α-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)及應(yīng)用研究進(jìn)展

李林波，張士雙，楊天佑，王寶石，張明霞

(河南科技學(xué)院 生命科技學(xué)院，現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 新鄉(xiāng)，453003)

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)是一種外切碳水化合物酶，能催化α-D-葡萄糖基從不同大小的底物，包括麥芽低聚糖、α-糖苷和α-葡聚糖等非還原端水解糖苷鍵，釋放α-D-葡萄糖[1]，除水解作用外，α-葡萄糖苷酶還可通過轉(zhuǎn)糖基化作用[2-3]，將葡萄糖基從底物轉(zhuǎn)移至受體，形成相應(yīng)的低聚糖、糖脂或糖肽等，在生產(chǎn)功能性低聚異麥芽糖(isomaltooligosaccharides,IMOs)和有生物功能的糖-共軛復(fù)合物方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。

α-葡萄糖苷酶可由包括細(xì)菌、真菌、動物和植物在內(nèi)的各種生物體產(chǎn)生[4]，這種廣泛的分布導(dǎo)致其底物特異性也因酶的來源而不同。根據(jù)底物特異性，α-葡萄糖苷酶傳統(tǒng)上分為3組，第1組可水解多種異質(zhì)底物(主要來自細(xì)菌)，如蔗糖、芳香基-α-葡萄糖苷，而且比水解同質(zhì)底物更有效，第2組在水解同質(zhì)底物上更有效(主要來自真菌)，如麥芽糖、異麥芽糖等，第3組與2組活性相似，但對淀粉等長鏈底物也有高水解活性(大多來自植物)[5-6]。α-葡萄糖苷酶的主要微生物來源有曲霉、乳酸桿菌和芽孢桿菌，而黑曲霉α-葡萄糖苷酶具有較高的轉(zhuǎn)糖基化活性，且耐酸性強，容易避免細(xì)菌污染，因此被成功地應(yīng)用于生產(chǎn)IMOs[2]，然而，在工業(yè)化應(yīng)用過程中仍存在著熱穩(wěn)定性差、底物特異性差、底物譜窄等問題，其應(yīng)用受到了極大的限制，因此學(xué)者通過克隆不同生物來源的酶，并對其進(jìn)行分子改造和異源表達(dá)等，以克服規(guī)?；a(chǎn)中魯棒性差和產(chǎn)量不高的問題。

α-葡萄糖苷酶作為目前工業(yè)化生產(chǎn)IMOs的關(guān)鍵酶制劑，其高效表達(dá)直接影響IMOs的生產(chǎn)成本，此外，α-葡萄糖苷酶還能以麥芽糖等作為糖基供體，催化合成糖-共軛復(fù)合物等生物活性物質(zhì)，在化妝品、食品、醫(yī)藥行業(yè)展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用前景。因此，本文介紹了不同來源的α-葡萄糖苷酶的特性和異源表達(dá)情況，綜述了α-葡萄糖苷酶用于高效生產(chǎn)IMOs的工業(yè)合成途徑和糖苷類生物活性物質(zhì)合成等方面的研究進(jìn)展，并展望了α-葡萄糖苷酶分子改造的發(fā)展方向，為將來獲得符合特殊需求的糖苷合成酶突變體提供參考。

1 α-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)

到目前為止，大量具有轉(zhuǎn)糖基化活性的α-葡萄糖苷酶已經(jīng)被鑒定和表征，大多數(shù)商業(yè)上可用的α-葡萄糖苷酶，均通過黑曲霉(Aspergillusniger)發(fā)酵生產(chǎn)，如日本天野(Amano Enzymes Inc.)酶制劑公司生產(chǎn)的α-葡萄糖苷酶，占據(jù)了國內(nèi)IMOs生產(chǎn)用酶的大部分市場，由于α-葡萄糖苷酶本體表達(dá)水平有限且需要純化回收，成本仍居高不下，所以學(xué)者對不同來源的α-葡萄糖苷酶進(jìn)行了異源表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)表征，如表1所示。

1.1 在大腸桿菌中的表達(dá)

大腸桿菌由于表達(dá)體系成熟完善、繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、成本低廉等，是目前采用最多的原核表達(dá)體系。學(xué)者們先前已將嗜熱脂肪芽孢桿菌、爪洼毛霉、硫礦硫化葉菌、青春雙歧桿菌、釀酒酵母、阪崎腸桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、巴西曲霉、腸膜明串珠菌等來源的α-葡萄糖苷酶在大腸桿菌(Escherichiacoli)中進(jìn)行了重組表達(dá)[7]，結(jié)果表明其底物特異性、分子質(zhì)量等因其來源不同而存在差異，學(xué)者們研究了該酶對硝基苯-α-D-葡萄糖苷(4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside ，pNPG)和麥芽糖等底物的水解活性，而少數(shù)也對該酶的轉(zhuǎn)糖基化活性進(jìn)行了檢測，因黑曲霉來源的α-葡萄糖苷酶活性高，因此已應(yīng)用于制備IMOs等食品領(lǐng)域。CHAUDET等[8]報道了來自多形擬桿菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的兩種G31家族的糖苷水解酶(BT_0339 和BT_3299)，兩種α-葡萄糖苷酶通過pET-29a表達(dá)載體在E.coli中得到高水平的可溶性表達(dá)，研究表明這兩種酶在麥芽糖、異麥芽糖和麥芽低聚糖底物上均表現(xiàn)出水解活性，但對蔗糖和乳糖的水解活性較低。

此外，α-葡萄糖苷酶的工業(yè)應(yīng)用需要在高溫下的穩(wěn)定性以及對常見的變性劑的穩(wěn)定性，因此目前已從不同極端微生物中發(fā)現(xiàn)并表征了許多耐熱的α-葡萄糖苷酶，以獲得穩(wěn)定性好的酶源。ZHANG等[9]將來自地芽孢桿菌屬(Geobacillussp.) 的α-葡萄糖苷酶在E.coli中重組表達(dá)，酶水解的最適溫度為65 ℃, pH 7.0時水解活性最大，水解活性達(dá)107.9 U/mL，最終用300 g/L的麥芽糖漿合成IMOs的轉(zhuǎn)化率達(dá)到37%。LI等[10]從深海假單胞菌(Pseudoalteromonassp.)中克隆得到一種新型α-葡萄糖苷酶(Ⅱ型酶)，在E.coli中表達(dá)，結(jié)果表明在pH 8.5和30 ℃時表現(xiàn)出最佳活性(19.4 U/mg，麥芽糖)。CUEBAS-IRIZARRY等[11]報道了第一個來自極端嗜鹽菌(Halophileswalsbyi)的α-葡萄糖苷酶，通過表達(dá)載體pET28b(+)在E.coli中表達(dá)，表明在40 ℃和pH 6.0下檢測到水解α-pNPG的最佳活性，且在3 mol/L的NaCl或3～4 mol/L的KCl條件下，酶水解活性最高。ZHOU等[12]用E.coli表達(dá)來源于嗜熱棲熱菌(ThermusthermophilusTC11)的α-葡萄糖苷酶，該重組酶對pNPG、蔗糖、海藻糖和潘糖等都具有水解活性，并以蔗糖和海藻糖為底物時，顯示出糖基化活性，該酶在70 ℃下能穩(wěn)定7 h以上，耐熱性好。PARK等[13]將超嗜熱泉古菌(Sulfolobustokodaii)來源的α-葡萄糖苷酶在E.coli中表達(dá)，該重組酶在95 ℃和pH 4.0時觀察到最大活性，顯示出穩(wěn)定的耐酸和耐熱性能。綜上，目前已從極端嗜熱微生物中克隆出耐高溫的酶源，但其底物專一性仍需要更深入了解該酶的結(jié)構(gòu)與功能，才能有助于指導(dǎo)酶分子進(jìn)行定向改造，因此，從極端環(huán)境中獲取穩(wěn)定性好的酶源，要求有強的轉(zhuǎn)糖基化活性和底物專一性，同時應(yīng)結(jié)合同源建模和分子對接的方法對其進(jìn)行改造，最終以異源表達(dá)方式進(jìn)行高密度發(fā)酵提高產(chǎn)量，突破α-葡萄糖苷酶在工業(yè)應(yīng)用上的限制。

表1 α-葡萄糖苷酶的重組表達(dá)及特征(近10年)Table 1 Recombinant expression and characteristic of α-glucosidase (nearly ten years)

1.2 在酵母中的表達(dá)

早前有學(xué)者以釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)為宿主，對α-葡萄糖苷酶進(jìn)行了克隆表達(dá)。DHANAWANSA等[22]將S.cerevisiae中克隆的α-葡萄糖苷酶I基因(CWH41)過表達(dá)，其可溶性表達(dá)量增加了28倍，胞內(nèi)酶的水解活性達(dá)306 U/g濕菌體，純化后該酶的比活力達(dá)8 550 U/mg蛋白。TANAKA等[23]將來源于蔥狀被孢霉(Mortierellaalliacea)的α-葡萄糖苷酶重組表達(dá)于S.cerevisiae，研究表明胞內(nèi)和胞外的α-葡萄糖苷酶對麥芽糖和淀粉的水解能力均顯著增加。HOSTINOV等[24]從扣囊復(fù)膜酵母(Saccharomycesfibuligera)中克隆α-葡萄糖苷酶基因，在S.cerevisiae中表達(dá)，該酶為膜結(jié)合蛋白，分子質(zhì)量為110 kDa，對麥芽糖和低聚麥芽糖均有活性，但不水解可溶性淀粉。CASA-VILLEGAS等[17]通過構(gòu)建pSSP-aglA表達(dá)載體，在S.cerevisiae中表達(dá)來自A.niger的α-葡萄糖苷酶基因，該重組酶一半與細(xì)胞結(jié)合，一半分泌到胞外，當(dāng)麥芽糖為底物時，主要的糖基化產(chǎn)物是潘糖和異麥芽糖。通過以上研究表明，釀酒酵母作為重組蛋白的表達(dá)宿主，對分子質(zhì)量超過100 kDa的蛋白分泌水平不高，不便于分離純化。

由于釀酒酵母缺乏強有力的啟動子，且重組蛋白分泌水平不高，而巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)具備強啟動子、翻譯后修飾能力、分泌效率高、培養(yǎng)成本低、發(fā)酵工藝成熟和易放大等優(yōu)點，是目前最為成功的真核蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一。WU等[25]將自米曲霉(AspergillusoryzaeZL-1)來源的α-葡萄糖苷酶轉(zhuǎn)化P.pastoris進(jìn)行表達(dá)，結(jié)果表明該酶的轉(zhuǎn)糖基化活性在pH 5.2和37 ℃下最高，純化后的酶比活力為83.5 U/mg，以麥芽糖為底物，主要產(chǎn)物為潘糖。SUTHANGKORNKUL等[16]從致倦庫蚊(Culexquinquefasciatus)的唾液中克隆α-葡萄糖苷酶基因，并在P.pastoris中重組表達(dá)，結(jié)果表明該酶可水解異質(zhì)底物(Ⅱ型酶)，最適pH和溫度分別為5.5和35 ℃，且對麥芽三糖的催化效率高于蔗糖、麥芽糖、麥芽糖和pNPG。MUSLIN等[26]在P.pastoris中表達(dá)了來自大麥(Barley)的α-葡萄糖苷酶，證實了該酶可在體外水解完整的淀粉顆粒，屬Ⅲ型酶，分泌表達(dá)量為2 g/L，且水解麥芽糖的最佳pH值在3.5～4.5。此外，學(xué)者們還將黑曲霉[27]、印度蜜蜂[15]等來源的α-葡萄糖苷酶P.pastoris中進(jìn)行了表達(dá)，研究證明真核生物來源的α-葡萄糖苷酶大都為糖基化蛋白，而畢赤酵母可對該酶進(jìn)行糖基化并將其分泌到胞外，因此，畢赤酵母作為真核生物來源的α-葡萄糖苷酶的表達(dá)宿主，在保證其生物活性的同時還利于分離純化，而且可采用優(yōu)化密碼子和共表達(dá)分子伴侶等策略提高表達(dá)水平[14, 19]，是工業(yè)化制備α-葡萄糖苷酶的理想宿主。

1.3 在其他宿主中的表達(dá)

α-葡萄糖苷酶在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)、乳酸菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉中也進(jìn)行了過表達(dá)，如NAKAMURA等[28]將來源于A.niger的α-葡萄糖苷酶在構(gòu)巢曲霉中表達(dá)，結(jié)果表明α-葡萄糖苷酶受碳源調(diào)控，麥芽糖和淀粉均可誘導(dǎo)該酶的表達(dá)，而葡萄糖會抑制其表達(dá)，這與黑曲霉中α-淀粉酶和糖化酶的表達(dá)情況一致。GIULIANO等[29]以乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)為表達(dá)體系，重組表達(dá)來自硫礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)的α-葡萄糖苷酶，優(yōu)化后α-葡萄糖苷酶的表達(dá)量比野生菌株高1 000倍。HUNG等[30]從馬里亞納海溝沉積物中分離出地芽孢桿菌(Geobacillus)HTA-462，將其α-葡萄糖苷酶在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中重組表達(dá)，低離子強度下，該酶以同源二聚體形式存在(130 kDa)，在15 mmol/L 的Gly-NaOH緩沖體系中，60 ℃和pH 9.0時具有最大水解活性，麥芽糖作為糖供體時，可將麥芽糖轉(zhuǎn)化為異麥芽糖。此外，張津浩等[31]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以pSZH10-6-1為表達(dá)載體，將來源于A.niger的α-葡萄糖苷酶整合到黑曲霉基因組，重組酶分子質(zhì)量為97 kDa，最適反應(yīng)溫度為40 ℃左右，最適pH值在6.0左右，胞外發(fā)酵液中的酶水解活性可達(dá)180 U/mL。綜上，學(xué)者們通過在構(gòu)巢曲霉、乳酸菌、枯草芽孢桿菌和黑曲霉中過表達(dá)α-葡萄糖苷酶，研究表明總體表達(dá)水平較低，且轉(zhuǎn)糖基化活性不高，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，近年來相關(guān)研究已不多。

因此，α-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)體系雖研究較多，但表達(dá)水平以大腸桿菌和畢赤酵母最高，且不同來源的α-葡萄糖苷酶的最適溫度、最適pH、底物偏好性等酶學(xué)性質(zhì)存在較大的差異，如何將發(fā)掘的該酶的所有不同的生物學(xué)信息進(jìn)行分析和整合，實現(xiàn)優(yōu)勢位點組合，是亟待解決的的問題。目前已有通過隨機誘變、定點突變等方法對該酶進(jìn)行分子改造的報道，雖在一定程度上提高了穩(wěn)定性， 但要滿足工業(yè)化的需要，仍需要利用易錯PCR、DNA改組等分子定向進(jìn)化策略，并借助計算機模擬分析，通過3D建模、分子對接和分子模擬等技術(shù)，將優(yōu)勢位點組合，產(chǎn)生超級突變株，獲得比天然酶活力更高、穩(wěn)定性更好的工業(yè)用酶。

2 α-葡萄糖苷酶的應(yīng)用研究

2.1 合成低聚異麥芽糖

IMOs的工業(yè)化生產(chǎn)，一般是以淀粉為原料，首先經(jīng)α-淀粉酶液化，進(jìn)而被β-淀粉酶和普魯蘭酶等糖化酶糖化為麥芽糖漿，最后經(jīng)α-葡萄糖苷酶的轉(zhuǎn)苷作用催化合成IMOs。α-淀粉酶，β-淀粉酶和普魯蘭酶等研究和工業(yè)應(yīng)用已成熟，但α-葡萄糖苷酶催化的轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)是制備IMOs的關(guān)鍵步驟，因此α-葡萄糖苷酶是工業(yè)化生產(chǎn)IMOs的關(guān)鍵酶制劑[32]。

KUMAR等[20]將曲霉變種(A.neoniger)來源的α-葡萄糖苷酶經(jīng)P.pastoris重組表達(dá)后用于合成IMOs，最終產(chǎn)物中潘糖和異麥芽糖的比例分別達(dá)到61.29%和12.72%，而且對潘糖有較低速率的二次水解。GARCIA-GONZALEZ等[21]將梅奇酵母屬(Metschnikowiaspp.)來源的α-葡萄糖苷酶在E.coli中重組表達(dá)，研究表明該重組酶對蔗糖、麥芽糖和對硝基苯基-α-D-葡萄糖苷均具有水解活性，將其用于合成IMOs, 最終產(chǎn)量達(dá)到170 g/L，是迄今為止報道最高的產(chǎn)量。此外，學(xué)者通過對α-葡萄糖苷酶進(jìn)行固定化或?qū)⒈磉_(dá)α-葡萄糖苷酶的細(xì)胞進(jìn)行固定化，以提高酶的穩(wěn)定性和利用率。WANG等[33]將黑曲霉來源的α-葡萄糖苷酶固定于環(huán)氧樹脂上，在55 ℃和pH 4.5的乙酸丁酯緩沖體系下，IMOs的產(chǎn)率可達(dá)50.83%，完成反應(yīng)后α-葡萄糖苷酶被分配到有機相，保持了良好的可重復(fù)使用性。OJHA等[34]報道了以海藻酸鈣包埋的微桿菌(Microbacteriumsp.)用于固定床全細(xì)胞催化合成IMOs，在400 g/L的麥芽糖初始濃度下反應(yīng)24 h，產(chǎn)量達(dá)到85 g/L，與游離細(xì)胞相比，IMOs的生產(chǎn)效率提高4.2倍[達(dá)到4.0 g/(L·h)]，底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)24%。

IMOs的工業(yè)化生產(chǎn)工藝中存在工序多、周期長、底物轉(zhuǎn)化率低、工藝參數(shù)控制困難等缺點[35]，且酶法轉(zhuǎn)化產(chǎn)品中重要功能性低聚糖的含量不高，制約著IMOs的應(yīng)用，其核心技術(shù)問題之一是酶的合理組合與優(yōu)化利用,IMOs的工業(yè)合成途徑及策略如圖1所示。CHEN等[36]將來自嗜熱脂肪地芽孢桿菌(G.stearothermophilus)純化的α-葡萄糖苷酶進(jìn)行固定化，以淀粉作底物，采用殼聚糖膜固定化α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、普魯蘭酶等小規(guī)模制備IMOs，最終產(chǎn)物中IMOs的含量達(dá)到41.74%，該法簡化了IMOs的生產(chǎn)工序，顯示出以淀粉為原料一步法生產(chǎn)IMOs的潛力，但還需驗證在規(guī)?；磻?yīng)器中的穩(wěn)定性和重復(fù)操作能力。此外，學(xué)者還利用酵母細(xì)胞表面展示α-葡萄糖苷酶技術(shù)直接用于合成IMOs，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。CASA-VILLEGAS等[17]將A.niger來源的α-葡萄糖苷酶與酵母的糖基磷脂酰肌醇錨定序列融合表達(dá)，展示于S.cerevisiae細(xì)胞表面用于制備IMOs，其主要產(chǎn)物為潘糖和異麥芽糖，且通過調(diào)節(jié)底物中麥芽糖與葡萄糖的比例可控制產(chǎn)物IMOs中潘糖和異麥芽糖的產(chǎn)量，該法提供了一種使用酵母細(xì)胞表面展示α-葡萄糖苷酶來低成本制備IMOs的方法。此外，ZHAO等[37]將A.niger來源的α-葡萄糖苷酶展示于P.pastoris細(xì)胞表面用于制備IMOs，在0.5 L的催化體系中，反應(yīng)2 h后轉(zhuǎn)化率約為44%。WANG等[38]利用醛基修飾磁性殼聚糖載體，將表面展示α-葡萄糖苷酶的P.pastoris細(xì)胞進(jìn)行固定化，并用于催化麥芽糖，連續(xù)運行48 h后IMOs的產(chǎn)量達(dá)90 g/L。研究表明，α-葡萄糖苷酶展示于酵母細(xì)胞表面及細(xì)胞固定化后重復(fù)利用率高，轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定，系統(tǒng)穩(wěn)定性強。目前，IMOs規(guī)模化生產(chǎn)的成本主要在于酶的生產(chǎn)和純化，而酵母細(xì)胞表面展示系統(tǒng)不需對α-葡萄糖苷酶進(jìn)行純化，可提高該酶的反應(yīng)效率和操作穩(wěn)定性，且能多次重復(fù)利用，是規(guī)?；苽銲MOs的最具前景的高效催化系統(tǒng)之一，但目前的研究仍停留在小試階段，要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還應(yīng)進(jìn)行生產(chǎn)模擬放大實驗，以及考慮可能存在的底物抑制、產(chǎn)物抑制及不同的反應(yīng)條件對細(xì)胞表面展示合成系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響。

2.2 催化合成糖苷類生物活性物質(zhì)

某些化合物由于被糖基化后可有效改善其水溶性、生物利用度、穩(wěn)定性和藥效學(xué)反應(yīng)等，從而使得其糖苷復(fù)合物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等行業(yè)。在天然植物體內(nèi)，糖苷類活性物質(zhì)一般由糖基轉(zhuǎn)移酶(glycosyltransferase，GT)催化合成，但GT在體外其穩(wěn)定性較差，且需昂貴的糖基供體核苷酸二磷酸糖(NDP-sugars)[39]，限制了其在合成糖苷上的規(guī)?；瘧?yīng)用，而α-葡萄糖苷酶，除能對糖苷鍵進(jìn)行水解外，還能使用多種碳水化合物(葡萄糖、麥芽糖、木糖、甘露糖、半乳糖等)作為糖基供體，轉(zhuǎn)移糖基形成糖苷，因此在生產(chǎn)糖苷類生物活性物質(zhì)方面有著巨大的應(yīng)用潛力(圖2)。

類黃酮可通過糖基化增加其水溶性和生物利用度，是改善其藥代動力學(xué)和生物活性的一種有前景的方法[40]，臨床應(yīng)用的黃酮類藥物多為糖苷類，如蕓香(槲皮素3-O-蕓香苷)膠囊給藥，葛根素(大豆黃酮8-C-葡萄糖苷)注射給藥等。LI等[41]利用硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobussolfataricus)來源的耐熱α-葡萄糖苷酶衍生的O-α-糖苷連接酶，開發(fā)了一種高效合成類黃酮O-α-糖基化的方法，該酶底物譜寬，對黃酮、黃烷酮、黃烷酮醇、黃烷醇和異黃酮類均有較強的轉(zhuǎn)糖基化活性，產(chǎn)率均在90%以上，最終可合成7-O-α-葡萄糖苷類黃酮。CHEN等[18]將來自野油菜黃單胞菌(Xanthomonascampestris)的α-葡萄糖苷酶(Agl2)在E.coli中重組表達(dá)，該酶以麥芽糖為糖基供體，可對苯酚、香蘭素和乙基香蘭素等酚類底物進(jìn)行糖基化，且其催化效率主要受糖基化/水解選擇性和催化環(huán)境中葡萄糖含量的影響。

L-抗壞血酸(ascorbic acid，AA)在維持皮膚彈性和修復(fù)受損皮膚方面有重要作用，可作為化妝品的主要護膚成分。研究發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶可對L-抗壞血酸進(jìn)行糖基化，一定條件下形成不同比例的6-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-6G)和2-O-α-D-葡萄糖基-L-抗壞血酸(AA-2G)，兩者的抗氧化活性均保持在AA的水平，但AA-2G的穩(wěn)定性遠(yuǎn)高于AA-6G，且AA-2G在體內(nèi)容易被酶處理以釋放活性AA[42]。LI等[43]將來自A.niger的α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase，Agl)的截短版本AglA-t在P.pastoris中表達(dá)并純化后合成L-抗壞血酸-O-葡萄糖苷，主要產(chǎn)物為AA-2G，在pH 6.0和40 ℃時產(chǎn)量最高,為0.53 g/L，并分析猜測AglA的信號肽可能對糖基化位點的選擇起主要作用。來自水稻種子和哺乳動物等高等真核細(xì)胞的α-葡萄糖苷酶用于合成AA-2G，有副產(chǎn)物少的優(yōu)點，如QI等[44]將亞洲稻(Oryzasativa)來源的Agl在P.pastoris中表達(dá)并純化，以麥芽糖為糖基供體，在37 ℃，pH 4.0的最適條件下可合成約8.7 g/L的AA-2G。以上研究表明不同來源的α-葡萄糖苷酶底物活性不同，糖基化位點不同，形成的糖基化產(chǎn)物的活性和穩(wěn)定性會受到影響。熊果素可通過抑制酪氨酸酶的活性，減少黑色素的沉積，從而在美白等化妝品方面有重要的應(yīng)用。PARK等[45]以嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)來源的Agl為對象，提出了一種用AglA及其糖苷合成酶突變體合成熊果苷的新方法，通過用非親核的甘氨酸取代親核試劑構(gòu)建α-糖苷合成酶AglA，研究表明AglA以麥芽糖為供體，熊果素為受體，合成主要產(chǎn)物C-3、C-4和C-6熊果苷，但其轉(zhuǎn)糖基化產(chǎn)物可再次被酶水解并最終降低產(chǎn)率，但AglA糖苷合成酶突變體只產(chǎn)生一種主要產(chǎn)物C-4熊果苷，其產(chǎn)量為38%，且沒有被進(jìn)一步水解。綜上，α-葡萄糖苷酶對不同底物的偏好性，及對形成 C-糖苷和O-糖苷的區(qū)域和立體特異性的選擇，影響著糖苷類物質(zhì)的生物活性及穩(wěn)定性，而不同來源的α-葡萄糖苷酶的底物譜及催化特性，給揭示該酶及突變體的糖基化區(qū)域和立體選擇性的分子機制提供了結(jié)構(gòu)信息，以便運用理性設(shè)計的方法構(gòu)建α-葡萄糖苷酶突變體，最終可合成生物活性高且穩(wěn)定性強的糖苷類物質(zhì)。

目前，除α-葡萄糖苷酶外，研究發(fā)現(xiàn)糖苷磷酸化酶(glycoside phosphorylases)，也能以簡單的磷酸化糖作為供體合成糖苷，且產(chǎn)率較高，如蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphorylase)[46]，此外，還有葡聚糖蔗糖酶(glucansucrases)[47]，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶(cyclodextrin glucanotransferase)[48]，淀粉蔗糖酶(amylosucrases)[49]等，它們在催化對苯二酚、抗壞血酸、槲皮素、白藜蘆醇和沒食子酸丙酯等α-糖基化反應(yīng)方面有較大的應(yīng)用潛力。目前雖已揭示了某些酶的三維構(gòu)象及催化位點，但尚沒有明確的理論基礎(chǔ)用于指導(dǎo)“糖苷合成酶”的改造，它們之間的構(gòu)效關(guān)系也掌握的并不徹底，我們需要更多的蛋白質(zhì)方面的生物學(xué)信息，如來自嗜熱解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)的蔗糖磷酸化酶由于活性部位精氨酸和Loop環(huán)的空間限制，當(dāng)以蔗糖-6-磷酸為供體時，不能對白藜蘆醇進(jìn)行糖基化，但研究發(fā)現(xiàn)其R134A突變體可高效合成白藜蘆醇-3-α-葡萄糖苷，原因在于R134A突變體引起了空間構(gòu)象的變化[50]，因此，掌握涉及β/α-糖基化構(gòu)型、立體選擇性及引起構(gòu)象變化的結(jié)構(gòu)信息，是未來半理性或理性設(shè)計糖基合成酶突變體的分子基礎(chǔ)，因此只有充分的掌握這些結(jié)構(gòu)與功能信息，才能在轉(zhuǎn)糖基化效率、特異性和立體選擇性上進(jìn)行更有效的工程設(shè)計。

2.3 其他方面

α-葡萄糖苷酶的應(yīng)用研究，還體現(xiàn)在α-葡萄糖苷酶抑制劑、生物傳感器及代謝工程等方面(圖2)。由于α-葡萄糖苷酶抑制劑可有效降低餐后血糖水平，成為當(dāng)前治療Ⅱ型糖尿病的研究熱點[51]，目前關(guān)于α-葡萄糖苷酶抑制劑主要集中在多糖、皂苷、生物堿、黃酮、多肽、萜類等天然活性成分的研究上。MOHIUDDIN等[52]將α-葡萄糖苷酶共價固定在氨基化的多壁碳納米管上，開發(fā)了一種用于測定藥用植物抗糖尿病潛力的生物傳感器，該傳感器靈敏度高，方法簡便，對于快速篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑有顯著效果。此外，KOJIMA等[53]研究了敲除米曲霉α-葡萄糖苷酶基因(agdA)對釀造日本清酒轉(zhuǎn)糖基化產(chǎn)物的影響，agdA基因的敲除降低了清酒中α-乙基葡萄糖苷和α-甘油葡萄糖苷的含量，并通過核磁共振鑒定出新化合物乙基-α-麥芽糖苷和乙基-α-異麥芽糖苷是日本清酒中常見的苷類。YU[54]將自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)克隆得到的α-葡萄糖苷酶(agluI和agluⅡ)過表達(dá)于酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricumtyrobutyricum)，結(jié)果表明，突變株可利用麥芽糖和可溶性淀粉生產(chǎn)正丁醇，丁醇產(chǎn)量可達(dá)17.2 g/L，產(chǎn)率比原來提高了近1倍，且在間歇發(fā)酵時表現(xiàn)穩(wěn)定，這種方法為以麥芽糖和淀粉為原料工業(yè)化生產(chǎn)正丁醇提供了新思路。

圖2 α-葡萄糖苷酶在不同領(lǐng)域的研究和應(yīng)用Fig.2 Research and application of α-glucosidase in different fields

3 展望

糖基化的化合物在食品、制藥和個人護理行業(yè)有廣泛的應(yīng)用，但它們的合成遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需求。糖基化合物的化學(xué)合成法由于產(chǎn)量低和缺乏選擇性，使生物催化途徑作為有效的和“綠色”替代品受到了越來越多的關(guān)注。目前α-葡萄糖苷酶主要用于IMOs的合成，而要降低IMOs的工業(yè)生產(chǎn)成本，仍需通過半理性設(shè)計或理性設(shè)計策略，利用該酶突變體的序列信息，結(jié)構(gòu)與功能信息，以及計算機預(yù)測算法等手段，對α-葡萄糖苷酶進(jìn)行分子改造。天然的糖苷水解酶、糖苷磷酸化酶等，除能通過糖基化來改善某些化合物的水溶性和穩(wěn)定性等性能外，在紅景天苷、人參皂苷的合成方面也有著巨大的應(yīng)用潛力[55-56]。但由于轉(zhuǎn)移葡萄糖基、半乳糖基、木糖基、甘露糖基等殘基可能需要不同的糖苷合成酶突變體來完成，要求其底物特異性和立體選擇性專一性強，才能高效合成單一的目的產(chǎn)物，因此糖苷合成酶突變體的研究，是未來學(xué)者研究的重點方向之一。筆者認(rèn)為，應(yīng)鑒別出“高功能性”糖苷類化合物的關(guān)鍵糖基化位點及其構(gòu)型，并建立生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，進(jìn)而結(jié)合酶的定向進(jìn)化及高通量篩選技術(shù)，借助模型構(gòu)建、計算機預(yù)測、信息整合、分析優(yōu)化等手段，快速高效的篩選出活性高、穩(wěn)定性強的符合特定需求的酶突變體。此外，自然界是糖苷合成酶的天然寶庫，應(yīng)重視對生物資源中天然糖苷合成酶的開發(fā)和利用，分析其序列及結(jié)構(gòu)信息，并通過蛋白質(zhì)工程拓寬或改變底物特異性，這對于開發(fā)適合特定應(yīng)用需要的新型酶突變體意義重大。