苦參總黃酮對肝纖維化模型大鼠ALT、TBiL、PIIINP、LN、HA 水平的影響*

鄭 帥 于 雪 張 凱 李志平

（牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院藥學(xué)部，黑龍江 牡丹江 157011）

肝纖維化是指過度的細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）沉積和纖維性瘢痕形成導(dǎo)致的病變[1]，主要由病毒性肝炎、非酒精性肝炎等多種慢性肝病發(fā)展所致，若未有效治療可能發(fā)展為不可逆的肝病晚期，最終進(jìn)展為肝硬化甚至肝癌，威脅全球人類生命安全[2，3]。目前晚期肝纖維化的惟一治療方式是肝移植，但受限于供體、手術(shù)適應(yīng)證等，很多患者不能進(jìn)行手術(shù)[4]。已有研究[5]指出，及時去除病原體后，肝纖維化進(jìn)程可逐漸逆轉(zhuǎn)。然而無法消除潛在病因時，尋找有效的藥物針對肝纖維化進(jìn)行治療，對于改善預(yù)后很有必要?？鄥⒖傸S酮，是提取自中藥苦參的黃酮類活性成分，具有抗炎、抗病毒、抗纖維化等作用[6，7]。本研究構(gòu)建大鼠肝纖維化模型，觀察對肝纖維化模型大鼠丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBiL）、Ⅲ型前膠原氨基端原肽（PIIINP）、層粘連蛋白（LN）、透明質(zhì)酸（HA）水平的影響，為揭示苦參總黃酮逆轉(zhuǎn)肝纖維化的可能機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級48 只雄性SD 大鼠，體質(zhì)量270～290 g，由牡丹江醫(yī)學(xué)院提供，動物許可證編號：SCXK（黑）2019-003。

1.2 儀器與試劑 組織切片機(jī)（德國Leica 公司，HistoCore BIOCUT），蛋白電泳儀（美國BioRad 公司，VE-180A、VE-186），酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司，Infinite F200/M200），實(shí)時定量PCR 儀（美國ABI 公司，ABI 7500），熒光顯微鏡（德國Leica 公司，DM2500）。

苦參總黃酮[Chemegen（中國）公司，CN01012]，水飛薊素（盤錦華成制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H21022558），層粘連蛋白（Laminin，LN）試劑盒和透明質(zhì)酸試劑盒[Abcam（中國）公司，ab119573 和ab287799]；ALT 和PIIINP試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，D799579 和D111532]，TBiL 試劑盒（美國Cloud-Clone 公司，CEK522），cDNA 第一鏈合成試劑盒和定量PCR Premix 試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，KR118 和FP207]。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠肝纖維化模型制備 大鼠適應(yīng)1 周后，按照前期研究[8]灌胃1 mL/kg 肝纖維化誘導(dǎo)劑，每周2 次，8 周后對存活大鼠進(jìn)行超聲檢測，死亡大鼠取備用大鼠補(bǔ)足。大鼠肝臟中檢測到不規(guī)則、斑塊狀強(qiáng)回聲為造模成功。將36 只成模大鼠分為肝纖維化組、苦參總黃酮組和陽性藥（水飛薊素）組。正常組（12 只）同步灌胃生理鹽水。

1.3.2 動物給藥 按照前期研究，苦參總黃酮組給予400 mg/（kg·d）苦參總黃酮灌胃[8]；陽性藥組給予50 mg/（kg·d）水飛薊素灌胃[9]；正常組、肝纖維化組給予10 mL/（kg·d）生理鹽水灌胃，均在第9 周開始給藥，為期4 周。

1.3.3 取樣 分別干預(yù)1 周、4 周后麻醉大鼠（每個時間點(diǎn)6 只大鼠），于腹主動脈采血，離心后獲取血清；隨后處死大鼠，迅速開腹取肝，將右葉肝放在-80 ℃冷凍，用以熒光定量PCR 和Western blot 檢測；將中葉肝放在預(yù)冷4%多聚甲醛中固定，用以制備石蠟切片；左葉肝放在-80 ℃?zhèn)浞荽谩?/p>

1.4 觀察指標(biāo) 采用上述各試劑盒按照指導(dǎo)書，測定各組血清5 項(xiàng)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以（）描述計量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，用單因素方差分析行多組數(shù)據(jù)比較，用SNK-q 檢驗(yàn)行兩兩比較。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

干預(yù)1 周、4 周后，肝纖維化組、苦參總黃酮組和陽性藥組血清5 項(xiàng)水平較同期正常組高；干預(yù)4 周后，苦參總黃酮組和陽性藥組血清5 項(xiàng)水平較同期肝纖維化組低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。干預(yù)4 周后，肝纖維化組血清5 項(xiàng)水平較同組干預(yù)1 周后高，苦參總黃酮組和陽性藥組血清5 項(xiàng)水平較同組干預(yù)1周后低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P ＜0.05）。見表1。

表1 4 組大鼠血清A LT、TB iL、P IIIN P、LN、H A 水平比較（）

表1 4 組大鼠血清A LT、TB iL、P IIIN P、LN、H A 水平比較（）

3 討論

中醫(yī)學(xué)中沒有肝纖維化這一病名，根據(jù)其臨床特征將其歸于“脅痛”“臌脹”等范疇，主要由于各種慢性肝病后，肝失疏泄，導(dǎo)致肝內(nèi)氣血運(yùn)行失暢，失去“疏泄藏血”的生理功能，日久導(dǎo)致肝血瘀滯，而瘀血內(nèi)結(jié)、阻其肝用，加重肝血虧虛、肝血瘀滯，形成肝纖維化的病理基礎(chǔ)[10]?？鄥⑹纵d于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為中醫(yī)治療肝病的常用藥，包含苦參堿、黃酮類化合物等活性成分。研究[11]發(fā)現(xiàn)，苦參堿衍生物可減輕肝纖維化，抑制肝癌細(xì)胞分化[12]。我們前期發(fā)現(xiàn)，苦參總黃酮可減輕肝纖維化[8]，但是關(guān)于其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步探究。

膠原沉積為肝纖維化的典型特征，可直接呈現(xiàn)纖維化程度[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，干預(yù)1 周、4 周后，肝纖維化組肝細(xì)胞排列逐漸混亂，細(xì)胞大小不一，炎性細(xì)胞浸潤逐漸增多，膠原纖維不斷增多并逐漸沉積。干預(yù)1周、4 周后，肝纖維化組、苦參總黃酮組和陽性藥組血清5 項(xiàng)水平較同期正常組高（P ＜0.05）。干預(yù)4 周后，苦參總黃酮組和陽性藥組血清5 項(xiàng)水平較同期肝纖維化組低（P ＜0.05）。

綜上所述，苦參總黃酮可延緩并逆轉(zhuǎn)CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化，改善肝功能。