轉基因玉米2HVB5的性狀鑒定及遺傳穩(wěn)定性分析

李圣彥 李香銀 李鵬程 張明俊 張杰 郎志宏

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所 植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

玉米是我國重要的食物、飼料和工業(yè)原料。隨著人民生活水平不斷提高，對玉米的需求量也不斷增加。據(jù)統(tǒng)計，近20年來我國玉米種植面積和產(chǎn)量分別增長了170%和228%，成為我國第一大作物［1］。但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中蟲害一直是影響玉米產(chǎn)量和品質的重要因素，我國玉米的主要害蟲包括亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）、東方粘蟲（Mythimna separate）、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）等。亞洲玉米螟俗稱鉆心蟲，屬鱗翅目螟蛾科，在我國各地均有發(fā)生，可危害玉米植株地上各個部分［2］。東方粘蟲，屬鱗翅目夜蛾科，低齡幼蟲食量較小，高齡幼蟲進入暴食階段，可在短時間內(nèi)將大面積作物葉片吃光，繁殖能力較強［3］。棉鈴蟲，屬鱗翅目夜蛾科，多食性害蟲，第4 代棉鈴蟲主要危害玉米雌穗，嚴重影響雌穗和籽粒生長［4］。草地貪夜蛾，屬鱗翅目夜蛾科，2019年入侵我國云南，因其適生區(qū)域廣、寄主范圍寬、增殖潛能強、擴散速度快等特點，已經(jīng)成為一種嚴重威脅玉米生產(chǎn)的害蟲［5］。

隨著生物技術的發(fā)展，Bt 作物的應用為害蟲防治開辟了新的途徑。自1996年第一例轉基因玉米Bt176 商業(yè)化以來，轉基因玉米在全球得到廣泛應用，取得了十分顯著的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益［6］。國外轉基因玉米研究起步較早，發(fā)展十分迅速，目前商業(yè)化種植的抗蟲轉基因玉米主要有轉cry1Ab基因的MON810、Bt11，轉cry1Fa2基因的TC1507，轉cry2Ab2和cry1A.105基因的MON89034，轉vip3Aa20基因的MIR162 等，耐除草劑轉基因玉米主要有轉cp4-epsps基因的NK603，轉mepsps基因的GA21等［6］。我國一直高度重視作物轉基因技術的研究，已經(jīng)培育出一批轉基因玉米新品系。2019-2021年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相繼批準了轉cry1Ab和epsps基因的抗蟲耐除草劑玉米DBN9936，轉cry1Ab/cry2Aj和g10evoepsps基因的抗蟲耐除草劑玉米瑞豐125，轉epsps和pat基因的耐除草劑玉米DBN9858，轉vip3Aa19和pat基因的抗蟲耐除草劑玉米DBN9501，轉mcry1Ab和mcry2Ab基因的抗蟲玉米ND207，轉cry1Ab和cry2Ab基因的抗蟲玉米瑞豐8 以及抗蟲耐除草劑玉米DBN3601T（DBN9936×DBN9501）的安全證書，標志著國產(chǎn)轉基因玉米即將進入產(chǎn)業(yè)化應用。

Btcry2Ah基因是國內(nèi)研究團隊通過宏基因組方法克隆出的一種新的Bt 殺蟲蛋白基因，Cry2Ah 蛋白對玉米螟、棉鈴蟲和Cry1Ac 抗性棉鈴蟲有抑制活性［7］，并且與Cry1Ac、Cry1Ab 無交互抗性［8］。前期研究中，通過基因突變獲得了Cry2Ah 的兩個突變體Cry2Ah-vp（V354VP）和Cry2Ah-sp（V354SP），在煙草中分別表達cry2Ah及cry2Ah-vp、cry2Ah-sp基因，結果表明與Cry2Ah 相比，突變體Cry2Ah-vp 和Cry2Ah-sp 對棉鈴蟲和抗性棉鈴蟲具有更高的殺蟲活性［9］。隨后分別將cry2Ah-vp/bar和cry2Ah-sp/bar基因轉入玉米中，通過抗蟲性篩選得到一個含cry2Ahvp/bar基因高抗東方粘蟲的轉基因玉米事件VP1-5（即2HVB5），為抗蟲耐除草劑玉米的培育提供了種質資源［10］。

在本研究中對已回交轉育至骨干自交系鄭58的BC5S1、BC5S2代2HVB5 材料進行Southern blot、ELISA、抗蟲性（東方粘蟲、棉鈴蟲和草地貪夜蛾）、草銨膦耐受性檢測以及農(nóng)藝性狀調(diào)查，分析2HVB5材料的遺傳穩(wěn)定性和目標性狀功能效率，為抗蟲耐除草劑轉基因玉米2HVB5 的產(chǎn)業(yè)化應用提供理論基礎和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 玉米材料 玉米自交系鄭58（簡稱Z58）和回交轉育鄭58 的BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 材料，以上材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所郎志宏實驗室保存。

1.1.2 供試昆蟲 東方粘蟲、棉鈴蟲、草地貪夜蛾蟲卵均購自美延（北京）農(nóng)業(yè)科技有限責任公司，蟲卵置于人工培養(yǎng)箱（28℃）孵化。所有初孵幼蟲作為供試蟲源進行生物活性測定。

1.2 方法

1.2.1 Southern blot 檢測 分別提取BC5S1、BC5S2代2HVB5 轉基因玉米和對照材料鄭58 自交系的葉片基因組DNA，2HVB5 基因組DNA 分別用Hind III 和SacI 酶切，對照鄭58 基因組DNA 用Hind III 酶切，37℃酶切完全后將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并轉膜。cry2Ah-vp基因探針（正向引物：5'-GAGTGGATGGAGTGGAAG-3'，反向引物：5'-CGATGTTTGGGAAGGTCT-3'）和bar基因探針（正向引物：5'-GACGCACAATCCCACTATCCT-3'，反向引物：5'-CAGCGACCACGCTCTTGAAGC-3'） 按照PCR DIG Probe Synthesis Kit 說明書進行制備。Southern blot 檢測按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II 說明書進行操作。利用超靈敏多功能成像儀對DNA 雜交信號進行圖像分析。

1.2.2 ELISA 檢測 選取BC5S1、BC5S2代2HVB5 轉基因玉米和對照材料鄭58 苗期（V1）的根、葉，拔節(jié)期（V6）的根、莖、葉，吐絲期（R1）的根、莖、葉、花粉、雄穗、花絲、雌穗，完熟期（R6）的根、莖、葉、籽粒共4 個時期16 個部位的組織材料進行總蛋白的提?。? 次生物學重復）。選用Envirologix Quantiplate Kit for Cry2A（Catalog Number AP 005）檢測Cry2Ah 蛋白的表達量及Envirologix Quantiplate Kit for PAT/bar（Catalog Number AP 013）檢測PAT 蛋白的表達量。操作步驟按照相應試劑盒的說明書進行。使用多功能酶標儀FlexStation3（450 nm 檢測波長，630 nm 參考波長）測定樣品OD 值，根據(jù)標準曲線計算Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白的表達量。

1.2.3 室內(nèi)生物活性測定 東方粘蟲和草地貪夜蛾的室內(nèi)生測分別參照王振營等［11］和武奉慈等［12］的方法，取玉米V6 時期心葉剪成1 cm2左右的小片，放入24 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接1 頭初孵幼蟲，3次生物學重復，接蟲48 h 后每天統(tǒng)計1 次存活幼蟲數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計至7 d。棉鈴蟲室內(nèi)生測參照常雪艷等［13］的方法，取玉米吐絲期的花絲和雌穗分別剪成小段，放入12 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接1 頭棉鈴蟲初孵幼蟲，3 次生物學重復，接蟲48 h 后每天統(tǒng)計1 次存活幼蟲數(shù)，連續(xù)統(tǒng)計至7 d。每天統(tǒng)計結果時根據(jù)玉米材料的取食和新鮮程度及時更換新的材料。

1.2.4 田間生物活性測定 依據(jù)《轉基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007）進行2HVB5 轉基因玉米對東方粘蟲和棉鈴蟲的田間抗蟲性檢測。在玉米V6 期進行東方粘蟲的接蟲，接蟲20 d 后調(diào)查葉片為害程度并判定2HVB5 對東方粘蟲的抗性水平。在玉米吐絲期進行棉鈴蟲的接蟲，接蟲20 d 后調(diào)查雌穗為害程度并判定2HVB5 轉基因玉米穗期對棉鈴蟲的抗性水平。每小區(qū)人工接蟲不少于40 株。

1.2.5 草銨膦耐受性檢測 依據(jù)《轉基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測 抗除草劑玉米 第1 部分：除草劑耐受性》（農(nóng)業(yè)部953 號公告-11.1-2007）對2HVB5轉基因玉米的田間目標除草劑（草銨膦）耐受性進行檢測。草銨膦除草劑施用量分別為農(nóng)藥登記標簽中劑量的1 倍（600 g/hm2）、2 倍（1 200 g/hm2）、4倍（2 400 g/hm2）。按推薦時間施用。分別在用藥1、2、4 周調(diào)查和記錄成苗率、植株高度、藥害癥狀。藥害癥狀分級按GB/T 19780.42 執(zhí)行。

1.2.6 農(nóng)藝性狀調(diào)查 每個材料隨機選取30 株，吐絲后測量株高、穗位高。收獲后進行考種，測量穗長、穗粗、禿尖長、穗行數(shù)、行粒數(shù)、千粒重及單株產(chǎn)量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)整理，用SAS 9.4 數(shù)據(jù)處理軟件進行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性比較均采用成組法t檢驗。

2 結果

2.1 轉基因玉米2HVB5的Southern blot分析

Southern blot 檢測了連續(xù)兩代（BC5S1、BC5S2）轉基因玉米2HVB5 的外源基因插入情況，結果（圖1）顯示，2HVB5 基因組DNA 在Hind III 和SacI 酶切后以目的基因cry2Ah-vp和bar為探針都只檢測到一條雜交條帶，且兩代之間條帶大小沒有差別，對照鄭58 未檢測到雜交信號。這表明2HVB5 中目的基因cry2Ah-vp和bar都是以單拷貝的形式整合到玉米基因組并穩(wěn)定遺傳。

圖1 BC5S1、BC5S2 代轉基因玉米2HVB5 中目的基因的Southern blot 檢測Fig.1 Southern blot analysis of the target genes in the BC5S1 and BC5S2 generation of transgenic maize 2HVB5

2.2 轉基因玉米2HVB5中目的蛋白的定量分析

ELISA 檢測結果（圖2）顯示，轉基因玉米2HVB5 的不同時期、不同組織部位的目的蛋白Cry2Ah-vp 和PAT 均有表達，不同代別之間差異不顯著，而對照材料鄭58 未檢測到目的蛋白。除花粉外，Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白在2HVB5 不同時期的葉片中表達量相對較高，BC5S1代葉片中Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白表達量分別在2.38-3.29 μg/g FW（鮮重）和8.24-16.85 μg/g FW（鮮重）之間；BC5S2代葉片中Cry2Ah-vp 和PAT 蛋白表達量分別在2.24-3.31 μg/g FW（鮮重）和11.49 -16.46 μg/g FW（鮮重）之間。

圖2 BC5S1、BC5S2 代轉基因玉米2HVB5 中目的蛋白表達量分析Fig.2 Expression analysis of target proteins in the BC5S1 and BC5S2 generation of transgenic maize 2HVB5

2.3 轉基因玉米2HVB5的抗蟲性分析

室內(nèi)生物活性檢測結果（圖3）顯示，BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 心葉接東方粘蟲初孵幼蟲2 d 后，幼蟲校正死亡率分別為50.42%和57.83%；3 d 后幼蟲校正死亡率分別為95.65%和97.03%；4 d 后東方粘蟲幼蟲全部死亡。BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 雌穗接棉鈴蟲初孵幼蟲2 d 后，幼蟲校正死亡率分別為50.42%和54.17%；3 d 后幼蟲校正死亡率分別為70.83%和83.33%；4 d 后幼蟲校正死亡率分別為96.65%和91.67%；5 d后棉鈴蟲幼蟲全部死亡。BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 花絲接棉鈴蟲初孵幼蟲2 d 后，幼蟲校正死亡率分別為50.76%和56.25%；3 d 后幼蟲校正死亡率分別為88.64%和83.75%；4 d 后棉鈴蟲幼蟲全部死亡（圖3-a）。2HVB5 的葉片、雌穗和花絲只受到輕微損傷，而對照材料鄭58 取食嚴重，兩者對比差異顯著（圖3-b）。BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 心葉接草地貪夜蛾初孵幼蟲3 d 后，幼蟲有死亡，7 d 后草地貪夜蛾幼蟲校正死亡率分別為25.08%和20.83%（圖4-a）；但與對照Z58 相比，轉基因玉米2HVB5 對草地貪夜蛾幼蟲有明顯的體重抑制，飼喂BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 的草地貪夜蛾幼蟲體重分別下降71.36%和80.83%（圖4-b），幼蟲活力下降不能進一步完成生長發(fā)育。室內(nèi)生物活性檢測結果表明，轉基因玉米2HVB5 對亞洲玉米螟、東方粘蟲和棉鈴蟲的抗性水平均達到“高抗”，對草地貪夜蛾具有顯著的生長抑制作用。

圖3 BC5S1、BC5S2 代轉基因玉米2HVB5 的東方粘蟲和棉鈴蟲室內(nèi)生物活性檢測結果Fig.3 AW and CB bioassay results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 in laboratory

圖4 BC5S1、BC5S2 代轉基因玉米2HVB5 的草地貪夜蛾室內(nèi)生物活性檢測結果Fig.4 FAW bioassay results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 in laboratory

田間生物活性檢測結果顯示，根據(jù)《轉基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007）中玉米葉片受粘蟲為害程度的分級標準，BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5的V6期東方粘蟲的食葉級別分別為1.19和1.29，而對照材料鄭58 的V6 期東方粘蟲食葉級別分別為7.10 和7.05，兩者差異極顯著。根據(jù)《轉基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007）中玉米對粘蟲的抗性評價標準，2HVB5 轉基因玉米對東方粘蟲的抗性級別為“高抗”，對照鄭58 對東方粘蟲的抗性級別為“感”（表1）。根據(jù)《轉基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007）中玉米雌穗受棉鈴蟲為害程度的分級標準，BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 的吐絲期棉鈴蟲的食穗級別分別為0.60和0.73，而對照材料鄭58 的吐絲期棉鈴蟲的食穗級別分別為3.20 和3.97，兩者差異極顯著。根據(jù)《轉基因植物及其產(chǎn)品環(huán)境安全檢測 抗蟲玉米 第1 部分：抗蟲性》（農(nóng)業(yè)部953 號公告-10.1-2007）中玉米雌穗對棉鈴蟲的抗性評價標準，2HVB5 轉基因玉米對棉鈴蟲的抗性級別為“高抗”，對照鄭58 對棉鈴蟲的抗性級別為“中抗”（表2）。田間生物活性檢測結果表明，轉基因玉米2HVB5 對東方粘蟲和棉鈴蟲的抗性水平均達到“高抗”，與室內(nèi)生物活性檢測結果一致。

表1 心葉期東方粘蟲食葉級別Table 1 Leaf damage grades of AW at whorl stage

表2 吐絲期棉鈴蟲食穗級別Table 2 Ear damage grades of CB at silking stage

2.4 轉基因玉米2HVB5的草銨膦耐受性分析

草銨膦耐受性檢測結果顯示BC5S1、BC5S2代轉基因玉米2HVB5 在中劑量1 倍（600 g/hm2）、中劑量2 倍（1 200 g/hm2）和中劑量4 倍（2 400 g/hm2）的草銨膦處理后均未出現(xiàn)受害癥狀，對照鄭58 則全部死亡；轉基因玉米2HVB5 在不同處理、不同時間的株高與鄭58 相比無顯著差異，單株產(chǎn)量與鄭58相比無顯著差異（表3），這表明轉基因玉米2HVB5能夠抗中劑量4 倍及以下濃度的草銨膦，可以滿足生產(chǎn)應用的需要。

2.5 轉基因玉米2HVB5的農(nóng)藝性狀調(diào)查

轉基因玉米2HVB5 連續(xù)兩代的農(nóng)藝性狀調(diào)查結果（表4）顯示，在同一世代中轉基因玉米2HVB5在未噴施草銨膦和噴施田間使用中劑量1 倍（600 g/hm2）、中劑量2 倍（1 200 g/hm2）和中劑量4 倍（2 400 g/hm2）的草銨膦后的主要農(nóng)藝性狀與鄭58相比無顯著差異，轉基因玉米2HVB5 因含有抗蟲和耐除草劑基因具有抗蟲和草銨膦耐受性之外，其他農(nóng)藝性狀與對照玉米鄭58 無顯著差異，回交的高代材料在農(nóng)藝性狀方面趨于穩(wěn)定，與回交受體相同，可用于后續(xù)的育種。

3 討論

在玉米的遺傳轉化中，農(nóng)桿菌介導法以其費用低、拷貝數(shù)低、重復性好、較完整的轉化大片段等優(yōu)點，被廣泛使用。但農(nóng)桿菌介導的T-DNA 插入是隨機整合到植物的染色體中［14-15］，這種插入位置的不確定性，可能會造成外源或內(nèi)源基因的缺失或沉默，導致轉基因植物無目的性狀或農(nóng)藝性狀發(fā)生改變［16］。T-DNA 序列的整合位點因受體植物不同具有一定差異，并且轉入的外源基因整合是否具有穩(wěn)定性，整合的位置以及邊界序列的狀態(tài)等都難以控制。因此對比研究不同世代轉基因作物的外源基因DNA整合、蛋白表達、目的性狀以及農(nóng)藝性狀等遺傳穩(wěn)定性，對轉基因作物的商業(yè)化應用具有非常重要的意義。在本研究中對連續(xù)5 代回交鄭58 并自交1 代和2 代（BC5S1、BC5S2）的轉基因玉米2HVB5 材料的檢測結果顯示，外源目的基因穩(wěn)定地整合到玉米基因組中，目的基因的拷貝數(shù)、蛋白表達量、抗蟲性、草銨膦耐受性以及農(nóng)藝性狀等在不同代別中無顯著差異，并且轉基因玉米2HVB5 高抗東方粘蟲、棉鈴蟲，能夠耐受田間使用中劑量4 倍的草銨膦。這些結果都證明轉基因玉米2HVB5 是一個高抗蟲耐除草劑并且遺傳穩(wěn)定的轉基因材料，具有較好的產(chǎn)業(yè)化應用前景。

Bt 作物的應用為害蟲防治開辟了新的途徑。但從生物進化角度來看，長期種植單一的Bt 作物防治靶標害蟲將不可避免地引發(fā)害蟲的抗性。近些年已經(jīng)有靶標害蟲在田間對Bt 作物產(chǎn)生抗性的相關報道。美國東部發(fā)現(xiàn)對Cry1Ac 棉花產(chǎn)生抗性的美洲棉鈴蟲［17］，南非發(fā)現(xiàn)對Cry1Ab 玉米產(chǎn)生抗性的非洲二化螟［18］，波多黎各發(fā)現(xiàn)對Cry1F 玉米產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾種群［19］，巴西也發(fā)現(xiàn)對Cry1Ab 玉米產(chǎn)生抗性的草地貪夜蛾種群［20］。國內(nèi)也監(jiān)測到田間棉鈴蟲對Cry1Ac 的抗性水平呈明顯上升的趨勢［21］。這將影響B(tài)t 作物的可持續(xù)應用。針對害蟲產(chǎn)生抗性風險的問題，“多基因疊加”策略是目前應用最為廣泛的抗性治理策略［22-23］。商業(yè)化的轉基因玉米中主要是通過雜交組合的方式疊加不同的Bt 基因擴大殺蟲譜并延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。已有的研究表明Cry1Ab/1Ac 與Cry2Ab 間存在不對稱的交互抗性［8，24］，而ABCC2 受體可能是導致產(chǎn)生交互抗性的主要原因［25］。cry2Ah基因是具有自主知識產(chǎn)權的新型殺蟲基因，與cry2Ab基因（GenBank：DQ361266.1）核苷酸序列相似性為94.47%，氨基酸序列相似性為93.20%。盡管cry2Ah基因與cry2Ab基因序列相似性較高，但研究表明Cry2Ah 與Cry1Ab/1Ac 不存在交互抗性［8］，與Cry2Ab 相比，Cry2Ah 可能更適合與Cry1A 類和Vip3Aa 進行組合抗蟲。在本研究中，表達Cry2Ah-vp 蛋白的轉基因玉米2HVB5 對東方粘蟲和棉鈴蟲高抗，對草地貪夜蛾有明顯的體重抑制。后續(xù)將轉基因玉米2HVB5 與本課題組培育的轉cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60、轉vip3Aa11/cp4-epsps基因抗蟲耐除草劑玉米VP3C1 進行雜交（未發(fā)表數(shù)據(jù)），培育多基因疊加的具有自主知識產(chǎn)權的抗蟲耐除草劑玉米，可有效增強對靶標害蟲的殺蟲效果并延緩害蟲抗性的產(chǎn)生。

表3BC5S1、BC5S2 代轉基因玉米2HVB5 草銨膦處理后的結果Table 3 Results of BC5S1 and BC5S2 generation transgenic maize 2HVB5 after glufosinate application量2.32a 2.62a 2.68a 2.45a 2.56a 2.95a 2.89a產(chǎn)2.70a株Damagepercent/%單Yield perplant/g 106.7±105.7±0106.6±0105±0106.7±106.4±106.6±0105.15±2.16a 0106.5±0106.45±2.5a 0100 4 周4 weeks 00100 0100 000100 0100 0100 0 2 周2 weeks 00100 000100 0100 0100 0100 0100 0率受1 周1 week害00 0100 100 0100 000100 0100 0100 0 1.5a 2.14a 2.48a 2.05a 1.62a 4 周4 weeks 113.45±1.47a 113.6±0113.15±1.95a 0112.5±0113.5±112.45±1.7a 112.55±2.04a 0112.7±0112.1±0112.95±1.54a 2 周2 weeks 1.47a 54.95±55.7±1.34a 1.19a 1.43a 055±1.56a Plant height/cm 055±1.65a 1.76a 53.1±1.62a 055.05±53.95±053±1.62a 053.5±1.54a 053.45±度1.14a 0.99a 1.32a 1.07a 1.39a 1.35a植1 周1 week株46.3±1.38a高46.65±046.5±1.15a 046.35±047.1±1.07a 46.05±45.25±046±1.21a 045.85±045.65±4 周4 weeks 100 Plantingpercent/%100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100 2 周2 weeks 100 100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100成1 周1 week率苗100 100 0100 0100 0100 100 100 0100 0100 0100草Glufosinate理處膦銨treatment/（g·hm-2）0 600 1 200 2 400 0 600 1 200 2 400材Samples料Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5 Z58 2HVB5代Generation別BC5S1 BC5S2

單Yield perplant/g量2.32a 2.62a 2.68a 2.56a 2.95a產(chǎn)2.7a株106.7±105.7±106.6±105±106.4±106.6±105.15±2.16a 106.45±2.5a千1 000-grain 3.77a 2.55a 3.66a 2.92a 2.93a 3.25a重粒weight/g 280.6±279.55±3.2a 280.1±280.8±279.35±3.41a106.7±2.45a 279.9±280.4±278.55±2.5a 279.25±3.51a106.5±2.89a 280.3±28.1±0.72a 0.75a行Kernels perrow 0.86a 28.3±0.86a 0.79a 0.85a數(shù)0.66a粒0.83a 28.3±28.25±27.85±0.83a 28.1±28.1±0.79a 28.25±性0.91a 13.75±穗Rowsperear行0.79a 27.95±0.83a 13.9±0.85a數(shù)狀藝0.81a 28±13.85±14.1±0.79a 14.05±14±0.79a 14.05±14±0.86a 13.7±0.8a 14.1±0.85a農(nóng)2HVB5 的禿Baretip長尖length/cm 0 0 0 0 0 00 0 0 0米玉因0.16a 0.14a基粗轉穗Ear diameter /cm 4.07±0.1a 4.1±4.12±0.16a 4.1±4.12±0.15a 4.08±0.12a 4.09±0.14a 4.13±0.19a 4.13±0.16a 4.11±0.14a BC5S2 代1.17a 1.27a 1.1a 0.79a 0.92a 4 BC5S1、穗Ear length/cm Table 4Agronomictraits of BC5S1 andBC5S2 generation transgenic maize2HVB5長2.23a 16.55±1.15a 16.65±16.5±1.43a 16.55±1.96a 16.55±1.15a 16.25±2.06a 16.25±1.16a穗Ear height/cm 139.65±2.13a32.25±2.24a16.1±2.11a 16.45±1.1a 2.22a 16.3±1.66a高1.82a 32.05±2.07a 1.84a表位32.15±33.15±32.65±32.25±株Plant height/cm 1.93a 2.63a 1.61a 1.94a 1.79a高139.4±139.65±2.46a32.3±139.9±139.95±2.46a32.3±141.45±1.85a32.4±142.5±141.8±141.55±2.01a33.1±141.4±草Glufosinate理處膦銨treatment/（g·hm-2）0鄭2HVB5 0 2HVB5 0 2HVB5 600 2HVB5 1200 2HVB5 2400 0材Sample料58 58鄭2HVB5 600 2HVB5 1200 2HVB5 2400代Generation別BC5S1 BC5S2

轉基因作物商業(yè)化以來，由于其顯著的經(jīng)濟、社會和生態(tài)效益，使其在全球得到了廣泛應用，截至2019年，全球共有71 個國家采用了轉基因作物，其中29 個國家批準種植，42 個國家（包含歐盟26國）批準進口轉基因作物用于食品、飼料和加工［6］。目前商業(yè)化轉基因玉米的目標性狀主要集中在抗蟲、耐除草劑上，其中抗蟲耐除草劑復合性狀占復合性狀轉化體總數(shù)的96%。從現(xiàn)有商業(yè)化玉米轉化體數(shù)量上來看，單性狀商業(yè)化轉化體數(shù)量長期處于較低水平，隨時間變化波動平穩(wěn)；而復合性狀的商業(yè)化轉化體數(shù)量隨時間變化呈現(xiàn)持續(xù)升高后又降低的趨勢，其中2007-2015年為復合性狀商業(yè)化轉化體數(shù)量增長最快的階段［26］。從玉米產(chǎn)業(yè)來看，復合性狀轉基因玉米符合生產(chǎn)發(fā)展要求，并且抗蟲和耐除草劑仍然是復合性狀轉基因玉米的主要目標性狀。因此抗蟲耐除草劑玉米仍然是轉基因玉米發(fā)展的主要方向。在全球除草劑市場上，氨基酸類除草劑（包括草甘膦、草銨膦、雙丙氨膦）的市場規(guī)模最大。2019年全球除草劑市場規(guī)模為263.31 億美元，其中氨基酸類除草劑占比約23.6%［27］。2020年全球草銨膦市場規(guī)模達到10.5 億美元，僅次于草甘膦位列所有除草劑品種的第二位，近6年的復合增長率為6.3%，是增長最快的非選擇性除草劑，市場開發(fā)潛力和應用前景巨大［27］。轉基因玉米2HVB5 表達cry2Ah-vp和bar基因，在抗蟲的同時也賦予了玉米耐草銨膦的特性。本研究結果表明，轉基因玉米2HVB5 對草銨膦除草劑具有高的耐受性，田間能夠耐受中劑量4 倍的草銨膦，農(nóng)藝性狀與對照相比無顯著差異，達到了生產(chǎn)用抗除草劑玉米對除草劑的耐受性水平。與抗蟲耐草甘膦玉米HGK60 和VP3C1雜交后可同時抗草甘膦和草銨膦除草劑，具有更加廣泛的生產(chǎn)應用前景。

4 結論

轉基因玉米2HVB5 的外源基因以單拷貝形式整合到玉米基因組中并穩(wěn)定遺傳，目的蛋白Cry2Ahvp 和PAT 在植株的不同時期、不同組織部位均有表達，其中在葉片中的表達量相對較高，分別達到2-3.5 μg/g FW（鮮重）和8-17 μg/g FW（鮮重）。轉基因玉米2HVB5 對東方粘蟲和棉鈴蟲高抗，對草地貪夜蛾有明顯的體重抑制，可有效防治玉米害蟲尤其是夜蛾科害蟲。2HVB5 轉基因玉米可耐受田間使用中劑量4 倍量的草銨膦，農(nóng)藝性狀與對照鄭58 相比無顯著差異。