSYSpc2.1軟件對(duì)上述ERIC電泳圖譜進(jìn)行聚類分析，使用非加權(quán)配對(duì)平均法 (UPGMA)計(jì)算得到聚類樹狀圖(圖5)，從圖中可以看到42株肺炎克雷伯菌具有較高的相似性，根據(jù)聚類圖譜親緣遠(yuǎn)近關(guān)系，當(dāng)相似值處于80.0%以上,可認(rèn)定為同一類群，結(jié)果顯示，42株肺炎克雷伯菌分離株可分為7個(gè)不同的類群(表3)，其中，遺傳多樣性優(yōu)勢(shì)群為群體Ⅰ，菌株所占比例為66.6%.

圖5 42株肺炎克雷伯菌的ERIC-PCR聚類圖Fig.5 ERIC-PCR clustering of 42 strains of Klebsiella pneumoniae

表3 42株肺炎克雷伯菌菌的ERIC-PCR聚類分析表Table 3 ERIC-PCR cluster analysis of 42 strains of Klebsiella pneumoniae

3 討 論

肺炎克雷伯菌是常見(jiàn)的條件致病菌，易感染人和動(dòng)物，而且廣泛分布于動(dòng)物的呼吸道及腸道中，發(fā)病死亡率高，給防治增加了一定的難度，感染率僅次于大腸桿菌，必須要嚴(yán)加控制[16]。在2018年，新疆曾報(bào)道1例綿羊感染肺炎克雷伯菌，同時(shí)做了部分生物學(xué)特性研究[17]。2019年，朱利霞等[18]以肺炎克雷伯菌流行病學(xué)，耐藥現(xiàn)狀等方面進(jìn)行綜述。隨后，2020年對(duì)內(nèi)蒙古通遼市一羊場(chǎng)的病死羊進(jìn)行采樣，分離鑒定得出致死菌株是肺炎克雷伯菌，并且發(fā)現(xiàn)菌株出現(xiàn)耐藥情況[19]。而在廣東省有關(guān)羊源肺炎克雷伯菌的報(bào)道不是很多，本研究從廣東不同規(guī)模化的羊場(chǎng)采集150份呼吸道樣品，共分離到42株肺炎克雷伯菌分離株，具有較高分離率。王哲紅[20]從新疆地區(qū)495份牛鼻拭子樣品中分離得到60株肺炎克雷伯菌，分離率為11.95%。貢嘎等[21]從西藏地區(qū)109份牦牛呼吸道樣品中分離得到8株肺炎克雷伯菌分離株，分離率為7.76%。表明在不同省市由于南北氣候環(huán)境以及飼養(yǎng)管理模式的不同，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌分離率具有較大差異。

由于抗生素的大范圍使用以及抗感染治療手法的單一，導(dǎo)致肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性，給養(yǎng)殖業(yè)造成的損失亦日趨嚴(yán)重，尤其是超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended Spectrum β-lactamases，ESBLs)和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌(Carbapenem resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)的出現(xiàn)增加了對(duì)肺炎克雷伯菌感染的難度，此外本次分離出的42株肺炎克雷伯菌對(duì)多種抗生素耐藥，其中，阿莫西林、苯唑西林及氧氟沙星耐藥率高達(dá)100%，相對(duì)的頭孢吡肟和氨芐西林舒巴坦類藥物的敏感性達(dá)100%，其余藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥性，可以采用β-內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦、三唑巴坦進(jìn)行預(yù)防控制。耐藥基因檢測(cè)結(jié)果顯示，分離株對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類以及β-內(nèi)酰胺類耐藥基因SHV的檢出率都處于較高水平，其余耐藥基因檢出率較低甚至零檢出，表明對(duì)氨基糖苷類、氟喹諾酮類以及β-內(nèi)酰胺類抗生素呈現(xiàn)不同程度的耐藥，與慶大霉素、氧氟沙星以及阿莫西林的藥敏結(jié)果一致。王林峰和王選錠[22]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)SHV-1型酶的肺炎克雷伯氏菌菌株對(duì)阿莫西林耐藥，對(duì)替卡西林和哌拉西林的敏感性降低，但對(duì)頭孢菌素類抗生素敏感，本次研究結(jié)果顯示，SHV基因檢出率為35.7%，且分離株對(duì)阿莫西林耐藥，對(duì)頭孢菌素類抗生素敏感，與上述試驗(yàn)結(jié)果相符。

本研究對(duì)分離到的42株肺炎克雷伯菌，檢測(cè)12種常見(jiàn)的毒力基因，毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，rmpA基因的檢出率為88.0%，表明所分離到的肺炎克雷伯菌菌體可表達(dá)莢膜多糖，莢膜多糖是肺炎克雷伯菌最重要最基本的毒力因子之一[23]。rmpA基因存在于毒力菌株的大質(zhì)粒上，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)菌莢膜的合成，增強(qiáng)細(xì)菌毒力[24]。Sun等[25]研究表明，在導(dǎo)致肝膿腫的hvKP中，92.1%(35/38)為rmpA陽(yáng)性。kfuBC基因的檢出率為85.7%，kfuBC基因可介導(dǎo)Fe3+的攝取，多存在于高毒力肺炎克雷伯菌菌株中，有研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有K1型高毒力肺炎克雷伯菌均攜帶kfuBC基因[26]?；騯rea的檢出率為83.3%，基因urea與allS均可調(diào)控細(xì)菌尿素酶，allS基因可使KP在有氧和無(wú)氧條件下都能利用尿素囊而獲得碳源、氮源等能量來(lái)源[27]。不同毒力的組合使分離株產(chǎn)生不同的特性，增加了其致病性，雖然毒力基因常見(jiàn)于高毒力肺炎克雷伯菌菌株中，不代表該細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生高致病力，而探究高致病力原因是未來(lái)研究高毒力肺炎克雷伯菌感染的方向。

綜上所述，肺炎克雷伯菌在廣東省羊場(chǎng)中存在流行，且耐藥率比較嚴(yán)重，需要在實(shí)際養(yǎng)殖過(guò)程中合理使用抗生素，建議通過(guò)藥敏試驗(yàn)確定給藥種類，可以聯(lián)合應(yīng)用抗生素，以減少耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，同時(shí)能夠達(dá)到最好的治療效果。

4 結(jié) 論

廣東省羊養(yǎng)殖場(chǎng)中肺炎克雷伯菌分離率較高，同時(shí)分離所得菌株大部分為多重耐藥菌株，對(duì)喹諾酮類及β-內(nèi)酰胺類抗生素具有較高的耐藥性，且含有多種毒力基因，具有較高的致病性，在治療肺炎克雷伯菌引起的呼吸道疾病時(shí)，可選用多種抗生素進(jìn)行周期性交替使用，避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，同時(shí)做好日常防護(hù)清潔工作，切斷傳播途徑，減少感染量。