基于lncRNA模型預測宮頸癌免疫治療應(yīng)答

蘇慧超 張臻 唐曉慧 于金明

1天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 國家惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學研究中心 天津市腫瘤防治重點實驗室，天津 300060；2荷蘭馬斯特里赫特大學放射腫瘤學系 放射腫瘤科，馬斯特里赫特 6211SV；3山東第一醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院臨床研究部，濟南 250117

宮頸癌的發(fā)病率和病死率在女性人群中均排名第4，對全球女性生命健康造成了嚴重威脅［1］。對于早期宮頸癌的治療通常以手術(shù)為主，晚期治療主要包括放療和化療［2］。不幸的是，大部分宮頸癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期。由于較高的耐藥性和易復發(fā)性，晚期宮頸癌的治療效果往往欠佳，5年生存率較低［3］。因此，有必要探索新的治療方式以改善宮頸癌患者的預后。

研究發(fā)現(xiàn)，免疫治療可以作為晚期宮頸癌新的治療手段［4］。免疫檢查點抑制劑（ICI）的原理是通過單克隆抗體來對抗能夠抑制免疫活動的免疫檢查點，使機體的免疫反應(yīng)得到正向調(diào)控，增強免疫細胞的抗腫瘤作用［5］。根據(jù)2021年歐洲腫瘤內(nèi)科學會年會主席研討會報道，KEYNOTE-826研究結(jié)果顯示，在617例未接受全身化療且不適合手術(shù)或放療等治愈性療法的復發(fā)性或轉(zhuǎn)移性宮頸癌患者中，帕博利珠單抗一線聯(lián)合方案與安慰劑組相比顯著提高了總生存期［6］。該結(jié)果為ICI治療用于復發(fā)和轉(zhuǎn)移性晚期宮頸癌的一線治療提供了進一步的數(shù)據(jù)支持。然而，據(jù)統(tǒng)計報告，僅有10%～40%的患者對ICI能夠產(chǎn)生響應(yīng)，低應(yīng)答率限制了ICI治療潛力和臨床獲益［7］。在當前的研究中，一些被推薦的指標如檢查點的表達水平、腫瘤突變負荷等對于免疫治療應(yīng)答的預測表現(xiàn)尚不理想。因此亟需尋找新的可預測免疫治療應(yīng)答的標志物，從而確定宮頸癌患者中接受ICI治療的潛在獲益人群，減少非獲益人群免疫治療相關(guān)不良事件的發(fā)生。

人類基因組研究計劃的結(jié)果表明：能夠用于編碼蛋白質(zhì)的核酸序列僅占全部的2%，而其余的絕大部分并不直接參與蛋白質(zhì)的表達，此類基因稱為非編碼RNA。其中，序列長度超過200 nt的序列被稱為長鏈非編碼RNA（lncRNA）［8］。由于不能編碼蛋白質(zhì)，lncRNA在過去被認為是一種轉(zhuǎn)錄噪聲，并不具備實際的生物學意義。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以廣泛參與機體的正常生命活動及疾病演進過程［9-11］。lncRNA能夠通過與DNA、RNA以及蛋白質(zhì)的相互作用，從而參與基因的調(diào)控［12］。研究認為，lncRNA在調(diào)控免疫功能過程中具有十分重要的作用［13］。Wang等［14］的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-DC在樹突狀細胞（DC）中特異性表達。實驗結(jié)果表明，在敲除人單核細胞和小鼠骨髓細胞的Lnc-DC后，DC的分化受到明顯抑制，間接下調(diào)了DC刺激T細胞活化的能力。雖然既往研究已經(jīng)報道過lncRNA參與多種癌種的免疫反應(yīng)，但目前關(guān)于宮頸癌的研究中，lncRNA與免疫功能的關(guān)系仍不清楚。

在本項研究中，我們基于癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中255例宮頸癌患者的RNA測序數(shù)據(jù)來鑒定免疫相關(guān)的lncRNA（IRL），并基于多因素COX回歸分析建立了IRL模型［15］。本研究可以為預測宮頸癌患者的免疫治療反應(yīng)和預后提供新的見解。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)獲取

宮頸癌患者的基因表達數(shù)據(jù)、臨床數(shù)據(jù)來自TCGA數(shù)據(jù)庫。免疫相關(guān)基因來自基因集合富集分析（GSEA）網(wǎng)站（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）［16］，Ensembl文件用于注釋和區(qū)分信使RNA（mRNA）和lncRNA，以Spearman相關(guān)系數(shù)|ρ| ＞0.7且P＜0.05為閾值篩選出IRL［17］。

2.風險模型的構(gòu)建與驗證

我們使用Kaplan-Meier（KM）分析來探討56個IRL的預后價值，其中有17個被認為與生存有關(guān)。使用多因素COX回歸分析構(gòu)建模型，計算風險得分?；陲L險得分中位值將所有樣本分為高低風險兩組。KM分析認為該模型可以作為宮頸癌患者的獨立預后因素。分別計算患者1、2、3年的受試者工作特征曲線（ROC）的曲線下面積，評估模型的預測準確性。

3.臨床病理特征在不同風險組間的分布

使用Fisher確切概率法計算該模型和宮頸癌患者的臨床病理學特征之間的關(guān)系。這些特征包括年齡、分級、T分期、M分期。

4.高低風險組的差異基因分析

R軟件“edgeR”包，用于篩選不同風險組之間的差異基因［18］。篩選出符合|log2FC|＞1 且P＜0.05 的基因作為差異基因。

5.免疫通路富集分析

使用R軟件“ClusterProfiler”包進行基因本體（GO）富集分析［19-20］。P＜0.05的通路被認為是顯著富集的。為了闡明風險組之間的生物學差異，使用“ClusterProfiler”包，以“c2.cp.kegg.v7.4.symbols”基因集為背景，進行了 GSEA［21］。P＜0.05被認為是顯著的。我們選擇免疫相關(guān)的通路進行展示。

6.風險模型與免疫細胞浸潤的關(guān)系

為了進一步探索兩組中浸潤性免疫細胞豐度的差異，我們通過單樣本基因富集分析（ssGSEA）和基于反卷積的CIBERSORT算法［22］，評價不同組間免疫細胞亞群和免疫功能的差異，并使用R軟件“ggplot2”包繪制熱圖和小提琴圖，Wilcoxon檢驗應(yīng)用于在不同風險組間發(fā)現(xiàn)具有顯著差異的免疫細胞亞群。

7.計算免疫表型評分和免疫應(yīng)答反應(yīng)評分

我們使用Charoentong等［23］提出的免疫表型評分，尋找兩組間的基因型-免疫表型的差異。使用Wilcoxon檢驗及Spearman相關(guān)性分析來展示兩組之間4種免疫表型的差異以及相關(guān)性。使用Wilcoxon檢驗來研究兩個風險組之間免疫檢查點的差異表達。然后，我們使用腫瘤免疫功能障礙與排斥（TIDE）網(wǎng)站（http：//tide.dfci.harvard.edu/）來預測免疫治療應(yīng)答的可能性，這是一個為免疫治療預測而搭建的計算框架，其預測功能已被成功證實［24］。在TCIA數(shù)據(jù)庫（https：//tcia.at/）中獲取宮頸癌免疫表觀（IPS）評分，使用Wilcoxon檢驗兩組之間的差異。

結(jié) 果

1.預后相關(guān)IRL的鑒定

通過TCGA數(shù)據(jù)庫獲取了255例宮頸癌患者基因轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并在GSEA網(wǎng)站中獲取了331個免疫相關(guān)mRNA。與lncRNA的表達進行Spearman相關(guān)分析，以|ρ| ＞0.7且P＜0.05為截斷值，得到了56個IRL（圖1A），并進行KM分析。結(jié)果表明：共有17個IRL對宮頸癌患者的預后存在顯著影響（圖1B）。

圖1 模型變量篩選。A：免疫基因與長鏈非編碼RNA（lncRNA）相關(guān)性熱圖；B：對|ρ| ＞0.7且P＜0.05的免疫相關(guān)的lncRNA（IRL）進行Kaplan-Meier分析

2.風險模型的構(gòu)建與評估

基于17個生存相關(guān)IRL進行多因素COX分析，構(gòu)建IRL預后模型。變量LINC01281：系數(shù)-1.947 0，風險比0.142 689；變量LINC02481：系數(shù)-0.375 9，風險比0.686 620。模型公式為：風險評分=（-1.947 0×LINC01281）+（-0.375 9×LINC02481）。患者風險評分亞組（Garde分級和T、M分期）分析顯示風險評分的高低在T分期與M分期中存在顯著差異（圖2A、B、C）。KM分析顯示模型的不同分組之間預后存在顯著差異（圖2D），1～3年的ROC曲線下面積分別0.850、0.796、0.702（圖2E）。這些結(jié)果表明該模型的風險得分可作為宮頸癌預后標志物，ROC證明了模型具有較高的效能。

圖2 在癌癥基因組圖譜（TCGA）宮頸癌隊列中多因素COX回歸模型的構(gòu)建。A：模型的生存、分級、分期的比較；B：所有患者的風險評分、生存結(jié)局以及基因表達；C：不同T分期中基因表達和風險得分；D：以風險評分中位數(shù)分為高低兩組，進行組間Kaplan-Meier分析；E：1、2、3年曲線下面積評價模型效能

3.免疫微環(huán)境評估

為了研究宮頸癌患者不同風險組間免疫浸潤的差異，我們評估了每例患者的腫瘤微環(huán)境及免疫浸潤水平。結(jié)果表明，低風險組的免疫得分顯著高于高風險組（圖3A），熱圖顯示模型與多種免疫細胞及通路呈負相關(guān)（圖3B）。使用反卷積算法評估免疫微環(huán)境，結(jié)果提示：CD8+T細胞、濾泡輔助T細胞、B細胞和M0、M1型巨噬細胞在兩組中存在顯著差異（圖3C）。這些發(fā)現(xiàn)表明模型評分與宮頸癌免疫微環(huán)境密切相關(guān)。

圖3 探索不同分組間腫瘤微環(huán)境組成及功能的差異。A：比較組間免疫得分、基質(zhì)得分和腫瘤純度評分；B：基因及風險得分與免疫細胞和免疫功能的相關(guān)性熱圖；C：比較組間免疫細胞和免疫功能

4.免疫通路的富集分析

為研究造成不同分組間免疫微環(huán)境差異的原因，我們進行了分組間免疫通路的富集分析。以|log2FC|＞1且P＜0.05為截斷值進行組間基因表達差異分析，得到了1 831個差異基因，其中，在高風險組中有716個基因上調(diào)、1 115個基因下調(diào)?；鹕綀D顯示，多種免疫相關(guān)的基因在兩組之間差異表達，如CXCL9、CD52、CXCR1、IL2RA等（圖4A）。使用差異基因進行GO富集分析，結(jié)果提示：免疫反應(yīng)-激活信號轉(zhuǎn)導、淋巴細胞介導的免疫、T細胞激活等多種免疫相關(guān)通路得到顯著富集（圖4B）。GSEA分析顯示細胞因子與受體的互作、輔助性T細胞的分化、趨化因子信號等多種免疫相關(guān)通路在低風險組中被富集（圖4D）。使用基因集合變異分析（GSVA）算法比較兩組之間的功能通路的評分，結(jié)果提示IL6-JAK-STAT3信號、干擾素（IFN）-γ反應(yīng)、IFN-α反應(yīng)、補體反應(yīng)等多種抗腫瘤免疫的通路在低風險組中表達顯著高于高風險組（圖4C）。此外，模型評分顯示出了與多種免疫通路如自然殺傷（NK）細胞介導的免疫、T細胞激活、免疫球蛋白產(chǎn)生等信號通路的顯著負相關(guān)性（圖4E）。

圖4 模型評分與免疫通路的富集。A：兩組之間火山圖（以|log2FC|＞1且P＜0.05為截斷值）；B：兩組之間差異基因的基因本體（GO）富集分析；C：兩組之間基因集合變異分析（GSVA）差異分析（以t值差＞1為截斷值）；D：兩組間基因集合富集分析（GSEA），左側(cè)為高風險組，右側(cè)為低風險組；E：風險得分與以基于基因計算的多種通路得分之間的關(guān)系，實線代表正相關(guān)，虛線代表負相關(guān)，線的顏色代表P值

5.不同分組間免疫功能的差異

為進一步研究風險分組間免疫功能的差異，我們根據(jù)Charoentong等［23］建立的基因型-免疫表型確定了所有患者的4種免疫相關(guān)功能評分（效應(yīng)細胞、抗原提呈、抑制細胞、檢查點）。結(jié)果顯示，這4種功能評分在兩組間具有顯著差異（圖5B）。其中，高風險組的檢查點和抑制細胞評分更高，而低風險組的效應(yīng)細胞和抗原提呈的評分更高。此外，模型評分與檢查點、抑制細胞評分呈正相關(guān)，與效應(yīng)細胞和抗原提呈評分呈負相關(guān)（圖5C）。多種免疫檢查點，如PDCD1、CTLA4、LAG3、TIGIT等，在低風險組的表達更高（圖5D）。這些結(jié)果表明，風險評分與宮頸癌患者的免疫功能密切相關(guān)。

圖5 探究不同分組間免疫功能及免疫檢查點表達的差異。A：根據(jù)基因表達確定每例患者關(guān)于免疫表型的各項評分；B：兩組間免疫表型的差異；C：風險評分與表型的相關(guān)性；D：兩組間免疫檢查點基因表達差異

6.不同分組間免疫治療的差異

為研究兩組間免疫治療應(yīng)答率是否存在差異，我們計算了所有樣本的TIDE評分及IPS評分。結(jié)果顯示，低風險組的TIDE評分更低（圖6A）、IPS評分更高（圖6B）。這表明，低風險組的患者對免疫治療的應(yīng)答率更高。

圖6 不同風險組間免疫治療應(yīng)答的差異。A：免疫治療應(yīng)答預測腫瘤免疫功能障礙與排斥（TIDE）評分在兩組之間的差異；B：癌癥基因組圖譜（TCGA）患者接受免疫治療免疫表觀（IPS）評分在組間的差異

討 論

近年來，ICI療法取得了飛速發(fā)展，其通過解除免疫檢查點對免疫活動的抑制，釋放機體的免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤作用［5］。因作用時程較長、安全性高、可有效緩解病程進展并能夠改善患者預后，ICI治療深刻改變了當前癌癥的治療格局［25-27］。但目前較低的應(yīng)答率限制了該種療法對宮頸癌患者的臨床獲益，我們?nèi)孕柽M一步探索新的標志物來預測或提升宮頸癌患者的ICI治療應(yīng)答率，進而充分發(fā)揮其治療潛力［28］。最近研究表明，lncRNA可被認為在免疫治療中發(fā)揮重要作用［13，29］。雖然lncRNA并不直接編碼能夠介導免疫過程的蛋白質(zhì)，但其可通過與組蛋白修飾酶、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后功能（如剪接、翻譯和降解）的相互作用，從而間接調(diào)節(jié)免疫細胞的分化和功能［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌免疫微環(huán)境中，Lnc-Tim3的表達在浸潤性CD8+T細胞中上調(diào)［30］。

既往研究表明，lncRNA與多種類型的腫瘤如乳腺癌［31］、肺癌［32］和肝癌［33］的免疫治療抵抗有關(guān)。其機制可能是lncRNA通過程序性死亡分子1（PD-1）/程序性死亡配體1（PD-L1）軸和抑制性抗原的呈遞來促進免疫治療耐藥性的產(chǎn)生。Zhao等［34］的研究表明，SNHG14/miR-55903p/ZEB1正反饋環(huán)通過調(diào)節(jié)PD-1/PD-L1檢查點來促進彌漫性大B細胞淋巴瘤的進展和免疫逃逸，這表明靶向SNHG14或許是提高免疫療法療效的潛在方法。此外，NKX2-1-AS1已被證明有助于通過負調(diào)節(jié)PD-L1來抑制免疫逃逸［35］?？傊?，lncRNA可能參與了機體對ICI治療抵抗的調(diào)控，對研究宮頸癌患者ICI治療的應(yīng)答具有重要意義。

在本項研究中，我們通過從TCGA數(shù)據(jù)庫得到的宮頸癌患者的基因及臨床數(shù)據(jù)，通過多因素回歸分析構(gòu)建了IRL模型。KM分析顯示其可作為宮頸癌患者的獨立預后因素。我們進一步探討了該模型與宮頸癌中免疫浸潤的關(guān)系。首先，通過基因組學的差異分析我們得到了1 831個差異表達基因，其中有多種免疫相關(guān)的基因在兩組之間差異表達，如CXCL9、CD52、CXCR1、IL2RA等。研究表明，CXCL9可通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的激活、遷移和分化等多種通路，發(fā)揮抗腫瘤功能［36］。此外，在乳腺癌中，CD52通過提高抗腫瘤免疫細胞的浸潤水平從而改善患者的預后［37］。為探索宮頸癌不同風險組間的免疫相關(guān)通路是否存在差異，對兩組間差異基因進行通路富集分析，結(jié)果表明高低風險組之間的免疫相關(guān)通路有著顯著不同，其中包括激活免疫反應(yīng)、重組免疫受體等多種免疫相關(guān)通路得到了顯著富集。進一步基于GSEA的分析揭示了多種與免疫相關(guān)的通路在低風險組中得到富集，如抗原的提呈與加工、細胞粘附分子等。此外，GSVA分析結(jié)果顯示在低分組中，干擾素反應(yīng)等多種抗腫瘤免疫通路更為活躍。

免疫治療的療效受腫瘤微環(huán)境的免疫原性的影響［38］。因此，對免疫微環(huán)境的了解或許是評估免疫治療可能性的關(guān)鍵［39-40］?；诜淳矸e的免疫算法對所有患者的免疫浸潤進行評價，我們發(fā)現(xiàn)不同風險組之間的免疫微環(huán)境存在著顯著差異。具體表現(xiàn)為幼稚B細胞、CD8+T細胞、濾泡輔助T細胞、M1型巨噬細胞在低風險組中浸潤水平較高。腫瘤相關(guān)抗原包括腫瘤因突變等原因產(chǎn)生的特異性新抗原和自身抗原可被CD8+T細胞識別并誘導抗腫瘤反應(yīng)。而濾泡輔助T細胞可以介導B細胞的分化和抗體的成熟過程。M1型巨噬細胞的上調(diào)可產(chǎn)生更多的促炎因子和趨化因子，通過釋放炎性介質(zhì)來促進炎性反應(yīng)，并刺激初始T細胞，介導Th1細胞毒性反應(yīng)，實現(xiàn)對腫瘤的拮抗作用。可見，該模型中低風險組患者抗腫瘤相關(guān)的免疫細胞浸潤增多，具有更強的抗腫瘤免疫功能。

免疫檢查點可通過抑制免疫細胞功能，使機體不能產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而形成免疫逃逸［41］。當免疫檢查點高表達時，針對免疫檢查點的抑制劑往往會帶來更佳的臨床獲益［42］。臨床研究KEYNOTE-010的結(jié)果顯示，對于PD-L1表達陽性的晚期非小細胞肺癌患者，相較于使用鉑類化療，接受帕博利珠單抗治療后總生存期得到了顯著延長，且表現(xiàn)出更少的不良反應(yīng)［43］。因此，我們探索了在不同風險組之間其免疫檢查點的表達水平是否存在差異，結(jié)果表明多種免疫檢查點如PDCD1、CTLA4、LAG3等在低風險組中表達水平更高，基于此模型的低風險組患者可能會收到更大的免疫治療獲益。我們使用了TIDE算法和IPS評分用于預測免疫治療應(yīng)答，結(jié)果顯示低風險組的患者對免疫療法或具有更好的反應(yīng)，風險分組間的評分差異進一步支持了上述研究的結(jié)論。

但本項研究仍然存在著一些局限性。該研究的結(jié)論是基于生物信息分析得出的，并未納入隊列來對所得結(jié)論做出驗證。未來需要在多中心大樣本研究隊列中進一步證實該模型的可靠性?？傊?，基于IRL的模型研究為預測宮頸癌患者免疫治療的應(yīng)答率及預后提供了新的見解。