轉(zhuǎn)基因玉米HGK60在不同遺傳背景下抗蟲性鑒定及農(nóng)藝性狀分析

李鵬程 張明俊 王銀曉 李香銀 李圣彥 郎志宏

（中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

玉米是重要的糧食作物、飼料和工業(yè)原料，種植面積與產(chǎn)量居三大農(nóng)作物之首。蟲害是造成玉米產(chǎn)量損失的重要因素，近年來全國玉米病蟲害發(fā)生總體偏重，亞洲玉米螟、草地貪夜蛾、棉鈴蟲、黏蟲是危害玉米的主要害蟲，在局部地區(qū)造成玉米產(chǎn)量重大損失［1］。目前我國防控玉米害蟲主要采用化學殺蟲劑，但化學殺蟲劑的大量使用伴隨著一系列的環(huán)境污染、害蟲抗藥性增加等生態(tài)問題。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)Bt（Bacillus thuringiensis）基因抗蟲玉米對有效防治玉米害蟲具有重要作用。

自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，轉(zhuǎn)基因作物種植面積增長迅速，2021年全球共有24 個國家種植了1.955 億hm2的轉(zhuǎn)基因作物，比2020年增加了3.7%（https://gm.agbioinvestor.com/）。轉(zhuǎn)基因玉米種植面積在6 000 萬hm2以上，僅次于轉(zhuǎn)基因大豆，其主要性狀為抗蟲和耐除草劑［2］。統(tǒng)計結(jié)果表明種植抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米可顯著增加玉米產(chǎn)量和經(jīng)濟效益，據(jù)估算如果抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米在我國商業(yè)化種植，GDP 可增加約86 億美元，玉米自給率可增加約2%［3］。目前抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米選用的殺蟲基因主要為蘇云金芽胞桿菌的cry類基因和vip類基因，其中防治鱗翅目害蟲的cry1Ab基因是應用最廣泛的殺蟲基因，例如先正達公司的Bt11、孟山都公司的MON810、大北農(nóng)公司的DBN9936 均含有cry1Ab基因，瑞豐125 含有cry1Ab與cry2Aj結(jié)構(gòu)域融合基因，瑞豐8 和ND207 含有cry1Ab與cry2Ab雙基因［4-5］。

我國在Bt 殺蟲基因的發(fā)掘和克隆等方面發(fā)展迅速，取得了較好的進展，為抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的研發(fā)提供了基因資源。Btcry1Ah基因是從蘇云金芽胞桿菌BT8 菌株中克隆獲得的，與cry1Ab基因同屬于cry1A家族，對亞洲玉米螟、棉鈴蟲、二化螟和小菜蛾等鱗翅目害蟲具有高毒性［6-7］。在前期工作中將cry1Ah基因轉(zhuǎn)入玉米，通過對轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化群體進行抗蟲性篩選，獲得對玉米螟高抗的轉(zhuǎn)化事件HGK60，對主要的玉米害蟲亞洲玉米螟和棉鈴蟲具有高殺蟲活性［8-10］。

Bt 殺蟲基因在植物轉(zhuǎn)化體中是否能夠正常的表達，以及在不同世代、不同回交轉(zhuǎn)育品系中能否穩(wěn)定表達受到多方面的影響，比如外源基因啟動子的選擇、基因在玉米基因組中插入位置、密碼子偏好性選擇、回交受體的遺傳背景以及不同的發(fā)育時期等［11］。前人研究表明，不同的遺傳背景條件下，Bt殺蟲蛋白的表達量會有不同，蛋白表達量和抗蟲性正相關［12-14］。因此研究Bt 基因在不同遺傳背景下的表達及抗蟲穩(wěn)定性，對轉(zhuǎn)Bt 抗蟲基因作物的應用推廣具有重要意義。

本研究利用轉(zhuǎn)Btcry1Ah基因玉米HGK60 回交轉(zhuǎn)育獲得的4 個自交系（HGK60-鄭58、HGK60-昌7-2、HGK60-lx03-2、HGK60-lx05-4）和雜交組合HGK60-鄭單958（HGK60-鄭58 × HGK60-昌7-2）和HGK60- 魯 單9066（HGK60-lx05-4 × HGK60-lx03-2），對其進行DNA 分子水平檢測、外源蛋白含量檢測、抗蟲性鑒定以及農(nóng)藝性狀調(diào)查，分析HGK60 的遺傳和抗蟲穩(wěn)定性，為我國生物育種工作提供一定的指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米材料 轉(zhuǎn)Btcry1Ah基因抗蟲玉米自交系HGK60-鄭58（BC6S3、BC6S4、BC6S5）、HGK60-昌7-2（BC6S3、BC6S4、BC6S5）、HGK60-lx03-2（BC6S3、BC6S4、BC6S5）、HGK60-lx05-4（BC6S3、BC6S4、BC6S5），玉米雜交種HGK60-鄭單958（HGK60-鄭58 × HGK60-昌7-2） 和HGK60- 魯單9066（HGK60-lx05-4 ×HGK60-lx03-2）及其玉米自交系鄭58 和昌7-2 由本實驗室保存，玉米自交系lx03-2 和lx05-4 由山東省農(nóng)業(yè)科學院玉米研究所孟昭東課題組提供。

1.1.2 試蟲材料 亞洲玉米螟蟲卵購自北京美延農(nóng)業(yè)科技有限公司。蟲卵置于人工培養(yǎng)箱（28℃）孵化。所有初孵幼蟲作為供試蟲源進行生物活性測定。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 試驗分小區(qū)種植，設置為3 次重復，每小區(qū)種植4 種轉(zhuǎn)基因玉米自交系以及2 種雜交組合及其對應的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩?，?2 種材料，每個材料種植20 行，行長為5 m，行距為0.6 m，株距0.25 m。

1.2.2 轉(zhuǎn)化體特異性PCR 鑒定 將供試玉米材料種植于大田，待玉米生長至V4 期時取4 種轉(zhuǎn)基因自交系（HGK60-鄭58、HGK60-昌7-2H、HGK60-lx03-2、HGK60-lx05-4）和2 種雜交組合（HGK60-鄭單958 和HGK60-魯單9066）以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?5 葉片速凍在液氮中，采用CTAB 法提取基因組DNA，選用轉(zhuǎn)化體特異性引物，引物序列為F: 5'-CGAAACAAGAAAAATGTTTCCTTAG-3' 和R：5'-GTGCGCGCTAGCTGGCGTGTT-3'，進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物長度為628 bp，擴增條件為：94℃ 5 min；94℃ 20 s，54℃ 20 s，72℃ 50 s，35 個循環(huán)；72℃5 min。

1.2.3 ELISA 檢測 選取種植于大田的轉(zhuǎn)基因玉米及受體玉米V6 期葉片，液氮保存。植物總蛋白的提取以及Cry1Ah 蛋白含量檢測，使用的是Cry1Ab/Cry1Ac ELISA 檢測試劑盒（AP 003，Envirologix，USA），將100 mg 玉米葉片研磨成粉末轉(zhuǎn)移至2.0 mL 離心管中，加入500 μL Extraction buffer 渦旋混勻，后續(xù)ELISA 步驟按照試劑盒說明書要求進行。Cry1Ah 標準蛋白濃度為1 000 ppb，制作標準曲線的推薦濃度為50、25、10、5、2、1 和0.5 ppb。

1.2.4 室內(nèi)抗蟲性鑒定 亞洲玉米螟的室內(nèi)抗蟲性鑒定參照劉曉貝等［14］的方法。玉米植株生長至V6期時，選取植株幼嫩心葉，用剪刀剪成1 cm2大小后放入24 孔接蟲板中，然后用毛筆輕輕挑起玉米螟初孵幼蟲放到接蟲板中，每孔接一頭幼蟲，每個材料3 次生物學重復，從第2 天開始觀察玉米螟初孵幼蟲的存活情況，連續(xù)觀察一周，并做好記錄和拍照。

1.2.5 田間抗蟲性鑒定 轉(zhuǎn)基因玉米生長至小喇叭口期時，將60 頭亞洲玉米螟初孵幼蟲接到玉米心葉中，非轉(zhuǎn)基因玉米作為陰性對照，3 d 后再接蟲一次，接蟲后第14 天和第21 天進行調(diào)查玉米被害情況。試驗設計、接蟲方法、調(diào)查方法、結(jié)果分析等按照《農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007》要求開展。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因玉米雜交組合農(nóng)藝性狀鑒定 分別在河北廊坊中國農(nóng)業(yè)科學院國際農(nóng)業(yè)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)園以及海南三亞中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所南繁基地種植配制好的雜交組合HGK60-鄭單958 和HGK60-魯單9066 以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩?。采用常?guī)的田間管理方式，不進行任何害蟲防治措施，除草、水肥按正常田間管理方式進行，待玉米收獲前測量株高穗位高，收獲后每個小區(qū)每個材料隨機選取40個玉米穗進行穗長、穗粗、禿尖長、穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重等農(nóng)藝性狀測量。使用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米特異性PCR鑒定

對回交獲得的4 個轉(zhuǎn)基因自交系（HGK60-鄭58、HGK60- 昌7-2、HGK60-lx03-2、HGK60-lx05-4）、2 個雜交種HGK60-鄭單958 和HGK60-魯單9066 以及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8 提取玉米基因組DNA，利用轉(zhuǎn)化體特異性擴增引物進行PCR 分析，以質(zhì)粒pm4AhG2 為陽性對照，鄭58 玉米基因組DNA 為陰性對照，ddH2O 為空白對照，檢測在不同的遺傳背景中外源基因cry1Ah是否穩(wěn)定插入，結(jié)果如圖1所示，在4 個轉(zhuǎn)基因自交系和2 個雜交種玉米中均能擴增出628 bp 的目標條帶，證明通過回交轉(zhuǎn)育的方式，Btcry1Ah抗蟲基因已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入到不同的玉米品種中。

圖1 利用轉(zhuǎn)化體特異性PCR 鑒定4 個轉(zhuǎn)基因自交系和2個雜交組合Fig.1 Detection of 4 transgenic inbred lines and 2 hybrid combinations using event-special PCR

2.2 不同遺傳背景轉(zhuǎn)基因玉米中Cry1Ah蛋白表達量

取大田生長至V6 期的轉(zhuǎn)基因玉米葉片通過ELISA檢測不同遺傳背景玉米中Cry1Ah蛋白表達量。結(jié)果顯示在4 個轉(zhuǎn)基因自交系和2 個雜交組合中，目的蛋白Cry1Ah 均有表達，而對照材料鄭58 中無目的蛋白表達。其中，在自交系HGK60-lx03-2 中目的蛋白的表達量最高，平均值達到了3 528.9 ng/g FW（鮮重），自交系HGK60-lx05-4 中目的蛋白的表達量最低，平均值為2 895.8 ng/g FW。研究表明在不同自交系或者雜交種中，Cry1Ah 蛋白表達量無顯著差異，cry1Ah基因在轉(zhuǎn)基因玉米中已連續(xù)遺傳10代以上，其表達量與低世代轉(zhuǎn)化體相比，Cry1Ah 蛋白的表達量沒有顯著變化［9］。

圖2 不同遺傳背景轉(zhuǎn)基因玉米葉片中Cry1Ah 蛋白表達分析Fig.2 Expression analysis of Cry1Ah protein in the transgenic maize leaves with different genetic backgrounds

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米室內(nèi)玉米螟抗蟲性鑒定

為了進一步檢測HGK60 轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲性，分別在海南三亞和河北廊坊兩年連續(xù)三代種植轉(zhuǎn)基因玉米，生長至V6 葉期時，取玉米心葉接蟲后進行室內(nèi)玉米螟抗蟲性鑒定，統(tǒng)計玉米螟死亡情況。連續(xù)3 代的玉米螟生測結(jié)果顯示HGK60 的4 個轉(zhuǎn)基因自交系和2 個轉(zhuǎn)基因雜交組合中，接蟲第2 天開始玉米螟幼蟲出現(xiàn)死亡，供試葉片HGK60 有微小蟲孔，接蟲第3 天，不同遺傳背景的HGK60 玉米已經(jīng)表現(xiàn)出高殺蟲活性，在2020年海南和2021年廊坊兩地死亡率達到了100%，在2021年海南的死亡率到90%以上，個別試蟲存活，但活力下降，接蟲第4 天，供試玉米螟死亡率達100%，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩咨嫌衩酌劳雎实陀?0%（表1）。

表1 亞洲玉米螟室內(nèi)生測結(jié)果Table 1 Results of laboratory bioassay of Asian corn borer（Ostrinia furnacalis）

2.4 轉(zhuǎn)基因玉米田間玉米螟抗蟲性鑒定

玉米螟室內(nèi)生測的同時，我們也在海南三亞和河北廊坊兩地連續(xù)三代進行了轉(zhuǎn)基因玉米田間玉米螟抗蟲性鑒定。在小喇叭口期向玉米心葉接玉米螟，每株玉米接蟲60 頭左右，第14 天和第21 天后觀察玉米葉片咬食情況，心葉抗蟲級別鑒定依據(jù)《農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007》中9 級分級標準，1 為高抗，9 為高感。結(jié)果表明4 種轉(zhuǎn)基因自交系及其配制的2種轉(zhuǎn)基因雜交種對玉米螟的抗性等級均在1-2 之間，為高抗級別，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談t在6 級和7 級，為感蟲級別（表2）。證明田間4 個轉(zhuǎn)基因自交系以及雜交種HGK60-鄭單958 和HGK60-魯單9066 對玉米螟高抗。

表2 小喇叭口期亞洲玉米螟的食葉級別Table 2 Leaf feeding grades of the Asian corn borer in the maize small trumpet stage

2.5 轉(zhuǎn)基因玉米雜交組合農(nóng)藝性狀

為了鑒定轉(zhuǎn)基因玉米在農(nóng)藝性狀上的是否與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼胁町?，連續(xù)三代對轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因玉米株高穗位高以及其他產(chǎn)量相關性狀進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明同一時期和地點的轉(zhuǎn)基因玉米雜交種HGK60-鄭單958 和HGK60-魯單9066 與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩妆容^時，株高、穗位高、穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、禿尖長、百粒重、單株產(chǎn)量上均無顯著差異（表3），同時在不同的地點（河北廊坊和海南三亞）之間農(nóng)藝性狀表現(xiàn)出差異，造成該結(jié)果的主要原因是兩地的自然條件存在明顯差異，通過連續(xù)三代的農(nóng)藝性狀分析說明轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩紫啾?，兩者之間農(nóng)藝性狀沒有顯著差異，外源基因的插入未對玉米受體材料農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響。

表3 轉(zhuǎn)基因玉米雜交組合農(nóng)藝性狀分析Table 3 Agronomic traits analysis of transgenic maize hybrid lines

3 討論

世界農(nóng)業(yè)育種技術(shù)的發(fā)展主要經(jīng)歷了原始育種階段、傳統(tǒng)育種階段及分子育種階段［15］。轉(zhuǎn)基因育種屬于第一代分子育種技術(shù)，是改變農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式最大的生物育種技術(shù)。2019-2022年我國已經(jīng)批準了11 個抗蟲、耐除草劑轉(zhuǎn)基因玉米的生產(chǎn)應用安全證書，產(chǎn)業(yè)化試點工作正穩(wěn)步推進中。在轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化應用中轉(zhuǎn)化體與回交轉(zhuǎn)育的玉米品種同等重要，在不同的玉米品種中外源基因是否可以穩(wěn)定遺傳、目標性狀是否穩(wěn)定、是否對玉米的農(nóng)藝性狀產(chǎn)生非預期影響等，這些問題的回答既需要針對不同轉(zhuǎn)化體和受體品種一一對應來觀察，也需要積累更多的研究數(shù)據(jù)，形成一些共性的結(jié)論，為轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)步推進和安全應用打好基礎。

回交轉(zhuǎn)育是將轉(zhuǎn)基因性狀導入商業(yè)化品種中所采用的最主要的方法。Venkatesh 等［16］將3 個不同性狀轉(zhuǎn)基因玉米（抗旱玉米MON 87460、耐草甘膦玉米NK603、抗蟲玉米MON 89034）分別回交轉(zhuǎn)育至6 個玉米骨干自交系，回交6 代后的轉(zhuǎn)育材料與受體親本基因型相似性理論值為99%，通過全基因組序列分析，不同回交轉(zhuǎn)育的自交系與受體親本基因型相似性在93.7%-99.35%之間。這表明通過多代的回交轉(zhuǎn)育可使轉(zhuǎn)育材料與親本基因型基本達到一致。在本研究中抗蟲玉米HGK60 已回交轉(zhuǎn)育自交系6 代并自交3 代，表型和基因型與親本材料趨于相同。通過轉(zhuǎn)化體特異性PCR 檢測，證明抗蟲基因已穩(wěn)定整合至玉米基因組中，4 個轉(zhuǎn)基因自交系及2 個雜交種與回交受體遺傳背景相同，具有轉(zhuǎn)基因性狀，是研究不同遺傳背景對目標性狀影響的合適材料。

在轉(zhuǎn)基因育種過程中，外源基因插入到受體基因組上之后，可能會發(fā)生基因重組、沉默甚至丟失，導致外源蛋白在不同受體品種中不能表達或表達量低從而影響轉(zhuǎn)基因性狀的表現(xiàn)［17］，因此選擇表達量高的受體品種是首要任務［18］。本研究選用的HGK60 轉(zhuǎn)基因玉米含有Bt 殺蟲基因cry1Ah，ELISA研究表明在不同玉米受體品種中Cry1Ah 蛋白表達量沒有顯著差異，六葉期葉片中Cry1Ah 蛋白表達為2 895.8 ng/g-3 528.9 μg/g，與宋苗等［9］在T2代檢測結(jié)果一致，說明cry1Ah基因在轉(zhuǎn)基因玉米中穩(wěn)定遺傳和穩(wěn)定表達?；贑ry1Ah 蛋白的穩(wěn)定表達，室內(nèi)抗蟲性鑒定結(jié)果說明，第3 天時玉米螟初孵幼蟲的死亡率達到100%，證明HGK60 轉(zhuǎn)基因玉米在不同遺傳背景下的殺蟲活性是穩(wěn)定的。Bt 蛋白在不同遺傳背景玉米中表達量存在波動情況，如王培等［19］采用ELISA 方法研究在不同遺傳背景下Cry1Ac 蛋白的表達量存在差異，波動范圍為44.07-438.00 ng/g FW，但不影響殺蟲效果。本研究導入4 個自交系和2 個雜交種中Cry1Ah 蛋白表達量沒有比較大的波動，抗蟲性穩(wěn)定。

本實驗室前期分別在海南三亞和河北廊坊兩地對轉(zhuǎn)HGK60 玉米鄭單958H 與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧相崋?58 進行接蟲處理后測量株高、穗位高、穗長、穗粗、單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)HGK60 玉米鄭單958H 的單株產(chǎn)量明顯高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧相崋?58，其余農(nóng)藝性狀除株高鄭單958H 要相對高一些外無顯著差異［10］。在本研究中轉(zhuǎn)基因雜交種HGK60-鄭單958 和HGK60-魯單9066 與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧舷啾龋旮吆退胛桓咭约肮氲乃腴L、穗粗、行粒數(shù)、粒行數(shù)、禿尖長等相比無顯著差異，說明cry1Ah基因的導入沒有影響玉米的農(nóng)藝性狀，但在3 地環(huán)境中HGK60-魯單9066 的百粒重和單株產(chǎn)量稍低于魯單9066 的百粒重和單株產(chǎn)量，差異不顯著，在下一步工作中需要增加試驗點和加大試驗群體來明確兩者是否存在差異以及差異產(chǎn)生的原因。

HGK60 玉米具有抗蟲性狀，對于蟲害發(fā)生不嚴重年份，轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米的產(chǎn)量沒有顯著差異，但在蟲害發(fā)生嚴重時，非轉(zhuǎn)基因玉米的穗部受害蟲危害嚴重，產(chǎn)量會顯著降低。本研究結(jié)果表明，在鄭單958 和魯單9066 背景下HGK60 轉(zhuǎn)基因玉米不會影響受體材料的農(nóng)藝性狀，并不能代表HGK60 轉(zhuǎn)育到其他受體材料中仍然會有同樣的結(jié)果，所以對于后續(xù)其他玉米品種的回交轉(zhuǎn)育還是需要進行評估。隨著轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米產(chǎn)業(yè)化臨近，優(yōu)異抗蟲轉(zhuǎn)化體需要導入更多的骨干自交系和雜交種中，在轉(zhuǎn)育過程中需重點關注外源基因遺傳穩(wěn)定性、抗蟲效果及對農(nóng)藝性狀的影響，使優(yōu)異轉(zhuǎn)化體和優(yōu)秀品種結(jié)合，保證轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)化穩(wěn)步推進。

4 結(jié)論

以轉(zhuǎn)Btcry1Ah基因的轉(zhuǎn)基因玉米HGK60 為供體，將cry1Ah基因分別導入4 個玉米自交系并雜交獲得2 個雜交種，cry1Ah基因在不同遺傳背景玉米中穩(wěn)定遺傳和表達；田間和室內(nèi)玉米螟抗蟲性鑒定表明不同遺傳背景的轉(zhuǎn)基因玉米對玉米螟高抗；不同遺傳背景轉(zhuǎn)基因玉米與其受體對照玉米相比，兩者之間農(nóng)藝性狀沒有顯著差異。