雙酶偶聯(lián)法測(cè)定發(fā)酵液中L-高絲氨酸的含量

趙金花，魏亮，徐寧，馬振平，劉君*

1(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津，300457)2(中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津，300308)

L-高絲氨酸是一種重要的非蛋白質(zhì)氨基酸，是合成蘇氨酸和甲硫氨酸等多種天冬氨酸家族氨基酸的重要前體物質(zhì)，具有重要的生理功能，在食品、飼料、化工和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[1-2]。研究表明，L-高絲氨酸可以誘導(dǎo)植物免疫反應(yīng)，增加植物對(duì)疾病的抵抗力[3]。在雛雞日糧中添加L-高絲氨酸，可以替代蘇氨酸改善幼雛的生長(zhǎng)性能。作為一種重要的醫(yī)藥中間體，L-高絲氨酸可合成具有抗癌活性物質(zhì)生物堿和神經(jīng)酰胺等藥物，而且還可用于合成低毒性除草劑L-草銨膦[4]。此外，L-高絲氨酸也是一種重要的C4平臺(tái)化學(xué)品，可用于γ-丁內(nèi)酯、丙烯酸和1,3-丙二醇等多種大宗化學(xué)品的合成[5-7]。近年來(lái)，隨著對(duì)L-高絲氨酸研究的不斷深入和下游產(chǎn)品的持續(xù)開(kāi)發(fā)，L-高絲氨酸需求量迅速增大，市場(chǎng)規(guī)模持續(xù)提升。

微生物發(fā)酵法具有環(huán)境友好、周期短、過(guò)程容易控制等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于氨基酸和有機(jī)酸等化合物的工業(yè)生產(chǎn)[8-10]。近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-高絲氨酸越來(lái)越受到關(guān)注[11-15]。發(fā)酵法生產(chǎn)L-高絲氨酸的關(guān)鍵是菌種選育，需要對(duì)菌株進(jìn)行不斷地測(cè)試和改造，以獲得最優(yōu)的生產(chǎn)菌株。在此過(guò)程中存在大量的L-高絲氨酸分析檢測(cè)工作，然而目前L-高絲氨酸的檢測(cè)方法非常有限。常用的檢測(cè)方法主要是HPLC，此法雖然靈敏度、準(zhǔn)確度高，但對(duì)儀器精密度和設(shè)備要求較高，且需要鄰苯二甲醛(O-phthalaldehyde, OPA)、2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene, DNFB)等柱前衍生[11,15]，步驟繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)于樣品多、工作量大的L-高絲氨酸生產(chǎn)菌的高通量篩選并不適用。因此，本研究建立了一種基于雙酶偶聯(lián)的L-高絲氨酸快速檢測(cè)方法。該方法將L-高絲氨酸濃度與NADH濃度關(guān)聯(lián)，具有結(jié)果準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、能同時(shí)檢測(cè)大批量樣本等優(yōu)點(diǎn)，可用于發(fā)酵液中L-高絲氨酸含量的測(cè)定和L-高絲氨酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、BL21(DE3)由中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所保藏。大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET21b由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑

甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、色氨酸(Trp)、絲氨酸(Ser)、酪氨酸(Tyr)、半胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Met)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、蘇氨酸(Thr)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和組氨酸(His)，北京索萊寶生物科技有限公司；L-高絲氨酸、L-亮氨酸脫氫酶、L-乳酸脫氫酶，上海源葉生物試劑有限公司；NADH，碧云天試劑公司；限制性內(nèi)切酶NdeI、XhoI、T4 DNA連接酶、蛋白Marker、Phusion DNA聚合酶，Thermo Fisher公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒，天根生物公司；氨芐青霉素(ampicillin, Amp)、磷酸吡哆醛(pyridoxal phosphate, PLP)、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl -β-D- thiopyrangalactoside, IPTG)、咪唑，索萊寶生物科技有限公司；其他試劑如Na2HPO4、NaH2PO4、NaCl等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5.0，胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0，氨芐青霉素0.1。固體培養(yǎng)基加20 g/L的瓊脂粉。

1.2 儀器與設(shè)備

Synergy NEO2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek儀器有限公司；搖床，美國(guó)精騏有限公司；Scientz-ⅡD超聲破碎儀，寧波新芝公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendoff股份公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

氨基酸含量測(cè)定方法：色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA色譜柱(4.6 mm × 150 mm，5 μm)；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；流動(dòng)相：A：40 mmol/L磷酸二氫鈉溶液(pH=7.8)，B：V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=45∶45∶10。流速2.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm；柱溫40 ℃。自動(dòng)衍生化進(jìn)樣程序：吸取0.4 mol/L硼酸緩沖液(pH=10)2.5 μL，吸取待測(cè)樣品0.5 μL，自動(dòng)混合2次，等待0.5 min；吸取OPA衍生溶液0.5 μL，自動(dòng)混合2次；吸取水32 μL，自動(dòng)混合2次，進(jìn)樣。自動(dòng)梯度洗脫程序：0～1.9 min，100%流動(dòng)相A；1.9～18.1 min，43%流動(dòng)相A，57%流動(dòng)相B；18.1～18.6 min，100%流動(dòng)相B；18.6～22.3 min，100%流動(dòng)相B；22.3～26 min，100%流動(dòng)相A。有機(jī)酸含量檢測(cè)方法：色譜柱采用Bio-Rad Aminex HPX-87H Column；流動(dòng)相為5 mmol/L的硫酸溶液；流速0.6 mL/min；柱溫40 ℃。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 重組菌E.coliBL21(pET21b-cgl)的構(gòu)建

采用Phusion DNA聚合酶，以合成的cgl基因?yàn)槟０?，通過(guò)PCR方法獲得基因片段。然后用NdeI和XhoI雙酶切cgl基因片段和質(zhì)粒pET21b，連接酶切后的片段，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)中，涂布于含100 μg/mL Amp的LB平板上，提取質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞中，獲得重組菌E.coliBL21(pET21b-cgl)。

1.3.2 胱硫醚γ-裂解酶誘導(dǎo)表達(dá)和純化

將過(guò)夜培養(yǎng)的重組菌E.coliBL21(pET21b-cgl)按照1%接種量接種含有100 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至菌液OD600值為0.6，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，16 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。4 ℃、6 000 r/min離心收集菌體，加入適量裂解緩沖液(20 mmol/L Na2HPO4，200 mmol/L NaCl，pH 7.5)重懸，冰水浴超聲破碎處理20 min，隨后在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液即為粗酶液。采用鎳柱親和層析的方法對(duì)含有His標(biāo)簽的胱硫醚γ-裂解酶進(jìn)行純化，用保存緩沖液[20 mmol/L Na2HPO4溶液，5%(體積分?jǐn)?shù))甘油，pH 7.5]進(jìn)行超濾，除去咪唑，分裝保存于-80 ℃冰箱中。用SDS-PAGE方法檢測(cè)粗酶液和純化的胱硫醚γ-裂解酶，并用Bradford方法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 胱硫醚γ-裂解酶催化L-高絲氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的確定

胱硫醚γ-裂解酶催化L-高絲氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)HPLC測(cè)定。反應(yīng)體系為100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，10 mmol/LL-高絲氨酸，0.1 mmol/L PLP，并加入50 μg酶液，反應(yīng)體積為1 mL，37 ℃反應(yīng)30 min后，加鹽酸終止反應(yīng)，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，用于HPLC分析。

1.3.4 α-酮酸還原酶的確定

為了確定合適的α-酮酸還原酶，分別在反應(yīng)體系中加入乳酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶，測(cè)定NADH的消耗量。反應(yīng)體系為0.1 g/LL-高絲氨酸，100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，0.5 mmol/L NADH，0.1 mmol/L PLP，10 μg胱硫醚γ-裂解酶，反應(yīng)體積為200 μL。同時(shí)向體系中分別添加50 U/mL的乳酸脫氫酶和亮氨酸脫氫酶，在37 ℃測(cè)量340 nm處吸光度的變化值。

1.3.5 胱硫醚γ-裂解酶催化底物特異性的測(cè)定

將常見(jiàn)的20種氨基酸配制成質(zhì)量濃度為10.0 g/L，添加到反應(yīng)液中，反應(yīng)體系為100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，0.5 mmol/L NADH，0.1 mmol/L PLP，10 μg胱硫醚γ-裂解酶，氨基酸終質(zhì)量濃度為0.5 g/L，反應(yīng)體積為200 μL，檢測(cè)10 min 內(nèi)340 nm處的吸光度的變化，以反應(yīng)體系中去離子水取代氨基酸為對(duì)照。

1.3.6 胱硫醚γ-裂解酶酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

胱硫醚γ-裂解酶的活性是通過(guò)偶聯(lián)乳酸脫氫酶來(lái)測(cè)定的。反應(yīng)體系為100 mmol/L Na2HPO4緩沖液(pH 7.5)，4 mmol/LL-高絲氨酸，0.5 mmol/L NADH，0.1 mmol/L PLP，10 μg胱硫醚γ-裂解酶，50 U/mL乳酸脫氫酶，反應(yīng)體積為200 μL。在此條件下，分別測(cè)定胱硫醚γ-裂解酶的最適溫度，最適pH和動(dòng)力學(xué)常數(shù)。酶活力單位定義:在40 ℃、pH 7.5條件下，1 min催化消耗1 nmol NADH的酶量為1個(gè)酶活力單位(1 U)。

1.3.7 胱硫醚γ-裂解酶檢測(cè)L-高絲氨酸反應(yīng)條件的確定

在1.3.6中反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)反應(yīng)體系中胱硫醚γ-裂解酶的濃度、乳酸脫氫酶的濃度、輔因子NADH的濃度和輔酶PLP的濃度進(jìn)行優(yōu)化，測(cè)定340 nm處吸光度的減少，以確定最佳的反應(yīng)體系。

1.3.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線制定

準(zhǔn)確配制10.0 g/LL-高絲氨酸樣品，加入到反應(yīng)體系中，使L-高絲氨酸終質(zhì)量濃度分別為0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1 g/L。根據(jù)1.3.6測(cè)定方法，在1.3.7確定的最適條件下，以不加L-高絲氨酸的反應(yīng)體系為空白對(duì)照，在340 nm處測(cè)定其吸光度，以L-高絲氨酸濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度變化值為縱坐標(biāo)，繪制回歸曲線。

1.3.9 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

取L-高絲氨酸發(fā)酵液，加入不同濃度L-高絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液混勻，以發(fā)酵培養(yǎng)基為空白對(duì)照，分別檢測(cè)對(duì)照樣本及回收樣本，平行檢測(cè)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 胱硫醚γ-裂解酶的表達(dá)及純化

2.1.1 胱硫醚γ-裂解酶重組質(zhì)粒的構(gòu)建

胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase，EC4.4.1.1)，是一種磷酸吡哆醛依賴酶，能催化胱硫醚γ位裂解，脫去NH3后生成α-酮酸。本研究從BRENDA數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇具有較高活性的來(lái)源于家鼠(Rattusnorvegicus)的胱硫醚γ-裂解酶(RnCGL)，該酶由cgl基因(NCBI-GeneID：24962)編碼，含有398個(gè)氨基酸。將上述基因按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，由金斯瑞生物科技公司合成。將目的基因連接至pET21b表達(dá)載體上，并且在C末端加上組氨酸標(biāo)簽用于后期表達(dá)純化。利用通用引物T7和T7 Ter對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證。如圖1所示，經(jīng)核酸電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物條帶大小位于1 000～2 000 bp，與預(yù)期結(jié)果相符。隨后將重組質(zhì)粒利用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切驗(yàn)證，電泳圖譜上可見(jiàn)有5 500 bp左右的質(zhì)粒骨架條帶和1 200 bp左右的基因片段條帶，說(shuō)明重組質(zhì)粒pET21b-cgl構(gòu)建正確。

泳道1-PCR驗(yàn)證；泳道2-雙酶切驗(yàn)證；M-DNA ladder Marker圖1 質(zhì)粒PCR和酶切驗(yàn)證Fig.1 Verification of plasmid by PCR and restriction enzyme digestion

2.1.2 RnCGL的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將含有表達(dá)質(zhì)粒pET21b-cgl的重組菌株E.coliBL21(DE3)在37 ℃下培養(yǎng)至OD600值為0.6左右，加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG于16 ℃誘導(dǎo)約20 h，離心收集菌體，超聲破碎，采用鎳柱親和層析方法純化胱硫醚γ-裂解酶，并對(duì)粗酶液和純酶進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果如圖2所示，純化后RnCGL蛋白條帶單一，蛋白分子質(zhì)量約為40 kDa，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致，說(shuō)明該蛋白在E.coliBL21中成功表達(dá)。

泳道1-破碎上清液；泳道2-破碎沉淀；泳道3-穿柱液； 泳道4-洗雜液；泳道5-100 mmol/L咪唑洗脫液；泳道6-200 mmol/L 咪唑洗脫液；泳道7-300 mmol/L咪唑洗脫液；泳道8-400 mmol/L 咪唑洗脫液；泳道9-500 mmol/L咪唑洗脫液；M-protein ladder Marker圖2 SDS-PAGE檢測(cè)分析RnCGLFig.2 SDS-PAGE analysis of RnCGL

2.2 雙酶偶聯(lián)法測(cè)定L-高絲氨酸方法的建立

2.2.1 雙酶偶聯(lián)法測(cè)定L-高絲氨酸含量的原理

L-高絲氨酸在胱硫醚γ-裂解酶(RnCGL)催化下脫去氨基生成α-酮酸，α-酮酸在脫氫酶的催化作用下，與NADH偶聯(lián)發(fā)生還原反應(yīng)生成醇酸。NADH在340 nm吸光度處有吸光度，其下降速率與L-高絲氨酸濃度呈正比。反應(yīng)方程式(1)如下：

(1)

2.2.2 RnCGL催化L-高絲氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的確定

研究表明，RnCGL催化L-高絲氨酸發(fā)生γ消除反應(yīng)，生成的產(chǎn)物為α-丁酮酸和氨[反應(yīng)方程式(1)]。本研究利用HPLC方法檢測(cè)確定RnCGL催化L-高絲氨酸的反應(yīng)產(chǎn)物，結(jié)果如圖3所示，反應(yīng)體系中產(chǎn)物相對(duì)單一，一個(gè)為高絲氨酸底物峰，另一個(gè)為α-丁酮酸產(chǎn)物峰，且產(chǎn)物峰與標(biāo)準(zhǔn)品α-丁酮酸出峰時(shí)間完全一致，說(shuō)明RnCGL能夠催化L-高絲氨酸裂解生成α-丁酮酸，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符[16]。

2.2.3 α-丁酮酸與NADH偶聯(lián)反應(yīng)的建立

亮氨酸脫氫酶(leucine dehydrogenase，EC1.4.1.9)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，EC1.1.1.27)是依賴NAD(H)的氧化還原酶，可選擇性催化多種脂肪族2-氧代酸或α-酮酸還原為相應(yīng)的α-氨基酸及其衍生物。因此，本研究首先嘗試?yán)昧涟彼崦摎涿复呋?丁酮酸的反應(yīng)偶聯(lián)NADH。但實(shí)驗(yàn)結(jié)果并沒(méi)有檢測(cè)到在340 nm(NADH氧化)下吸光度的下降。說(shuō)明在該體系中亮氨酸脫氫酶不能有效發(fā)揮作用，可能原因是亮氨酸脫氫酶還原過(guò)程中不僅需要NADH，還需要銨根離子，盡管該體系中L-高絲氨酸裂解可生產(chǎn)部分銨根離子，但是濃度很低，從而影響酶活性。接下來(lái)，嘗試?yán)萌樗崦摎涿复呋摲磻?yīng)。結(jié)果如圖4所示，在340 nm處吸光度隨著時(shí)間的增加而下降，說(shuō)明NADH發(fā)生反應(yīng)生成NAD+。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，本研究將L-高絲氨酸濃度與NADH濃度變化相偶聯(lián)，建立了基于雙酶偶聯(lián)的L-高絲氨酸測(cè)定方法，即RnCGL將L-高絲氨酸裂解為α-丁酮酸，生成的α-丁酮酸在乳酸脫氫酶的催化下消耗NADH生成2-羥基丁酸。在反應(yīng)過(guò)程中，NADH減少量與L-高絲氨酸濃度呈正比。

圖4 α-丁酮酸與NADH偶聯(lián)反應(yīng)的建立Fig.4 The coupling relationship of α-ketobutyric acid and NADH

2.2.4 雙酶偶聯(lián)L-高絲氨酸檢測(cè)法特異性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證基于雙酶偶聯(lián)的L-高絲氨酸測(cè)定方法的特異性，本研究分別以20種常用氨基酸為底物，在10 min內(nèi)監(jiān)測(cè)340 nm處吸光度的變化量，并以不加氨基酸底物的體系作為空白對(duì)照。如圖5-a所示，在10 min內(nèi)L-高絲氨酸在340 nm處吸光度下降值為0.26，而其他氨基酸在該體系中340 nm處吸光度均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明該方法能夠特異性地檢測(cè)L-高絲氨酸。此外，為確定該方法中L-高絲氨酸檢測(cè)是否受到其他氨基酸干擾，本研究配制含有等量L-高絲氨酸和20種氨基酸的混合液，并利用雙酶體系檢測(cè)方法對(duì)該混合液進(jìn)行檢測(cè)，以等濃度的L-高絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液為對(duì)照。結(jié)果如圖5-b所示，混合液在340 nm處的吸光度下降值與對(duì)照組只有L-高絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液的減少量基本相當(dāng)。結(jié)果說(shuō)明，該方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，不會(huì)受到其他氨基酸的干擾。

a-雙酶偶聯(lián)方法檢測(cè)20種氨基酸的吸光度下降值； b-氨基酸混合液對(duì)L-高絲氨酸檢測(cè)方法的影響圖5 雙酶偶聯(lián)L-高絲氨酸檢測(cè)法特異性的驗(yàn)證Fig.5 Verification of the specificity of the double-enzyme coupling method for L-homoserine detection

2.3 RnCGL酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定

2.3.1 溫度對(duì)酶活性的影響

為進(jìn)一步確定和優(yōu)化基于雙酶體系的L-高絲氨酸測(cè)定方法，本研究對(duì)RnCGL的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，分別探究溫度和pH對(duì)其酶活性的影響。在pH 8.0的100 mmol/L Na2HPO4緩沖液中，分別測(cè)定RnCGL在25、30、35、37、40、45 ℃條件下酶活性。結(jié)果如圖6-a所示，重組酶RnCGL在25～45 ℃均有活性，在25～40 ℃，酶活性隨著溫度的升高逐漸提高，在40 ℃時(shí)酶活性達(dá)到最高為125 U/mg。由于雙酶偶聯(lián)檢測(cè)體系需要保證較高的RnCGL活性，因此確定40 ℃為該反應(yīng)體系的最適溫度。

2.3.2 pH對(duì)酶活性的影響

在40 ℃最適溫度條件下，分別測(cè)定RnCGL在不同pH條件下的Na2HPO4緩沖體系中的酶活性，其中pH條件設(shè)定為6.0、7.0、7.5和8.0。結(jié)果如圖6-b所示，重組酶RnCGL在pH 6.0～8.0均有酶活性，在pH 6.0～7.5，CGL酶活性持續(xù)升高，在pH 7.5時(shí)酶活性達(dá)到最高為145 U/mg。但隨著pH繼續(xù)升高，酶活性反而降低。結(jié)果表明pH 7.5為RnCGL的最適pH。

2.3.3 動(dòng)力學(xué)常數(shù)測(cè)定

在確定的RnCGL最適催化溫度和pH反應(yīng)條件下(pH 7.5、40 ℃)，對(duì)RnCGL的動(dòng)力學(xué)常數(shù)進(jìn)行了測(cè)定。分別測(cè)定在L-高絲氨酸0～10 mmol/L濃度下的酶活性，并按照Lineweaver-Burk的方法利用雙倒數(shù)作圖求算RnCGL對(duì)底物L(fēng)-高絲氨酸的Km和Vmax。結(jié)果如圖6-c和圖6-d所示，RnCGL在以L-高絲氨酸為底物時(shí)，動(dòng)力學(xué)常數(shù)Km為6.76 mmol/L，最大反應(yīng)速率Vmax為217.39 U/mg。

a-溫度對(duì)RnCGL酶活性的影響；b-pH對(duì)RnCGL酶活性的影響；c-RnCGL在不同L-高絲氨酸濃度下酶活性擬合； d-雙倒數(shù)分析RnCGL動(dòng)力學(xué)常數(shù)圖6 RnCGL酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定Fig.6 Determination of the enzymatic properties of RnCGL

2.3.4 保存時(shí)間對(duì)RnCGL酶活性的影響

分別在純化的第1天、第10天、第20天、第30天取出保存于-80 ℃冰箱的RnCGL，測(cè)定其比酶活力，分別為27.87、31.30、28.30、33.87 U/mg。結(jié)果表明RnCGL在-80 ℃條件下保存30 d后，比酶活力無(wú)明顯變化，說(shuō)明RnCGL具有良好的穩(wěn)定性，無(wú)需每次重新表達(dá)純化，可現(xiàn)取現(xiàn)用。

2.4 單因素優(yōu)化L-高絲氨酸檢測(cè)系統(tǒng)中各組分含量

2.4.1 RnCGL濃度優(yōu)化

RnCGL的酶量直接影響反應(yīng)速率，在一定底物濃度下，反應(yīng)體系中酶應(yīng)過(guò)量。向反應(yīng)體系中加入2、6、10、12、13 U/mL的胱硫醚γ-裂解酶，結(jié)果如圖7-a所示，反應(yīng)速率隨酶量的增加而變大，當(dāng)酶量為12 U/mL時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到最大，且再增加酶量，反應(yīng)速率也不再增加，最終確定在L-高絲氨酸質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)，RnCGL的濃度為12 U/mL。

2.4.2 乳酸脫氫酶濃度優(yōu)化

偶聯(lián)的乳酸脫氫酶的濃度影響檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，只有在偶聯(lián)的乳酸脫氫酶處于過(guò)量時(shí)，乳酸脫氫酶的濃度才不是限制因素。向反應(yīng)體系中加入12.5、25、50、75、100、150 U/mL的乳酸脫氫酶，結(jié)果如圖7-b所示，當(dāng)乳酸脫氫酶的量為50、75、100、150 U/mL時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到最大，且基本不再變化。因此，選擇乳酸脫氫酶的濃度為50 U/mL。

2.4.3 NADH濃度優(yōu)化

輔因子NADH的濃度直接影響反應(yīng)速率和中間產(chǎn)物α-丁酮酸的生成。向反應(yīng)體系中加入終濃度為0.25、0.5、1、1.5 mmol/L的NADH，結(jié)果如圖7-c所示，當(dāng)NADH的濃度為0.25 mmol/L時(shí)，反應(yīng)速率較慢，而當(dāng)NADH的濃度為0.5、1、1.5 mmol/L時(shí)，反應(yīng)速率達(dá)到最大，因此，選擇NADH的濃度為0.5 mmol/L。

2.4.4 PLP濃度優(yōu)化

輔酶PLP也參與胱硫醚γ-裂解酶催化L-高絲氨酸的反應(yīng)，輔酶的濃度也限制反應(yīng)速率。當(dāng)反應(yīng)體系中PLP的濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 mmol/L時(shí)，結(jié)果如圖7-d所示，隨著PLP濃度的增加，反應(yīng)速率變化不大，說(shuō)明0.1 mmol/L的PLP已經(jīng)足夠催化反應(yīng)，所以確定PLP的濃度為0.1 mmol/L。

a-RnCGL濃度對(duì)檢測(cè)體系效率的影響；b-LDH濃度對(duì)檢測(cè)體系效率的影響；c-NADH濃度對(duì)檢測(cè)體系效率的影響； d-PLP濃度對(duì)檢測(cè)體系效率的影響圖7 單因素優(yōu)化雙酶偶聯(lián)L-高絲氨酸檢測(cè)體系中各組分的含量Fig.7 Single factor optimization of the component concentration in the enzyme-coupled L-homoserine detection system

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

根據(jù)1.3.8的方法，在反應(yīng)體系中分別加入終質(zhì)量濃度為0.005～0.1 g/L的L-高絲氨酸，測(cè)定10 min內(nèi)在340 nm處吸光度的下降值。結(jié)果表明，L-高絲氨酸終質(zhì)量濃度在0.005～0.1 g/L，吸光度的減少值(ΔOD340值)和L-高絲氨酸濃度呈良好的線性關(guān)系。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=3.72X+0.024，R2為0.998 2。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2接近于1，說(shuō)明ΔOD值和L-高絲氨酸濃度的線性關(guān)系較為理想，檢測(cè)范圍為0.005～0.1 g/L，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)范圍寬，適用于L-高絲氨酸濃度的檢測(cè)。

2.6 雙酶偶聯(lián)檢測(cè)方法的回收率測(cè)定

取L-高絲氨酸發(fā)酵液，在反應(yīng)體系中分別加入終質(zhì)量濃度為10、20、30 g/L的L-高絲氨酸標(biāo)準(zhǔn)液振蕩混勻，將混合液稀釋到標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測(cè)范圍以內(nèi)，利用雙酶偶聯(lián)檢測(cè)方法測(cè)定L-高絲氨酸的回收率。結(jié)果如表1所示，HPLC和酶法測(cè)定發(fā)酵液中L-高絲氨酸質(zhì)量濃度分別為12.4、12.1 g/L，2種方法結(jié)果基本一致。通過(guò)加標(biāo)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，雙酶偶聯(lián)檢測(cè)方法平均回收率達(dá)到98.87%。結(jié)果表明，本方法能滿足發(fā)酵過(guò)程中L-高絲氨酸定量的要求。

表1 發(fā)酵液中L-高絲氨酸回收率測(cè)定Table 1 Determination of L-homoserine recovery in fermentation broth

3 結(jié)論

本方法利用胱硫醚γ-裂解酶和乳酸脫氫酶偶聯(lián)催化，將L-高絲氨酸濃度與NADH在340 nm處吸光度變化相關(guān)聯(lián)，建立了一種簡(jiǎn)單快速、專(zhuān)一性強(qiáng)的L-高絲氨酸檢測(cè)技術(shù)。通過(guò)測(cè)定RnCGL的酶學(xué)性質(zhì)和酶催化體系各組分濃度，最終確定該方法的測(cè)定溫度為40 ℃，pH 7.5，RnCGL為12 U/mL，乳酸脫氫酶為50 U/mL，NADH 0.5 mmol/L，PLP 0.1 mmol/L，測(cè)定范圍為0.005～0.1 g/L。本方法分析儀器簡(jiǎn)單，試劑價(jià)格低廉，準(zhǔn)確性高，能在較短時(shí)間內(nèi)完成L-高絲氨酸含量的檢測(cè)，能夠適用于L-高絲氨酸菌株選育過(guò)程中大批量樣品的檢測(cè)工作。而且本方法可實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液樣品的高通量檢測(cè)，為L(zhǎng)-高絲氨酸高產(chǎn)菌種的高通量篩選和選育提供了重要技術(shù)保障。