擬南芥ACOL8基因在乙烯合成與響應(yīng)中的功能分析

林蓉 鄭月萍 徐雪珍 李丹丹 鄭志富，

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，杭州 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)學(xué)院，杭州 311300）

乙烯是一種重要的植物內(nèi)源激素，在植物的生長發(fā)育及植物對逆境脅迫的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。植物體在種子萌發(fā)［1］、果實成熟［2］、花器官衰老［3］、葉片脫落［4］等生命進(jìn)程中以及受到機(jī)械損傷和逆境脅迫［5-6］時，能產(chǎn)生大量的乙烯，從而促進(jìn)植物器官成熟與衰老，影響植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。然而，乙烯的合成機(jī)制尚不完全清楚，這在一定程度上對植物生長發(fā)育與抗逆性的調(diào)控產(chǎn)生了限制作用。

1-氨基環(huán)丙烷羧酸是乙烯合成的直接前體，在ACC 氧化酶（ACC oxidase，ACO）的作用下轉(zhuǎn)化為乙烯，ACO 被認(rèn)為是乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶之一［7-8］。植物中存在一個ACO基因家族，其在多種植物生理生化活動中發(fā)揮重要作用，如擬南芥ACO1參與根系的發(fā)育［9］，玉米ACO2 能影響玉米穗長和籽粒產(chǎn)量［10］，番茄ACO1 和ACO4 在花梗脫落中發(fā)揮作用［11］等。同時，植物中還存在一個ACC 氧化酶同源家族，但目前對其功能知之甚少。有研究發(fā)現(xiàn)，番茄中編碼ACO 類似蛋白的E8 基因能參與乙烯的合成調(diào)控［12-13］。

擬南芥中存在12 個功能未知的ACC 氧化酶類似蛋白（ACO-like homolog，ACOL），其中ACOL8（ACO-like 8，At3g61400）與番茄E8 具有較高的相似性。利用TAIR 網(wǎng)站中的eFP Browser 工具，發(fā)現(xiàn)ACOL8 基因表達(dá)受茉莉酸誘導(dǎo)。為了探究ACOL8基因在乙烯合成與響應(yīng)過程中的作用，本研究運用CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)［14-15］，創(chuàng)制了該基因的功能喪失型突變體。突變體與野生型的比較分析顯示，ACOL8 基因參與乙烯的“三重反應(yīng)”與擬南芥耐鹽性的調(diào)控；同時還發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受乙烯信號的正反饋調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 材料

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-0 用于CRISPR/Cas9基因編輯載體的轉(zhuǎn)化；RNA 提取試劑盒購自全式金生物技術(shù)（北京）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR 試劑盒購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；BsaI 限制性內(nèi)切酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；pCBC-DT1T2 質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α和農(nóng)桿菌GV3101 由本實驗室保存；CRISPR/Cas9 載體由朱麗穎等［15］構(gòu)建，并由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥的培養(yǎng)方法

1.2.1.1 基質(zhì)培養(yǎng)法 按腐殖質(zhì)∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1（V∶V∶V）的比例制備土壤基質(zhì)。將在4℃春化3 d 的種子直播于基質(zhì)表面，加蓋保濕，于植物培養(yǎng)間培養(yǎng)，一周后揭蓋并進(jìn)行間苗。植物生長條件為室溫23-25℃，濕度50%-60%，光照14 h，黑暗10 h。

1.2.1.2 培養(yǎng)基培養(yǎng)法 進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)前需進(jìn)行擬南芥的種子滅菌，避免雜菌在培養(yǎng)基上大量滋生影響植物正常生長發(fā)育。取擬南芥種子置于1.5 mL離心管中，用1 mL 75%乙醇溶液消毒3 min，再用1 mL 含0.05% Tween 20 的35%漂白水滅菌5 min，用無菌ddH2O 清洗5 次。滅菌操作在超凈工作臺進(jìn)行。隨后將滅菌的種子在黑暗低溫（4℃）環(huán)境下春化，2-3 d 后點種于1/2MS 培養(yǎng)基上于在植物組織培養(yǎng)間培養(yǎng)，生長條件為室溫23-25℃，濕度50%-60%，光照14 h，黑暗10 h。

1.2.2 擬南芥ACOL8 基因突變體的構(gòu)建

1.2.2.1 sgRNA 靶位點選擇及引物設(shè)計 本研究以AT3G61400（ACOL8）基因為基礎(chǔ)設(shè)計靶序列，使用CRISPR 在線設(shè)計工具（http://www.genome.arizona.edu/crispr/ CRISPR search.html）根據(jù)原間隔序列臨近基序（PAM）序列，在外顯子的上下游選擇兩個ACOL8 基因的特異性靶序列，并根據(jù)靶序列設(shè)計兩個向?qū)NA（sgRNA1 和sgRNA2）（圖1，表1）。

表1 用于ACOL8 基因編輯的靶序列Table 1 Target sequences for ACOL8 gene editing

圖1 擬南芥ACOL8 基因結(jié)構(gòu)及基因編輯靶位點示意圖Fig.1 Diagram of the structure of Arabidopsis ACOL8 gene and the target sites for gene editing

1.2.2.2 sgRNA 表達(dá)盒的構(gòu)建 以稀釋100 倍的pCBC-DT1T2 質(zhì)粒（1 ng/μL）為模板，以ZYP210-F0、ZYP211-R0、ZYP209-BsF 和ZYP212-BsR（表2）為擴(kuò)增引物，進(jìn)行四引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR），在sgRNA 片段兩端分別克隆一個靶序列和BsaI 酶切位點序列，從而獲得具有2 個ACOL8 靶序列的sgRNA表達(dá)盒。對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢驗，并割膠回收目的片段。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

1.2.2.3 基因編輯重組載體的構(gòu)建 使用BsaI 限制性內(nèi)切酶酶切sgRNA 表達(dá)盒及由朱麗穎等［15］構(gòu)建的CRISPR/Cas9 載體，使用T4 連接酶將兩個酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，獲得含ACOL8 sgRNA 的基因編輯重組載體。將酶連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，使用菌落PCR 篩選大腸桿菌陽性轉(zhuǎn)化子并對其擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后對大腸桿菌菌液進(jìn)行質(zhì)粒抽提并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 菌株。

1.2.2.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染轉(zhuǎn)化擬南芥 使用含基因編輯重組載體的農(nóng)桿菌菌體重懸液浸染野生型擬南芥（Col-0）的花序進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本研究采用的基因編輯重組載體含種子特異性表達(dá)的熒光蛋白基因mCherry，可在藍(lán)色激發(fā)光下篩選呈紅色熒光的T1代轉(zhuǎn)基因陽性種子。

1.2.2.5ACOL8 靶向突變的突變體的分子鑒定 在兩個靶序列的上下游分別設(shè)計引物（表2），并使用這兩對引物分別對T1代陽性轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行兩個靶序列的PCR 擴(kuò)增，采用8%的非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳法（PAGE）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因分型鑒定。最后對電泳鑒定出的突變體植株進(jìn)行靶基因的測序鑒定，測序引物為ZYP237-FP 和ZYP240-RP（表2），本研究的測序結(jié)果均由擎科生物技術(shù)（杭州）有限公司提供。最后挑選不含紅色熒光的突變體種子，即去除了基因編輯載體的突變體株系作為試驗材料。

1.2.3 擬南芥的“三重反應(yīng)”分析 將滅菌后的種子分別點種于1/2 MS 固體培養(yǎng)基和含1 μmol/L ACC的1/2 MS 培養(yǎng)基上，作為對照組和處理組。使用封口膜密封后放入4℃冰箱，避光春化3 d。春化后將培養(yǎng)皿置于室溫22℃的黑暗條件下生長。3 d 后用體視顯微鏡觀察與拍攝不同基因型黃化幼苗的表型變化，隨后使用ImageJ 軟件測量黃化幼苗下胚軸及主根的長度。每個基因型擬南芥設(shè)置10 個以上生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差法分析不同基因型間的差異顯著性。

1.2.4 實時熒光定量PCR（qPCR） 對基質(zhì)培養(yǎng)28 d 的擬南芥的根系（n=10）進(jìn)行RNA 的提取。將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為實時熒光定量PCR 的模板。以ACTIN為內(nèi)參基因，對ACOL8 基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增。各引物序列見表3。本實驗使用BIO-RAD CFX9 manager 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并導(dǎo)出Ct 值。計算公式為：相對表達(dá)量=2-△△Ct。最后使用SPSS 19.0 進(jìn)行基于單因素方差（One way ANOVA）法分析不同株系間的差異顯著性。

表3 實時熒光定量PCR 引物序列Table 3 Sequences of the primers used in real-time fluorescent quantitative PCR

1.2.5 擬南芥的地上部鮮重測定 取播種后28 d 的植株剪取整個地上部，用電子天平測定其鮮重。每個株系設(shè)置6 個生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差法分析不同株系間的差異顯著性。

1.2.6 擬南芥的鹽處理試驗 挑選在1/2 MS 培養(yǎng)基上垂直生長7 d、長勢一致的野生型及突變體幼苗，移植于含不同濃度NaCl（0、75、125 mmol/L）的1/2 MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行垂直培養(yǎng)。鹽處理5 d 后，觀察表型并測定根長、根重、地上部生物量等生理指標(biāo)。根冠比的計算公式為：根冠比=根鮮重（mg）/地上部鮮重（mg）。每個處理設(shè)置10 個生物學(xué)重復(fù)，使用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差法分析不同基因型間的差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 ACC氧化酶類似蛋白的鑒定

在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫搜索擬南芥ACC 氧化酶及其類似蛋白，獲得5 個編碼ACC 氧化酶（ACO1-ACO5）和12 個編碼ACC氧化酶類似蛋白的基因，后者依次命名為ACOL1-12。ACOL基因編碼的氨基酸長度在345-398 aa 之間，同ACC 氧化酶氨基酸長度較相近（表4）。使用MEGA7 對這些氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對，并采用最大鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示ACOL1-ACOL5 和ACOL8 同ACO 家族成員的關(guān)系相對較親近（圖2），這促使我們推測一種可能性，即ACOL1-ACOL5 和ACOL8 可能具有ACC 氧化酶的類似功能。

圖2 ACC 氧化酶家族及其類似蛋白的系統(tǒng)樹圖分析Fig.2 A dendrogram analysis of members of the ACC oxidase family and ACO-like homologs

表4 編碼擬南芥ACC 氧化酶及其類似蛋白的基因特性Table 4 Characteristics of genes encoding Arabidopsis ACC oxidases and ACO-like homologs

為了進(jìn)一步了解這些基因的功能，利用擬南芥tair 網(wǎng)站中的eFP Browser 工具（http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）對不同ACOL基因的表達(dá)特性進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)正常生長條件下ACOL8 基因在植物體內(nèi)的表達(dá)量很低，但其表達(dá)受茉莉酸高度誘導(dǎo)。用10 μmol/L 的茉莉酸甲酯處理擬南芥幼苗0.5、1、3 h，該基因的表達(dá)量分別比對照增加2.5、4.4與2.2 倍，猜測在茉莉酸信號的誘導(dǎo)下ACOL8 基因可能通過影響ACC 的合成參與乙烯與茉莉酸的交互作用。因此，本文重點研究該基因的功能。

2.2 ACOL8基因突變體的構(gòu)建

為明確ACOL8 基因的功能，本研究使用CRIS-PR-Cas9 技術(shù)構(gòu)建了ACOL8 基因的功能喪失型突變體，隨后對之進(jìn)行表型分析。本研究設(shè)計的編輯位點sgRNA1 對應(yīng)的氨基酸位于蛋白質(zhì)的N 端，而sgRNA2 對應(yīng)的氨基酸位于ACC 氧化酶的保守基序處（圖3），這兩個氨基酸序列發(fā)生改變易導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)徹底改變。對突變植株的突變位點分析結(jié)果顯示，ACOL8 基因在兩個靶位點處均發(fā)生了編輯。本研究共計篩選出14 個不同編輯形式的純合突變體株系，其突變類型有3 種，包括堿基的缺失、堿基的插入以及DNA 片段的倒位。堿基的缺失包括1-30 bp 的中小片段的缺失及243 bp 的兩個靶序列間的DNA 大片段缺失。堿基的插入則是1-5 bp 的小片段插入，其中以1 bp 的插入為主。DNA 片段的倒位發(fā)生在兩個靶位點間，為237 bp 的DNA 大片段倒位。值得注意的是，sgRNA1 位點主要發(fā)生了在CDS 第65、66 位堿基中間的單堿基T 的插入突變，該堿基的插入在目標(biāo)序列上引入了終止子，即在mRNA 上引入終止密碼子UAA，使得翻譯過程提前終止。

圖3 ACC 氧化酶家族及ACOL8 的氨基酸序列比對Fig.3 Amino acid sequences alignment of the ACC oxidase family members and ACOL8

根據(jù)突變類型及特點，本研究從14 個純合突變體株系中選擇3 個突變體株系作為實驗材料進(jìn)行后續(xù)研究，并將其分別命名為acol8-1、acol8-2 和acol8-3（表5）。acol8-1 在sgRNA2 位點處有5 bp 的非3 的倍數(shù)堿基對的插入，使閱讀框發(fā)生改變，進(jìn)而導(dǎo)致了移碼突變，保守序列發(fā)生改變。acol8-2在sgRNA1 和sgRNA2 位點間發(fā)生了大片段的DNA的缺失，導(dǎo)致超過總氨基酸數(shù)1/5 的氨基酸殘基缺失，不能翻譯出完整的肽鏈。acol8-3 在sgRNA1 和sgRNA2 位點處各有1 堿基的插入，其中sgRNA1 位點處的單堿基插入引入了終止子，能使mRNA 的翻譯在ACOL8 蛋白的N 端提前終止（圖4，表5）。這3 個突變體株系的突變基因均不能編碼完整的ACOL8 蛋白，因此認(rèn)為其是ACOL8 的功能喪失型突變體。

表5 三個acol8 突變體的突變位點Table 5 Mutation sites in the three acol8 mutants

圖4 三個acol8 突變體的突變序列Fig.4 Mutated sequences in the three acol8 mutants

2.3 ACOL8基因突變體與野生型的“三重反應(yīng)”比較

為了揭示ACOL8 基因在乙烯生物合成過程中的潛在功能，利用經(jīng)典的乙烯“三重反應(yīng)”比較分析acol8 突變體和野生型擬南芥的黃化幼苗生長情況。結(jié)果顯示，ACOL8 的突變顯著促進(jìn)暗處理下黃化苗下胚軸及主根的伸長，acol8-1、acol8-2 和acol8-3 的下胚軸長度大約是野生型的2.5 倍，其主根長約為野生型的1.3 倍（圖5），這說明ACOL8 基因參與調(diào)控黃化幼苗的“三重反應(yīng)”。

在外源ACC 處理下，acol8 突變體和野生型擬南芥的下胚軸及主根長度均明顯下降。與野生型相比，acol8 突變體（除acol8-2 外）的主根長無顯著差異。然而，3 個突變體的下胚軸長度達(dá)到野生型的1.5 倍及以上（圖5）。此外，ACC 處理會使部分acol8 突變體黃化幼苗表現(xiàn)出子葉張開的典型去黃化特征（圖5-A）。上述結(jié)果顯示，ACOL8 的突變減弱了擬南芥對乙烯合成前體的響應(yīng)。一種可能的解釋是，ACOL8 的突變降低了內(nèi)源ACC 的合成，進(jìn)而影響乙烯信號響應(yīng)。

圖5 acol8 突變體與野生型擬南芥黃化幼苗的“三重反應(yīng)”比較Fig.5 Comparison of the “triple responses” of etiolated seedlings of wild type Arabidopsis and acol8 mutant

2.4 ACOL8基因的表達(dá)受乙烯信號正反饋調(diào)控

鑒于植物體內(nèi)乙烯的合成受乙烯信號的反饋調(diào)控，我們探究ACOL8 基因的表達(dá)是否受乙烯信號調(diào)控。于是，比較分析了野生型、etr1-3（乙烯受體ETR1 突變體，對乙烯不敏感）和EIN3ox 株系（EIN3 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥，表現(xiàn)出組成型乙烯反應(yīng)）中的ACOL8 表達(dá)水平，結(jié)果顯示etr1-3 的突變使ACOL8 基因的表達(dá)量下調(diào)了約87%，而乙烯信號途徑中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子EIN3的過表達(dá)則產(chǎn)生相反效應(yīng)，使ACOL8 基因表達(dá)量上調(diào)了近1 倍（圖6）。以上結(jié)果說明ACOL8 基因的表達(dá)受乙烯信號正反饋調(diào)控。

圖6 etr1-3 和 EIN3ox 與野生型擬南芥的ACOL8 基因相對表達(dá)量比較Fig.6 Comparison of the relative expressions of ACOL8 gene in the roots of wild type Arabidopsis and etr1-3 and EIN3ox line

2.5 ACOL8基因?qū)M南芥正常生長的影響分析

前面研究發(fā)現(xiàn)ACOL8 基因能影響擬南芥黃化幼苗對乙烯的響應(yīng)，且其表達(dá)受乙烯信號調(diào)控，于是我們進(jìn)一步比較分析了正常生長條件下ACOL8 基因突變體與野生型在整個生育期的表型差異。結(jié)果顯示，3 個突變體株系的地上部生長與野生型無明顯差異（圖7），說明ACOL8 基因并非擬南芥正常生長所必需的。

圖7 三個acol8 突變體與野生型擬南芥的表型比較Fig.7 Comparison of the phenotypes of wild type Arabidopsis and three acol8 mutants

2.6 ACOL8基因突變對擬南芥耐鹽性的影響

研究表明，雖然乙烯信號不是擬南芥正常生長所必需的，但它在鹽脅迫響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。若ACOL8 基因參與乙烯的合成，那么該基因的突變會導(dǎo)致擬南芥對鹽脅迫的響應(yīng)發(fā)生改變。因此，本研究進(jìn)一步探究了ACOL8 基因?qū)δ望}性的影響。結(jié)果顯示，在75 mmol/L NaCl 處理下，3 個acol8 突變體株系的根冠比均顯著小于野生型，其根冠比比野生型低了29%-40%（圖8-A）。根冠比反映了擬南芥生物量在地上部及根部的分配關(guān)系，根冠比增加有利于增強植物對逆境的適應(yīng)能力。ACOL8 基因的突變降低了鹽處理下擬南芥根冠比，其根部無法更好地吸收水分、營養(yǎng)物質(zhì)等以抵御鹽脅迫帶來的傷害，因而降低了擬南芥的耐鹽性。當(dāng)用高濃度NaCl（125 mmol/L）處理時，ACOL8 基因的突變會促進(jìn)擬南芥白化苗的產(chǎn)生，野生型擬南芥的白化率約為20%，而acol8 突變體的白化率則為30%-40%（圖8-B），該結(jié)果進(jìn)一步說明ACOL8 基因的突變降低了擬南芥的耐鹽性。以上結(jié)果暗示ACOL8 基因可能通過參與乙烯的合成影響擬南芥的耐鹽性。

圖8 acol8 突變體與野生型擬南芥的耐鹽性比較Fig.8 Comparison of salt tolerances of wild type Arabidopsis and acol8 mutants

3 討論

植物激素乙烯的合成機(jī)制尚不完全清楚，為了完善乙烯的合成機(jī)制，本文利用反向遺傳學(xué)探討ACOL8 基因在乙烯合成中的作用。本研究利用CRISPR/Cas9 技術(shù)高效靶向編輯ACOL8 基因，從發(fā)生編輯的突變體植株中選取3 個發(fā)生了無義突變或錯義突變的突變體，它們在各種生長條件下的表型一致，說明這些表型的產(chǎn)生的確是ACOL8 基因的突變引起的，這為剖析ACOL8 基因的功能提供可靠材料。

通過對ACOL8 基因功能喪失型突變體與野生型的比較分析，我們首先發(fā)現(xiàn)該基因參與調(diào)控經(jīng)典的乙烯“三重反應(yīng)”，這是因為在沒有外源ACC 處理條件下，黃化幼苗的下胚軸與主根長度因ACOL8基因的突變增加了；同時，該基因的突變降低了擬南芥黃化幼苗對外源ACC 的敏感性。其次，本研究發(fā)現(xiàn)該基因的表達(dá)受乙烯信號的正反饋調(diào)控，這體現(xiàn)于兩個方面：（1）因EIN3 基因的過表達(dá)引起的乙烯信號加強促進(jìn)了該基因的表達(dá)；（2）因ETR1 的突變導(dǎo)致的乙烯信號減弱產(chǎn)生了相反效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)得到了過去研究結(jié)果的支持，即乙烯信號可以正反饋調(diào)節(jié)乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)乙烯的合成［16-17］。再者，本研究發(fā)現(xiàn)ACOL8 基因的突變不影響擬南芥正常生長，但降低了擬南芥的耐鹽性，這與乙烯提高植物的耐鹽性［18-20］的觀點一致，因而不能排除這種可能性，即ACOL8 基因的突變減弱了鹽脅迫條件下的乙烯合成，從而影響擬南芥的耐鹽性。綜上所述，我們有理由推斷，ACOL8 可能具有ACC 氧化酶功能，參與乙烯的合成，進(jìn)而調(diào)控擬南芥對乙烯的響應(yīng)。然而，要徹底明確ACOL8 是否具有ACC 氧化酶的功能，還需要在生理生化水平上加以證實。一是，運用氣相色譜法分析特定條件下acol8 突變體與野生型體內(nèi)的乙烯含量差異，鑒定ACOL8 基因在乙烯合成中的作用；二是，對ACOL8基因進(jìn)行異源表達(dá)分析，鑒定其是否具有ACC 氧化酶的功能。

4 結(jié)論

運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功創(chuàng)制了多個ACOL8 基因的功能喪失型突變體。突變體與野生型的比較分析顯示，ACOL8 基因參與黃化幼苗生長及擬南芥耐鹽性的調(diào)控。該基因的表達(dá)受乙烯信號的正反饋調(diào)控，同時受茉莉酸信號的誘導(dǎo)，表明它在乙烯與茉莉酸互作過程中發(fā)揮某種作用。