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    轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白的時(shí)空表達(dá)分析

    2023-02-02 06:46:32李東陽肖冰王晨堯楊現(xiàn)明梁晉剛吳孔明
    生物技術(shù)通報(bào) 2023年1期
    關(guān)鍵詞:瑞豐抗蟲殺蟲

    李東陽 肖冰 王晨堯 楊現(xiàn)明 梁晉剛 吳孔明

    (1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部科技發(fā)展中心,北京 100176;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所 棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,安陽 455000;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所,北京 100081)

    玉米(Zea mays)是我國(guó)最重要的糧食作物之一,也是畜牧業(yè)和飼料工業(yè)的主要原料,玉米產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展是國(guó)家糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品有效供給的重要保障[1-2]。在整個(gè)生育期內(nèi),玉米會(huì)受到多種害蟲的為害,嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。其中,亞洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)是玉米生產(chǎn)中的主要害蟲之一,在我國(guó)各玉米產(chǎn)區(qū)均有不同程度的發(fā)生,常年發(fā)生面積2 000 萬hm2以上[6-8]。室內(nèi)生測(cè)和田間抗性鑒定結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米對(duì)亞洲玉米螟具有很好的殺蟲效果和田間抗螟性[9-11]。轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米新品種不僅是防治農(nóng)業(yè)害蟲的有效途徑之一,而且有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境、提高農(nóng)民收入[3-4,12-13]。自1996年轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米首次商業(yè)化種植以來,全球已有超過200 個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米轉(zhuǎn)化事件被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)。根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications,ISAAA)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),2019年,全球31%的玉米是轉(zhuǎn)基因玉米,其中抗蟲玉米和抗蟲耐除草劑玉米種植面積5 590 萬hm2[1-15]。我國(guó)是玉米的主要生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó),對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米的研究一直都是研究熱點(diǎn)[16]。

    轉(zhuǎn)基因作物中外源Bt 殺蟲蛋白在特定器官和特定時(shí)間的表達(dá)具有明顯的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,且地域、環(huán)境等因素對(duì)外源殺蟲蛋白表達(dá)有一定的影響[9,17-21]。轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米的抗蟲性強(qiáng)弱與植株體內(nèi)的外源殺蟲蛋白含量密切相關(guān),因此,準(zhǔn)確定量出Bt 殺蟲蛋白在不同生育期和不同器官中的表達(dá)量,對(duì)于未來轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米產(chǎn)業(yè)化后的害蟲防治和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理具有重要意義[11,22]。

    轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125,是由杭州瑞豐生物科技有限公司/浙江大學(xué)共同研發(fā)的轉(zhuǎn)基因玉米轉(zhuǎn)化事件,2020年1月21 號(hào)獲得了在北方春玉米區(qū)的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全證書(生產(chǎn)應(yīng)用),是國(guó)產(chǎn)轉(zhuǎn)基因玉米的重要代表。瑞豐125 及相關(guān)衍生品系如能順利產(chǎn)業(yè)化,將為亞洲玉米螟、黏蟲(Mythimna separata)等玉米主要鱗翅目害蟲的防治提供可供選擇的新途徑,降低玉米種植成本,提升我國(guó)玉米競(jìng)爭(zhēng)力。

    為了明確瑞豐125 在不同地域、不同環(huán)境中的Bt 殺蟲蛋白的表達(dá)規(guī)律,本文以轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 和對(duì)照非轉(zhuǎn)基因玉米宏碩899 為研究對(duì)象,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)全面分析了不同地區(qū)種植環(huán)境下,Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白的表達(dá)量及變化規(guī)律。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    轉(zhuǎn)基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩缀甏T899 均由浙江大學(xué)/杭州瑞豐生物科技有限公司提供。瑞豐125 同時(shí)表達(dá)Cry1Ab/Cry2Aj和G10evo-EPSPS 蛋白,具有抗蟲和耐除草劑兩種特性。

    1.2 方法

    1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 兩個(gè)玉米品種分別在我國(guó)玉米種植區(qū)的9 個(gè)地點(diǎn)按照結(jié)構(gòu)庇護(hù)所方式進(jìn)行種植,種植和栽培方式均采用當(dāng)?shù)爻R?guī)耕作管理的模式進(jìn)行,本試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行兩年。9 個(gè)地點(diǎn)分別為:黑龍江哈爾濱(45°44'N,126°42'E)、吉林長(zhǎng)春(43°48'N,125°24'E)、遼寧沈陽(41°49'N,123°33'E)、河北廊坊(39°51'N,116°60'E)、山東煙臺(tái)(37°29'N,121°16'E)、河南新鄉(xiāng)(35°10'N,113°41'E)、湖北武漢(30°44'N,114°46'E)、貴州貴陽(26°38'N,106°38'E)、新疆庫(kù)爾勒(41°45'N,86°12'E)。

    瑞豐125 和宏碩899 兩種玉米材料各設(shè)3 次重復(fù),每個(gè)小區(qū)面積為200 m2(20 m×10 m),行距60 cm,株距25 cm,小區(qū)之間的間隔為1-1.5 m。

    1.2.2 田間取樣 在玉米生長(zhǎng)的不同時(shí)期,即拔節(jié)期(V6-V8)、抽雄期(VT)、吐絲期(R1)、成熟期(R4)等時(shí)期取樣,小區(qū)內(nèi)50%以上的植株進(jìn)入相應(yīng)生育期時(shí),判斷為該小區(qū)到達(dá)相應(yīng)采樣時(shí)間。每小區(qū)3點(diǎn)取樣,每點(diǎn)選取1 株進(jìn)入相應(yīng)時(shí)期的玉米植株,按不同部位分類采集樣品,同一小區(qū)同一部位樣品剪碎混合。

    采集的玉米組織樣品放入自封袋中,然后立即放入盛有干冰的泡沫盒內(nèi),帶回室內(nèi)轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。玉米各組織具體采樣方法如下:(1)葉片:選取幼嫩葉片,從葉片頂端開始截取20 cm 葉片,隨后剪成2.5 cm 小段;(2)雄穗:1 株玉米選取1個(gè)雄穗,隨后剪成2.5 cm 小段;(3)花絲:雌穗套袋,將雌穗連同套袋一起拿到無花粉的環(huán)境中,將花絲從雌穗上剪下,剪成2.5 cm 小段;(4)籽粒:在同一植株上隨機(jī)采集15 粒大小一致的幼嫩籽粒。

    1.2.3 Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量測(cè)定 采用Cry1Ab/Cry1Ac 酶聯(lián)免疫(ELISA)定量檢測(cè)試劑盒(Envirologix,Portland,USA,貨號(hào)10433)測(cè)定Cry1Ab/Cry2Aj 融合殺蟲蛋白的含量,按照說明書操作,具體方法參考Zhang 等[23]的研究,本研究中瑞豐125 中外源殺蟲蛋白Cry1Ab/Cry2Aj 含量以Cry1Ab 殺蟲蛋白含量為代表計(jì)為μg/g 鮮重。

    首先使用Retsch MM400 組織破碎儀(Retsch GmbH,Haan,Germany)將所有樣本在低溫下粉碎為粉末,然后保存在-80℃冰箱中。稱取0.4 g 組織粉末加入4 mL 提取液PBST(pH 為7.4、濃度為0.01 mol/L 的PBS+0.55% Tween 20),置于搖床上4℃過夜;12 000 r/min 離心15 min,取上清液,用提取液適量稀釋;將Cry1Ab 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋,在96 孔酶標(biāo)板每孔加入50 μL enzyme-conjugate Cry1Ab 后,分別加入50 μL 樣品、陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品,用封口膜將酶標(biāo)板封閉,輕搖混勻20-30 s,置于搖床上(200 r/min)1-2 h;用力棄去液體后,每孔加入200 μL 洗滌液,反復(fù)洗滌3 次后用吸水紙吸干;每孔加入100 μL 顯色底物,用封口膜將酶標(biāo)板密封,外覆錫箔紙避光,輕搖混勻20-30 s,室溫放置15-30 min;每孔加入100 μL 終止液終止反應(yīng),用Infinite M200 Pro 酶標(biāo)儀(Tecan,M?nnedorf,Switzerland)在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定OD 值。

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析 根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù),采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS Inc.,Chicago,USA)進(jìn)行方差分析,分析方法采用One-way ANOVA,多重比較方法采用LSD 法。

    2 結(jié)果

    2.1 瑞豐125不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量

    ELISA 測(cè)定結(jié)果表明,對(duì)照玉米宏碩899 中未檢出Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白;瑞豐125 在2019年各處理試驗(yàn)中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為0.590-6.716 μg/g 鮮重(表1),在2020年各處理試驗(yàn)中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為0.326-11.133 μg/g 鮮重(表2)。

    表1 瑞豐125 各生育期不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量Table 1 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages(2019)

    表2 瑞豐125 各生育期不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量Table 2 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages(2020)

    在兩年的試驗(yàn)中,2019年的廊坊、煙臺(tái)、新鄉(xiāng)和2020年的哈爾濱、長(zhǎng)春、沈陽、廊坊、煙臺(tái)、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)葉片>花絲>雄穗>籽粒的趨勢(shì);2019年的武漢、貴陽、庫(kù)爾勒和2020年的庫(kù)爾勒的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)花絲>葉片>雄穗>籽粒的趨勢(shì);2019年的長(zhǎng)春和2020年的武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)葉片>雄穗>花絲>籽粒的趨勢(shì);2019年的沈陽和2020年的貴陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量均呈現(xiàn)葉片>雄穗>籽粒>花絲的趨勢(shì);2019年的哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量呈現(xiàn)籽粒>葉片>花絲>雄穗的趨勢(shì)。整體上看,各地點(diǎn)種植的瑞豐125 呈現(xiàn)出葉片中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較低的規(guī)律。

    對(duì)于瑞豐125 在不同地點(diǎn)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量表達(dá)情況,2019年的結(jié)果顯示,V6-V8葉片中貴陽、哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,VT 雄穗中廊坊、武漢、沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R1 葉片中長(zhǎng)春、廊坊、沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R1 花絲中貴陽、武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R4 葉片中廊坊、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R4 籽粒中哈爾濱的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高。2020年的結(jié)果顯示,V6-V8 葉片中沈陽、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,VT雄穗中貴陽、武漢的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R1 葉片中沈陽、煙臺(tái)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R1 花絲中庫(kù)爾勒、新鄉(xiāng)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R4 葉片中新鄉(xiāng)、廊坊的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高,R4 籽粒中沈陽的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量較高。整體上看沒有明顯的空間變化規(guī)律。

    為了從整體上明確瑞豐125 不同器官之間Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量的規(guī)律,將9 個(gè)地點(diǎn)的數(shù)據(jù)平均后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如圖1所示。2019年和2020年的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量數(shù)據(jù)均表現(xiàn)出R4 葉片>V6-V8 葉片>R1 葉片>R1 花絲>VT 雄穗>R4 籽粒的趨勢(shì),R4 葉片Cry1Ab/Cry-2Aj 殺蟲蛋白含量為4.299 μg/g 鮮重(2019年)/4.734 μg/g 鮮重(2020年),R4 籽粒Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白含量為1.430 μg/g 鮮重(2019年)/1.210 μg/g 鮮重(2020年)。對(duì)于V6-V8、R1、R4 三個(gè)時(shí)期的葉片,Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量隨著生育期的延長(zhǎng),有略微的增長(zhǎng),但3 個(gè)時(shí)期之間的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量均沒有顯著性差異(P>0.05)。

    圖1 瑞豐125 不同生育期的不同器官中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量Fig.1 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different tissues at different growth stages

    2.2 不同地點(diǎn)種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量

    為了從整體上明確在不同地點(diǎn)種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量的變化規(guī)律,將9 個(gè)地點(diǎn)各器官樣品Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量平均后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果如圖2所示。在不同地點(diǎn)種植的瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量有差異,但整體差異較小。2019年各個(gè)地點(diǎn)Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量范圍為1.664-3.771 μg/g鮮重,貴陽高于其他地區(qū),但與長(zhǎng)春、沈陽、廊坊、煙臺(tái)、武漢沒有顯著性差異,庫(kù)爾勒顯著低于其他地區(qū)。2020年各個(gè)地點(diǎn)Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量范圍為2.423-4.605 μg/g 鮮重,沈陽顯著高于其他地區(qū),長(zhǎng)春、武漢低于其他地區(qū),但與廊坊、煙臺(tái)、貴陽、庫(kù)爾勒沒有顯著性差異。

    圖2 瑞豐125 在不同地點(diǎn)的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量Fig.2 Cry1Ab/Cry2Aj insecticidal protein expressions of Ruifeng 125 in different locations

    3 討論

    在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米中,Bt 殺蟲蛋白的表達(dá)量可能因組織類型、發(fā)育時(shí)期和環(huán)境狀況而異[24],了解Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化規(guī)律對(duì)害蟲的綜合防治和農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)管理具有重要意義。本研究通過測(cè)定在9 個(gè)地點(diǎn)種植的轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米瑞豐125 在各生育期不同器官Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量,明確了瑞豐125Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量的時(shí)空變化規(guī)律,有利于為其未來的商業(yè)化推廣和安全管理提供數(shù)據(jù)參考。

    2019-2020 兩年的試驗(yàn)結(jié)果表明,瑞豐125Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量在不同的玉米器官中差異較大,整體上看,葉片中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量較高而籽粒中Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量較低,隨著作物生長(zhǎng),葉片中Cry1Ab/Cry2Aj殺蟲蛋白表達(dá)量略有上升,結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[11,25-28]。孫紅煒等[11]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)cry1Ab /cry2Aj和g10evo-epsps基因玉米雙抗505-12-5 在玉米大喇叭口期、吐絲期、乳熟期,心葉中的Bt 殺蟲蛋白含量均高于根、莖。Liang 等[25]研究發(fā)現(xiàn),不同地點(diǎn)種植的轉(zhuǎn)cry1Ab和epsps基因抗蟲耐除草劑玉米DBN9936,葉片Bt 殺蟲蛋白含量高于花絲、雄穗、籽粒,籽粒中Bt 殺蟲蛋白含量較低。Trtikova 等[26]研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810 葉片、根部、莖稈、籽粒之間的Bt 殺蟲蛋白含量差異較大,組織之間Bt 殺蟲蛋白含量水平為葉片>根>莖>籽粒>花粉,且Bt 殺蟲蛋白含量隨生長(zhǎng)時(shí)期延長(zhǎng)而逐漸增加。劉允軍和王國(guó)英對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米97Y6 Cry1A殺蟲蛋白的含量進(jìn)行了分析發(fā)現(xiàn),葉片Bt 殺蟲蛋白含量顯著大于其他組織,且隨生育期呈增加趨勢(shì)[27]。Bilbo 等[24]測(cè)定了DKC64-24 等6 個(gè)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品種的不同組織Bt 殺蟲蛋白含量,發(fā)現(xiàn)Cry1F、Cry2Ab2 殺蟲蛋白含量在玉米葉尖大于花絲、籽粒,且不同年份之間有一定差異。Darvas 等[28]對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米MON810 進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn),花絲中Cry1Ab含量低于葉片、莖稈。

    本研究發(fā)現(xiàn)在9 個(gè)地點(diǎn)種植的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量有差異,但整體差異較小。2019年有6 個(gè)地點(diǎn)的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異,2020年有7 個(gè)地點(diǎn)的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量沒有顯著性差異,兩年中僅有個(gè)別地點(diǎn)出現(xiàn)偏高或偏低的情況。不同地點(diǎn)Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量之間存在的差異可能與當(dāng)?shù)貧夂驐l件、土壤狀況、耕作措施等有關(guān)。如Trtikova 等[26]研究表明轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米品系PAN 6Q-321B 和 PAN 6Q-308B(均為MON810 衍生品系)在冷/濕應(yīng)激下的Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量增加了4 倍,表明Cry1Ab 殺蟲蛋白表達(dá)水平與水分和溫度條件有關(guān)。王家寶等[29]以3 個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因棉花品種魯棉研15 號(hào)、魯S6177 和新棉33B為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)3 個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在追肥處理后增加29.7%,3 個(gè)品種轉(zhuǎn)基因抗蟲棉花的功能主莖葉、幼蕾、主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在積水處理后分別下降27.7%、29.9%、6.6%,新棉33B 的功能主莖葉、幼蕾、主莖老葉的Bt 殺蟲蛋白含量在干旱處理之后分別下降30.0%、37.0%、52.9%。Marquardt 等[30]發(fā)現(xiàn)土壤中氮含量與轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米DeKalb 61-19的Cry3Bb1 殺蟲蛋白表達(dá)量有一定的正相關(guān)性。Griffiths 等[31]發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米MEB307Bt(MON810 衍生品系)中的Cry1Ab 殺蟲蛋白表達(dá)量在不同類型土壤中具有顯著性差異,且不同時(shí)期的葉片中Cry1Ab 殺蟲蛋白表達(dá)量在施用溴氰菊酯后均顯著增加。由于本研究的9 個(gè)地點(diǎn)之間氣候條件、土壤狀況等相差較大,而且測(cè)定環(huán)境、取材方法、人員操作習(xí)慣、樣品儲(chǔ)存環(huán)境等均會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生一定影響,導(dǎo)致不同地點(diǎn)的Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量之間存在微小差異,個(gè)別地點(diǎn)如貴陽、庫(kù)爾勒、沈陽在試驗(yàn)中出現(xiàn)Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量偏高或偏低的情況。

    亞洲玉米螟、黏蟲等鱗翅目害蟲是我國(guó)玉米生產(chǎn)上最嚴(yán)重的生物脅迫問題,玉米螟在東北春玉米區(qū)和新疆南疆等地主要為1、2 代危害,在黃淮海夏玉米區(qū)主要為3 代危害,黏蟲主要以2、3 代連續(xù)危害[8],瑞豐125 在拔節(jié)期(V6-V8)、吐絲期(R1)、成熟期(R4)的葉片中Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量相對(duì)較高,有利于對(duì)1、2 代玉米螟和黏蟲的防治。本研究中測(cè)定的籽粒、花絲、雄穗等玉米繁殖器官的Bt 殺蟲蛋白含量略低于葉片,與前人研究結(jié)果一致,但相關(guān)的抗蟲試驗(yàn)表明瑞豐125 無論是在心葉期還是穗期,對(duì)玉米螟、黏蟲均具有高抗水平[11,32]。翁綠水等[20]在對(duì)抗蟲水稻Bt 殺蟲蛋白的研究中指出,雖然Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量在不同時(shí)期、不同組織中存在差異,但目前研發(fā)的抗蟲植物品種足以有效控制目標(biāo)害蟲的危害。但由于植物中Bt 殺蟲蛋白表達(dá)規(guī)律的復(fù)雜性,未來的研究中抗蟲性生物測(cè)定也是不可或缺的。除此之外,9 個(gè)不同地點(diǎn)種植的瑞豐125的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量整體差異較小,表示瑞豐125 可能在不同的玉米生產(chǎn)區(qū)具有相對(duì)一致的害蟲防治效果,對(duì)其產(chǎn)業(yè)化具有重要意義。

    轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米中的Bt 殺蟲蛋白表達(dá)量受各種因素影響,導(dǎo)致Bt 殺蟲蛋白在時(shí)間上和空間上的分布不均勻,而低劑量的Bt 殺蟲蛋白可能會(huì)增加靶標(biāo)害蟲的生存幾率,引起靶標(biāo)害蟲的抗性風(fēng)險(xiǎn)增加[24]。靶標(biāo)害蟲對(duì)Bt 殺蟲蛋白的抗性問題是對(duì)影響B(tài)t 作物可持續(xù)推廣的最大因素,靶標(biāo)害蟲的抗性治理是轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)應(yīng)用的重要環(huán)境問題[33]。為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因作物的可持續(xù)應(yīng)用,有效阻止或延緩靶標(biāo)害蟲抗性種群的發(fā)生,各國(guó)科學(xué)家提出了抗性治理策略IRM(insect resistance management),目前應(yīng)用最廣泛的主要有“高劑量/庇護(hù)所”(high dose/refuge)策略和“多基因”(pyramid)策略[34]。在“高劑量/庇護(hù)所”策略中,在Bt 作物周邊種植一定面積的非Bt 作物,提供足夠數(shù)量的敏感個(gè)體,與來自Bt 作物區(qū)存活的少量抗性純合子個(gè)體進(jìn)行自由交配,產(chǎn)生的雜合子個(gè)體后代能被高劑量表達(dá)Bt殺蟲蛋白的抗蟲作物殺死,達(dá)到稀釋抗性基因的目的[35]。轉(zhuǎn)Bt基因玉米表達(dá)高劑量Bt 殺蟲蛋白是策略成功實(shí)施的關(guān)鍵。高劑量Bt 殺蟲蛋白能夠殺死靶標(biāo)害蟲中的100%隱性敏感純合(ss)個(gè)體和99%抗性雜合(sr)個(gè)體,僅有抗性純合(rr)個(gè)體可能存活[32,36-39]。“高劑量/庇護(hù)所”策略主要分為3 種形式:結(jié)構(gòu)庇護(hù)所(structured refuges)、種子混合庇護(hù)所(seed blends)、自然庇護(hù)所(natural refuge)。結(jié)構(gòu)庇護(hù)所為Bt 作物和非Bt 作物分別以塊狀模式種植來降低害蟲的抗性進(jìn)化速度,種子混合庇護(hù)所為種植之前均勻混合Bt 作物種子和非Bt 作物種子,自然庇護(hù)所是指可以提供敏感害蟲的雜草或其他栽培植物[40]。在“多基因”策略中,在同一株植物中同時(shí)導(dǎo)入兩個(gè)或多個(gè)沒有交互抗性的針對(duì)同一靶標(biāo)害蟲的抗蟲基因,使得轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生抗性的風(fēng)險(xiǎn)減小,可有效延緩抗性的產(chǎn)生和發(fā)展[36-37,40]。瑞豐125 可以同時(shí)表達(dá)Cry1Ab 和Cry2Aj 兩種不同類型的殺蟲蛋白,與僅含單一Bt 殺蟲蛋白的植株相比,這種“多基因”作物對(duì)害蟲的抗性治理起到積極的作用。

    4 結(jié)論

    轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj和g10evo-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白呈現(xiàn)出葉片中表達(dá)量較高,而籽粒中表達(dá)量較低的規(guī)律,不同地點(diǎn)種植的瑞豐125 的Cry1Ab/Cry2Aj 殺蟲蛋白表達(dá)量有所差異,但差異整體較小,表明瑞豐125 具有良好的應(yīng)用前景。本研究可為未來瑞豐125 的商業(yè)化推廣、構(gòu)建Bt 玉米防控技術(shù)體系、庇護(hù)所策略實(shí)施、安全管理等提供數(shù)據(jù)支撐和參考。

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