N-乙酰-L-半胱氨酸抗1型糖尿病模型比格犬晶狀體上皮氧化損傷的作用

周水蓮，白雨曼，謝文婷，黃健佳，邱文粵，龐曉玥，章心婷，唐兆新，蘇榮勝*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642；2.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司，廣州 510642)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一種慢性代謝性疾病[1]，近年來(lái)隨著生活水平和醫(yī)療水平的改善，老齡寵物越來(lái)越多，寵物糖尿病的發(fā)病率亦呈逐年上升的趨勢(shì)。眼病、心臟病等是糖尿病最常見的并發(fā)癥。目前，白內(nèi)障摘除和人工晶體植入手術(shù)是糖尿病性白內(nèi)障的主要治療方法，然而，手術(shù)可導(dǎo)致許多嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥，尤其是老年和高血糖情況下[2]。臨床流行病學(xué)和基礎(chǔ)研究均表明氧化應(yīng)激在糖尿病發(fā)病機(jī)制中占有重要地位[3]，白內(nèi)障的形成與脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基產(chǎn)生過(guò)多有關(guān)，從理論上講，抗氧化劑的應(yīng)用應(yīng)成為防治此病，提高機(jī)體健康水平的重要途徑；迄今為止，盡管人們圍繞抗氧化劑進(jìn)行了長(zhǎng)期大量的研究和探索，但尚沒(méi)有一個(gè)單純的抗氧化劑被臨床證實(shí)可以用于有效治療疾病，抗氧化治療并未獲得預(yù)期的效果。

N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC)是一種常見的小分子抗氧化劑，易進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體進(jìn)行細(xì)胞代謝，在體內(nèi)可脫去乙?；砂腚装彼?，最終合成谷胱甘肽，是機(jī)體生理代謝的重要物質(zhì)[4]。NAC作為一種經(jīng)典的抗氧化劑，能降低機(jī)體細(xì)胞的活性氧，減輕機(jī)體異常的過(guò)氧化反應(yīng)[5]，最終有助于維持細(xì)胞正常的生理功能和細(xì)胞形態(tài)。秦淑蘭等[6]探討了NAC對(duì)糖尿病模型小鼠氧化應(yīng)激的影響，研究結(jié)果表明NAC可有效改善糖尿病模型小鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，減輕糖尿病引起的多個(gè)臟器的氧化損傷[7]。但NAC在機(jī)體眼部疾病，特別是糖尿病引起的白內(nèi)障中的作用鮮有報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)擬將NAC作用于STZ聯(lián)合ALX誘導(dǎo)的1型糖尿病模型比格犬，探討NAC是否參與改善糖尿病犬晶狀體的氧化損傷，為NAC的臨床應(yīng)用提供又一理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用40只健康2～3歲比格犬，雌雄各半，體重9～13 kg，由廣州醫(yī)藥研究總院有限公司提供。本批次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已獲得實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證(編號(hào)：SYXK 粵 2019-0196)，所有動(dòng)物試驗(yàn)程序均經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在試驗(yàn)前已通過(guò)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物倫理審查備案。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；四氧嘧啶、NAC購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；精蛋白生物合成人胰島素注射液，商品名為諾和靈N(中效)，購(gòu)自諾和諾德(中國(guó))制藥有限公司。

常規(guī)生化復(fù)合校準(zhǔn)品、生化復(fù)合定值質(zhì)控品均購(gòu)于深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；Trizol試劑盒、熒光定量試劑盒(SYBR?Premix Ex TaqTMII)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser)均購(gòu)自TaKaRa公司；脂質(zhì)氧化物(MDA)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽還原酶(GR)檢測(cè)試劑盒(DTNB法)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶檢測(cè)試劑盒(NADPH法)均購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與動(dòng)物飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)犬造模前先適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，將比格犬隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為對(duì)照組(CON組)、糖尿病模型組(DM組)、胰島素治療組(INS組)、NAC聯(lián)合胰島素治療組(NAC+INS組)和NAC治療組(NAC組)。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果，確定造模所需的鏈脲佐菌素和四氧嘧啶的劑量。于試驗(yàn)開始當(dāng)日(第1 天)和第4天，通過(guò)靜脈注射的方式每組均給予20 mg·kg-1鏈脲佐菌素和20 mg·kg-1四氧嘧啶。此外，對(duì)照組靜脈注射相應(yīng)體積的生理鹽水。此后連續(xù)兩周監(jiān)測(cè)空腹血糖值，并于試驗(yàn)第10天進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)，如果連續(xù)兩周測(cè)得血糖空腹血糖濃度≥8.30 mmol·L-1或隨機(jī)血糖濃度>11.1 mmol·L-1，則可判定為糖尿病[8]。據(jù)上述兩種試驗(yàn)結(jié)果確定已成1型糖尿病模型后，INS組、NAC+INS組在試驗(yàn)第11天開始給予胰島素，胰島素用量參照說(shuō)明書，每天2次，于早上09：00和晚上21：00進(jìn)食后進(jìn)行。NAC+INS組和NAC組亦在試驗(yàn)第11天開始，每日早上09：00按30 mg·kg-1的劑量給犬口服NAC。每月記錄犬只體重和空腹血糖。

1.4 胰島素釋放試驗(yàn)

在空腹?fàn)顟B(tài)下，給每只試驗(yàn)犬按照10 mL·kg-1劑量灌喂10%葡萄糖溶液，使血糖升高刺激胰島β細(xì)胞釋放胰島素，通過(guò)ELISA的方法測(cè)定空腹及服糖后0.5、1、2、3 h的血漿胰島素水平。

1.5 樣品采集與處理

將試驗(yàn)犬只安樂(lè)死后，迅速吸取雙眼房水，取200 μL待檢測(cè)葡萄糖含量，其余分裝凍存于-80 ℃冰箱待檢。用眼科器械行眼球摘除術(shù)，取出完整的眼球，然后迅速切取少量右眼晶狀體組織用于分子生物學(xué)檢測(cè)；切取左眼晶狀體進(jìn)行組織病理學(xué)分析。

1.6 比格犬晶狀體白內(nèi)障的等級(jí)測(cè)定

在造模第120天時(shí)，使用手持裂隙燈顯微鏡，檢查眼晶狀體，評(píng)估晶狀體的分級(jí)狀況分別拍攝記錄。

晶狀體混濁的分級(jí)如下：透明正常晶狀體(0級(jí))；外周囊泡(1級(jí))；外周囊泡和皮質(zhì)混濁(2級(jí))；彌漫性中央混濁(3級(jí))；和成熟的白內(nèi)障(4級(jí))[9]。記錄每只眼睛等級(jí)，每級(jí)對(duì)應(yīng)相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。

根據(jù)裂隙燈檢查結(jié)果，并參照晶狀體混濁分類系統(tǒng)Ⅲ(LOCSⅢ)和Kador等國(guó)際分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定白內(nèi)障分期[9]，共分為Ⅰ～Ⅴ期。分期標(biāo)準(zhǔn)分別為①白內(nèi)障Ⅰ期：散瞳后裂隙燈下可見晶狀體周邊皮質(zhì)出現(xiàn)小囊泡或細(xì)小囊泡群；②白內(nèi)障Ⅱ期：散在小囊泡群開始從赤道部向前極部蔓延，從而在鏡下形成細(xì)環(huán)狀或戒指狀混濁；③白內(nèi)障Ⅲ期：皮質(zhì)部前極有放射狀混濁，呈灰白色，從“Y”形縫蔓延。④白內(nèi)障Ⅳ期：皮質(zhì)部的混濁開始融合，有水裂或新月形投影，混濁區(qū)眼底細(xì)節(jié)不可見；⑤白內(nèi)障Ⅴ期：皮質(zhì)和晶體核均完全變成灰白混濁，眼底完全被遮蔽，細(xì)節(jié)不可見。

1.7 病理切片

將犬晶狀體組織浸泡于4%的多聚甲醛中固定24 h以上，梯度酒精脫水處理，石蠟包埋，待石蠟?zāi)毯笮迚K，然后進(jìn)行晶狀體組織切片(3～7 μm)，之后將置于37 ℃烘片機(jī)上平放烘干8～10 h后備用。將烘片機(jī)溫度調(diào)高至55 ℃烤片2 h，37 ℃復(fù)溫后使用蘇木精和伊紅(H&E)染色、中性樹脂封片，晾干后于顯微鏡下觀察并取圖像記錄。

1.8 抗氧化能力檢測(cè)

稱取20 mg晶狀體組織于EP管中，加入0.2 mL裂解液，混勻2 min后勻漿，12 000g離心10 min，取上清用于后續(xù)測(cè)定；上清和眼房水用于MDA含量、GSH/GSSG、GSH-Px活性和GR活性的測(cè)定。測(cè)定過(guò)程嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)晶狀體氧化損傷相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況

使用Trizol法提取晶狀體組織總RNA，并反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，根據(jù)NCBI的GenBank中犬β-actin、SOD2和GRmRNA的基因組序列，應(yīng)用Primer 6.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)成功后進(jìn)行合成，引物序列見表1。按SYBR?Premix Ex TaqTMII熒光定量試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

表1 引物序列Table 1 Reference sequences

1.10 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié) 果

2.1 胰島素釋放試驗(yàn)和血糖圖變化

試驗(yàn)期間空腹血糖曲線如圖1A可見，試驗(yàn)15 d內(nèi)，與CON組血糖一直在正常范圍，而DM組連續(xù)兩周測(cè)得血糖空腹血糖濃度≥8.30 mmol·L-1。

A.血糖；B.胰島素。CON.對(duì)照組；DM.糖尿病模型組A. Blood glucose；B. Plasma insulin. CON. Control group；DM. Diabetes model group圖1 血糖和血漿胰島素含量曲線Fig.1 Blood glucose and plasma insulin content curves

試驗(yàn)犬血漿胰島素含量變化見圖1B，可見CON組犬血漿胰島素水平在服糖后0.5 h達(dá)高峰，隨后2 h內(nèi)回降至空腹水平；而DM組犬血漿胰島素曲線一直呈低平，無(wú)明顯高峰狀態(tài)。

2.2 NAC對(duì)1型糖尿病模型犬房水及血液中糖含量的影響

如圖2A所示，與CON組對(duì)比，DM組房水中葡萄糖含量有大幅升高，差異顯著(P<0.05)；與DM組對(duì)比，NAC+INS組房水中葡萄糖含量呈顯著降低(P<0.05)，而INS組和NAC組房水中葡萄糖含量?jī)H有輕微降低。

A.NAC對(duì)房水GLU含量的影響；B.各組不同時(shí)間點(diǎn)血清GLU含量。CON.對(duì)照組；DM.糖尿病模型組；INS. 胰島素治療組；NAC+INS. NAC聯(lián)合胰島素治療組；NAC. NAC治療組。同一時(shí)間點(diǎn)中，與CON組相比,*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001；與DM組相比,#.P<0.05，##.P<0.01，###.P<0.001。下同A. Effect of NAC on aqueous humor GLU content；B. Serum GLU content at different time points in each group. CON. Control group；DM. Diabetes model group；INS. Insulin treatment group；NAC+INS. NAC combined with insulin treatment group；NAC. NAC treatment group. At the same time point，compared with CON group, *.P<0.05，**. P<0.01，***. P<0.001; compared with DM group, #.P<0.05，##. P<0.01; ###. P<0.001. The same as below圖2 NAC對(duì)房水和血清葡萄糖含量的影響Fig.2 Effect of NAC on aqueous humor and serum glucose content

各組試驗(yàn)犬血糖含量變化見圖2B，試驗(yàn)犬在造模前各組間血糖含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；試驗(yàn)30 d時(shí)，與CON組相比，DM組血糖含量極顯著升高(P<0.001)，與DM組比較，NAC+INS、INS及NAC組中血糖含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，其中，NAC+INS組下降幅度最大；試驗(yàn)120 d時(shí)，與CON組相比，DM組血糖含量極顯著升高(P<0.001)，與DM組比較，NAC+INS、INS及NAC組中GLU含量均顯著降低(P<0.05,P<0.01或P<0.001)，其中，NAC+INS組下降幅度最大。

2.3 NAC對(duì)白內(nèi)障程度的影響

各試驗(yàn)組犬在造模120 d時(shí)對(duì)晶狀體進(jìn)行裂隙燈檢查照片，圖3為從試驗(yàn)組犬中挑選1只最具代表性的進(jìn)行展示。造模4個(gè)月后，CON組和NAC+INS組晶狀體呈清晰、正常狀態(tài)為0級(jí)；DM組和INS組試驗(yàn)犬皮質(zhì)部的混濁開始融合，有水裂，混濁區(qū)眼底細(xì)節(jié)不可見，彌漫性中央混濁，可分為白內(nèi)障Ⅳ期，3級(jí)；NAC組試驗(yàn)犬散瞳后皮質(zhì)部前極有放射狀混濁，呈灰白色，從“Y”形縫蔓延外周囊泡和皮質(zhì)混濁，可分為Ⅲ期，2級(jí)。

圖3 裂隙燈檢查圖片F(xiàn)ig.3 Slit-lamp examination pictures

綜合兩種分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)病變進(jìn)行描述，記錄結(jié)果如表2。DM組白內(nèi)障評(píng)分顯著高于CON組(P<0.01)；NAC+INS組評(píng)分顯著低于DM組(P<0.01)。

表2 白內(nèi)障等級(jí)評(píng)估表Table 2 Cataract grade assessment table

2.4 NAC對(duì)眼睛病理組織學(xué)的影響

從圖4可以看出，CON組和NAC+INS組的晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)排列整齊，大小均一，細(xì)胞間連接緊密，胞間空隙均勻，核呈圓形又大，且染色均勻，與前囊膜連接緊密；然而，DM組LECs間隙不均勻，細(xì)胞大小不均，細(xì)胞核數(shù)量減少且部分出現(xiàn)核固縮，有壞死小體(箭頭所示)，且前囊膜連接疏松，染色過(guò)程中前囊膜脫離，圖中所見為厚切之后多層LECs裸露在表面；經(jīng)NAC或胰島素單獨(dú)治療的組中LECs胞間連接較為緊密，病變情況有所改善，但細(xì)胞核形態(tài)不均一，且與前囊膜連接也出現(xiàn)縫隙，治療效果不及NAC+INS組。此外，5個(gè)組的晶狀體內(nèi)部淺皮質(zhì)區(qū)和深皮質(zhì)區(qū)，成熟的晶狀體纖維排列和走向均整齊，無(wú)明顯病變，INS組和NAC組由于染色過(guò)程出現(xiàn)裂紋，其纖維結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯變化。

左列為HE染色，200×；中間列為左列的放大；右列為晶體深皮質(zhì)區(qū)。箭頭指示細(xì)胞核The left column is HE staining, 200×; The middle column is a larger version of the left column; The right column is the deep cortex of the crystal. The arrow indicates the nucleus圖4 晶狀體組織病理學(xué)切片圖(HE染色，200×)Fig.4 Histopathological section of lens (HE staining，200×)

2.5 NAC對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響

NAC對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的結(jié)果如圖5所示，與CON組相比，DM組的晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著升高(P<0.05)、GSH/GSSG和GSH-Px活性均顯著下降(P<0.05)、GR活性下降(P>0.05)；而與DM組相比，NAC+INS組中晶狀體上皮細(xì)胞內(nèi)MDA含量顯著下降(P<0.05)、GSH/GSSG和GSH-Px活性顯著上升(P<0.05)、GR活性極顯著上升(P<0.01)，表明NAC聯(lián)合胰島素治療可抑制DM犬晶狀體上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激。

圖5 NAC對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響Fig.5 Effect of NAC on antioxidant index of lens epithelial cells

2.6 NAC對(duì)房水中抗氧化指標(biāo)的影響

NAC對(duì)房水中抗氧化指標(biāo)的結(jié)果如圖6所示，在造模第120天，與CON組相比，DM組的房水中MDA含量極顯著升高(P<0.01)，而GSH/GSSG、GR活性和GSH-Px活性均極顯著下降(P<0.01)；與DM組相比，NAC+INS組房水中MDA含量下降(P>0.05)、GSH/GSSG極顯著上升(P<0.001)、GR活性和GSH-Px活性極顯著上升(P<0.05)，表明NAC聯(lián)合胰島素治療可降低DM犬房水中氧化應(yīng)激水平。

圖6 NAC對(duì)房水中抗氧化指標(biāo)的影響Fig.6 Effect of NAC on antioxidant indexes in aqueous humor

2.7 NAC對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷相關(guān)基因表達(dá)的影響

NAC對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷相關(guān)基因表達(dá)量變化如圖7所示，與CON組對(duì)比，DM組的GR和SOD2mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)，且差異顯著(P<0.05)；而與DM組對(duì)比，NAC+INS組GR和SOD2mRNA表達(dá)水平上調(diào)，但差異不顯著(P>0.05)，表明NAC聯(lián)合胰島素治療可進(jìn)一步增加抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)量。

圖7 NAC對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷相關(guān)基因表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of NAC on expression of oxidative damage-related genes in lens epithelial cells

3 討 論

為了研究糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制，篩選保護(hù)藥物并探索其作用機(jī)理，建立合適的試驗(yàn)性糖尿病白內(nèi)障動(dòng)物模型具有重要意義[10-11]。運(yùn)用對(duì)胰島β細(xì)胞有毒性的化學(xué)物質(zhì)ALX和STZ對(duì)試驗(yàn)比格犬進(jìn)行造模。在本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，5個(gè)組呈現(xiàn)的血清和房水的GLU變化趨勢(shì)是一致的，表明用血清和房水中任何一種來(lái)作為測(cè)量房水葡萄糖含量都是可行的，但是血清中測(cè)量的葡萄糖含量變化差異性要高于房水，說(shuō)明臨床中如果要為眼部患畜做診斷，若選擇檢測(cè)血清去推測(cè)房水葡萄糖，那么房水中的葡萄糖含量會(huì)被高估。張志鵬[12]研究表明，犬糖尿病性白內(nèi)障模型分級(jí)形成時(shí)間分別為C1：30 d左右；C2：60 d左右；C3：150 d左右；C4：180 d左右；C5：240 d左右。本試驗(yàn)中所監(jiān)測(cè)到的空腹血糖水平均表明已建成1型糖尿病模型。成模120 d后進(jìn)行散瞳，可見DM組中犬晶狀體皮質(zhì)部的混濁開始融合，有水裂，即為白內(nèi)障Ⅳ期，與張志鵬[12]研究結(jié)果相一致。有研究表明，與非糖尿病患者相比，即使血糖水平降低至機(jī)體正常范圍內(nèi)，波動(dòng)也較小，DM患者的白內(nèi)障發(fā)生可能性還是沒(méi)有顯著降低[13-14]。本試驗(yàn)中INS組血糖水平較NAC組控制更好，但是裂隙燈結(jié)果中INS組比NAC組白內(nèi)障等級(jí)要更高，說(shuō)明只用胰島素，可以有效控制血糖，但不能延緩糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)展。本研究結(jié)果表明，NAC聯(lián)合胰島素治療，可以有效延緩晶狀體混濁的發(fā)生發(fā)展。

有研究表明，氧化應(yīng)激是白內(nèi)障的致病因素，與正常個(gè)體相比，從復(fù)雜性白內(nèi)障患者獲得的房水樣品的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物濃度增加[15]。據(jù)報(bào)道STZ和ALX是通過(guò)氧化應(yīng)激對(duì)β細(xì)胞造成損傷[16]。Boarescu等[17]研究表明，1型糖尿病可降低機(jī)體的總抗氧化能力。另有研究表明，STZ誘導(dǎo)的DM大鼠氧化應(yīng)激水平升高，提示高糖可觸發(fā)氧化應(yīng)激，與對(duì)照組相比，DM組大鼠的血清，MDA含量明顯增加[18]。本試驗(yàn)中首先采用ELISA試劑盒對(duì)各組試驗(yàn)犬的房水、晶體組織進(jìn)行機(jī)體氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢驗(yàn)，研究結(jié)果與上述學(xué)者所得一致。與CON組對(duì)比，在兩種樣本中DM組的犬晶體上皮的MDA含量升高，GSH-Px活性、GR活性和GSH/GSSG含量均呈不同程度的增加。說(shuō)明運(yùn)用SLX聯(lián)合STZ造模會(huì)使試驗(yàn)犬機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高。房水中各氧化應(yīng)激指標(biāo)降低幅度很大，與CON組對(duì)比差異極顯著，而同樣條件下，在晶體組織中檢測(cè)結(jié)果差異顯著性更小?？赡苁蔷铙w酶類抗氧化劑從細(xì)胞內(nèi)核糖體被制造，通過(guò)細(xì)胞膜擴(kuò)散至細(xì)胞外液，分布在全身各個(gè)組織中，所以細(xì)胞代謝功能越活躍的器官，抗氧化酶濃度越高，越容易檢測(cè)到，而房水是由睫狀體某些上皮細(xì)胞產(chǎn)生，而晶狀體上皮細(xì)胞只有單層，數(shù)量較少，且晶狀體囊膜形成一層屏障，房水中與晶狀體上皮細(xì)胞的抗氧化酶濃度與活力存在梯度，所以房水中比晶體組織中檢測(cè)的氧化應(yīng)激指標(biāo)顯著性差異更大。

黃酮苷可以抑制糖尿病性白內(nèi)障小鼠中LECs的氧化應(yīng)激水平，顯示GSH-Px、T-SOD活性全部都低于陰性對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，提示高糖對(duì)LECs表現(xiàn)出明顯的氧化應(yīng)激[19]，而高劑量黃酮苷治療組與高糖組對(duì)比GSH-Px、T-SOD活性顯著升高[20]。DL-丁基苯酞對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病性白內(nèi)障大鼠血清MDA含量比模型組顯著降低[21]。本試驗(yàn)對(duì)DM組和其他治療組犬房水和晶體組織中的各氧化應(yīng)激因子水平進(jìn)行了對(duì)比，研究結(jié)果顯示，與DM組相比較，NAC+INS組的MDA含量在兩種樣本中均降低；所有已測(cè)的抗氧化酶活力和GSH/GSSG在兩種樣本中均呈不同程度的升高，與前人研究結(jié)果相一致，表明NAC聯(lián)合胰島素治療可抑制DM犬氧化應(yīng)激，其中，晶體組織中GSH-Px、GR活力和GSH/GSSG的升高程度與DM組對(duì)比有顯著差異，且MDA含量也顯著升高，同時(shí)在房水中僅有GSH-Px、GR活力的升高程度與DM組對(duì)比有顯著差異，說(shuō)明在晶狀體酶系抗氧化劑中以GSH-Px和GR為主。而且通過(guò)比較兩種樣本，INS組和NAC+INS組可改善氧化應(yīng)激水平，且NAC+INS組比INS組表現(xiàn)更佳，說(shuō)明NAC聯(lián)合胰島素治療與單獨(dú)使用胰島素治療相比，在抑制糖尿病性白內(nèi)障犬氧化應(yīng)激方面可取得更好的效果。Takahashi等[22]研究表明，T1D患者中與氧化應(yīng)激有關(guān)的基因?yàn)樯险{(diào)，本研究中，DM組的SOD2和GR基因相對(duì)表達(dá)水平相較于CON組也有顯著性升高，與Takahashi等[22]的研究結(jié)果相一致。而各治療組相較于DM組均有不同程度上調(diào)，其中，NAC組的SOD2基因相對(duì)表達(dá)水平與DM組對(duì)比有顯著性上調(diào)(P<0.05)；與INS組相比，NAC+INS組和NAC組上調(diào)程度更高，說(shuō)明只要發(fā)生糖尿病，那么機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激基因均出現(xiàn)上調(diào)，而NAC作為抗氧化劑，也可能對(duì)氧化應(yīng)激有關(guān)的基因有激活作用，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

4 結(jié) 論

NAC聯(lián)合胰島素治療能改善1型糖尿病犬的血糖、晶狀體功能，比單獨(dú)使用胰島素組的效果更好。NAC聯(lián)合胰島素治療對(duì)糖尿病犬晶狀體上皮損傷的保護(hù)作用，可能和抑制晶狀體的氧化應(yīng)激有關(guān)。