急性溫度脅迫對縊蟶不同組織脂質(zhì)過氧化及抗氧化生理響應的影響

方佳琪，張敏,2,3*，鄭凱，賈淼，李奇勛，李玉申，王紅婷

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(上海海洋大學)，上海，201306) 3(上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評價專業(yè)技術(shù)服務平臺，上海，201306)

縊蟶(Sinonovaculaconstricta)是瓣鰓綱竹蟶科貝類動物，俗稱蟶子，在北方稱之為蜻?？O蟶廣泛分布于中國沿海地區(qū)，是中國四大養(yǎng)殖貝類之一，也是浙江、福建等地重要的養(yǎng)殖品種[1]?？O蟶含有豐富的碳水化合物和灰分，并以高蛋白和低熱量的特點深受消費者喜愛。隨著縊蟶養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，培育出的優(yōu)良品種具有生長周期短、成本低、經(jīng)濟效益高等優(yōu)點[2]，同時縊蟶池塘養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸擴大，但天氣變化[3]和季節(jié)更替[4]常常引起池塘水體溫度的劇烈波動，對其生長和存活造成不利影響。因此，研究溫度變化對縊蟶的影響具有重要的現(xiàn)實意義。

溫度是影響貝類生長及代謝的重要環(huán)境因子，溫度的急劇變化會引起貝類的多種應激反應，使生理代謝加速并導致其耗氧量大幅增加，當貝類長時間處于這種應激狀態(tài)下，機體進一步生成活性氧并大量積累[5-6]。楊儉等[7]研究了文蛤(Meretrixmeretrix)在不同急性溫度(20、25、30、35 ℃)脅迫下的生理響應，發(fā)現(xiàn)由于溫度的上升提高了文蛤體內(nèi)相關(guān)酶的活性，加快了生化反應的速率，導致了耗氧率的升高；孟廣瑋等[8]研究了長牡蠣(Crassostreagigas)在溫度漸升和溫度突升脅迫下的存活情況，發(fā)現(xiàn)高溫脅迫會導致長牡蠣內(nèi)臟團中過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)以及丙二醛(malondialdehyde, MDA)顯著上升。李曉英等[9]在對青蛤(CyclinasinensisGmelin)過氧化物酶(peroxidase, POD)的研究中發(fā)現(xiàn)，青蛤機體內(nèi)不同組織受到的氧化應激程度各不相同，溫度驟升脅迫引起青蛤機體中POD的大量表達，在各組織中肝胰腺POD活性最高，其次為外套膜和鰓瓣。貝類機體應激脅迫狀態(tài)下常常伴隨著抗氧化酶活性的變化，其中SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)以及T-AOC被認為是研究氧化應激的重要指標[10]。目前，國內(nèi)外學者在溫度脅迫對貝類生理機能的影響方面進行了大量的研究，但對縊蟶溫度脅迫的研究均限于單一組織，而對縊蟶不同組織的氧化應激和生理代謝的研究少有報道。因此，本研究以縊蟶為試驗對象，探討縊蟶外套膜、鰓和消化腺組織中抗氧化酶活性和活性氧代謝物質(zhì)在急性溫度脅迫(25、28、30、32、35 ℃)下的變化規(guī)律，旨在為縊蟶主要組織的氧化應激響應機制提供更完善的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用縊蟶于2021年4月購自上海市浦東新區(qū)南匯新城鎮(zhèn)蘆潮港集貿(mào)市場，1 h內(nèi)運至實驗室，殼長(5.8±0.3) cm，殼寬(2.1±0.2) cm。挑選富有活力且雙殼均無破損的縊蟶作為試驗研究對象。

超氧化物歧化酶測試盒、過氧化氫酶測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶測試盒、總抗氧化能力測試盒、丙二醛測試盒、過氧化氫測試盒、谷胱甘肽測試盒、總蛋白定量測試盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

BPS-100CA 型恒溫恒濕箱，上海一恒科學儀器有限公司；AUW320 型分析天平，上海亞津電子科技有限公司；FSH-2A 型勻漿機，江蘇金怡儀器科技有限公司；H-2050R 型離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗設計

為使縊蟶處在適宜的生長代謝環(huán)境，且減少鹽度改變導致滲透壓的變化帶來的應激反應，首先在大塑料箱中配制鹽度為(18±0.5) ‰的人工海水，并用增氧泵持續(xù)充氣，不斷增加溶解氧，使水中溶氧量≥4.0 mg/L，形成一個小型暫養(yǎng)池。將帶有泥沙的縊蟶清洗干凈后分裝在2個塑料筐中，完全浸沒于大塑料箱人工海水中進行暫養(yǎng)，貝水比(體積比)約為1∶3，每隔3 h換1次水，在整個暫養(yǎng)過程中使暫養(yǎng)池水溫保持在(20±1) ℃。

試驗設置25、28、30、32、35 ℃共5個溫度組，每個溫度組3個平行，每個平行100只縊蟶。暫養(yǎng)結(jié)束后，隨機選取規(guī)格相近的縊蟶，平均體質(zhì)量為(15±0.6) g。將縊蟶由暫養(yǎng)池中取出，直接轉(zhuǎn)移至恒溫恒濕箱中，在溫度脅迫4 h后取樣，每個平行組隨機取3只縊蟶。

1.3.2 樣品采集

解剖縊蟶，提取外套膜、鰓和消化腺組織，分別在冷的生理鹽水中漂洗，用濾紙擦干其表面水分后，在分析天平上稱重并移入勻漿管中。同時按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入0.86%(質(zhì)量分數(shù))生理鹽水，冰浴條件下使用勻漿機勻漿，轉(zhuǎn)速為8 000～10 000 r/min。將10%勻漿液用離心機以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min, 所得上清液進行總蛋白定量、抗氧化酶活性以及MDA、H2O2、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量的測定。

1.3.3 SOD、CAT、GPX、T-AOC活性的測定

SOD活性的測定參照南京建成SOD測試盒說明書，采用羥胺法，定義每毫克組織蛋白在1 mL反應液中SOD抑制率達50%時所對應的SOD量為1個SOD活力單位(U)。CAT活性的測定參照南京建成CAT測試盒說明書，采用紫外比色法，定義每毫克組織蛋白中CAT每秒鐘分解吸光度為0.50～0.55的底物中的H2O2相對量為1個CAT活力單位(U)。GPX活性的測定參照南京建成GPX測試盒說明書，采用分光光度法，定義每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶反應的作用，使反應體系中GSH濃度降低1 mol/L為1個GPX活力單位(U)。T-AOC的測定參照南京建成T-AOC測試盒說明書，采用比色法，定義每分鐘每毫克組織蛋白使反應體系的吸光度值每增加0.01時為1個T-AOC活力單位(U)。

1.3.4 MDA、H2O2以及GSH含量的測定

MDA含量的測定參照南京建成MDA測試盒說明書，采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法，結(jié)果以nmol/mg表示；H2O2含量的測定參照南京建成H2O2測試盒說明書，采用分光光度法，結(jié)果以mmol/g表示。GSH含量的測定參照南京建成GSH測試盒說明書，采用比色法，結(jié)果以mg/g表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

應用SPSS 19.0軟件對試驗結(jié)果進行單因素方差分析及Duncan多重比較，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織MDA含量的影響

MDA是細胞膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一[5]。如圖1所示，不同溫度組之間，只有縊蟶消化腺中MDA含量差異顯著(P<0.05)；且隨著脅迫溫度的升高，3個組織中MDA含量均呈現(xiàn)出持續(xù)升高的趨勢，并在35 ℃時達到最大值，分別為6.03、4.96、4.49 nmol/mg，其中35 ℃時消化腺MDA含量大幅上升，是25 ℃的2.6倍，相較于32 ℃上升了53.0%。在同一溫度下，各組織MDA含量由高到低分別為外套膜、鰓、消化腺，與SOD等抗氧化酶的活性變化趨勢相反；除35 ℃鰓和消化腺組織，其他溫度下各組織MDA含量均有顯著性差異(P<0.05)，這表明溫度的升高對縊蟶機體產(chǎn)生的氧化應激較為嚴重，外套膜中脂質(zhì)過氧化作用較鰓和消化腺更為顯著。

圖1 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織MDA含量的影響Fig.1 Effects of acute temperature stress on MDA content in different tissues of Sinonovacula constricta 注：圖中不同小寫字母表示不同溫度組間的差異顯著(P<0.05), 不同大寫字母表示同一溫度組不同組織間的差異顯著(P<0.05) (下同)

2.2 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織H2O2含量的影響

H2O2是一種具有細胞毒性的物質(zhì)，會導致氧化應激和細胞損傷。如圖2所示，在同一溫度下，除28 ℃外，外套膜和消化腺中H2O2含量無顯著性差異(P>0.05)，且與鰓中差異顯著(P<0.05)。隨著脅迫溫度的升高，鰓和消化腺中H2O2含量持續(xù)升高，而外套膜中H2O2含量則呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢；整體來看，3個組織H2O2含量均在35 ℃時達到最大值，分別為184.52、162.74、180.30 mmol/g。在較高溫度的脅迫下，對比3個組織，外套膜中H2O2含量上升幅度最大，35 ℃時相較于32 ℃上升了25.0%，而消化腺上升幅度最小，僅比32 ℃上升了18.4%，這表明在高溫環(huán)境下消化腺中活性氧積累速率較慢，且清除H2O2的能力強于外套膜。

圖2 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織H2O2含量的影響Fig.2 Effects of acute temperature stress on H2O2 content in different tissues of Sinonovacula constricta

2.3 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織SOD活性的影響

圖3 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織SOD活性的影響Fig.3 Effects of acute temperature stress on SOD activity in different tissues of Sinonovacula constricta

2.4 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織CAT活性的影響

CAT能夠直接將 H2O2分解為H2O[5]，其活性變化如圖4所示。與SOD類似的是，在同一溫度下3個不同組織之間的CAT活性有著顯著性差異(P<0.05)，其中消化腺中CAT活性最高，鰓次之，外套膜最低。不同溫度組之間，隨著脅迫溫度的升高，外套膜和消化腺中CAT活性均呈現(xiàn)出持續(xù)降低的趨勢；在鰓中，其CAT活性先升高后降低，但25和28 ℃組CAT活性無顯著差異(P>0.05)。3個組織CAT活性均在35 ℃時達到最小值，分別為7.33、10.63、19.87 U/mg，其中外套膜中CAT活性下降得最快，較峰值下降了22.6%，這表明縊蟶機體內(nèi)CAT活性與溫度變化呈負相關(guān)，且溫度越高，CAT失活越快，各組織內(nèi)CAT失活速率由高到低分別為外套膜、鰓、消化腺。

圖4 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織CAT活性的影響Fig.4 Effects of acute temperature stress on CAT activity in different tissues of Sinonovacula constricta

2.5 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織GPX活性的影響

GPX能與SOD、CAT協(xié)同作用，進一步將H2O2分解為無毒性物質(zhì)[11]，其活性變化如圖5所示。同一溫度下各組活性出現(xiàn)了明顯下降的趨勢，且與32 ℃差異顯著(P<0.05)；而消化腺中GP織GPX活性有顯著性差異(P<0.05), 由高到低分別為消化腺、鰓、外套膜，表明在縊蟶消化腺中GPX受溫度影響被大量激活。外套膜和鰓中GPX活性隨著脅迫溫度的持續(xù)升高均呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，在32 ℃時達到峰值，分別為93.13、119.52 U/mg，當脅迫溫度為35 ℃時，鰓中GPX活性則在35 ℃組達到峰值，為172.36 U/mg, 較25 ℃上升了17.1%，并相較其他溫度組均有顯著性差異(P<0.05)，這表明消化腺中GPX活性與溫度變化呈正相關(guān)，與CAT活性持續(xù)下降的趨勢不一致。

圖5 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織GPX活性的影響Fig.5 Effects of acute temperature stress on GPX activity in different tissues of Sinonovacula constricta

2.6 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織GSH含量的影響

GSH是一種重要的非酶類抗氧化劑，能清除機體內(nèi)的活性氧，保護細胞不被氧化[12]。如圖6所示，縊蟶3個組織中GSH含量在高溫脅迫條件下差異顯著(P<0.05)，其中消化腺中最高，鰓中次之，外套膜中最低，這與SOD等抗氧化酶的活性變化趨勢相一致。不同溫度的脅迫對縊蟶各組織GSH含量的影響也各不相同，鰓和消化腺中GSH含量均在28 ℃熱水應激下達到最大值，分別為31.53、38.25 mg/g，其中28 ℃消化腺中GSH含量與30 ℃脅迫差異顯著(P<0.05)；在35 ℃時，鰓和消化腺中GSH含量均出現(xiàn)明顯回落，并與其他脅迫溫度有顯著性差異(P<0.05)。外套膜中GSH含量則始終處于較低水平，可見外套膜細胞缺少足夠的GSH進行保護，溫度升高產(chǎn)生的氧化損傷較鰓和消化腺嚴重。

圖6 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織GSH含量的影響Fig.6 Effects of acute temperature stress on GSH content in different tissues of Sinonovacula constricta

2.7 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織T-AOC的影響

T-AOC體現(xiàn)了機體防御體系抗氧化能力的整體水平[13]，其變化趨勢如圖7所示。隨著脅迫溫度的升高，縊蟶3個組織中T-AOC均先升高后降低，且在28 ℃ 時T-AOC達到峰值，分別為5.21、8.42、10.52 U/mg。當溫度繼續(xù)升高時，T-AOC出現(xiàn)了明顯的回落，其中30、32以及35 ℃的T-AOC較28 ℃顯著下降(P<0.05)，尤其在35 ℃時，外套膜、鰓和消化腺的T-AOC相較于峰值分別降低了35.6%、29.1%和25.2%，與SOD活性的變化趨勢一致。在同一溫度下，各組織中T-AOC存在顯著性差異(P<0.05)，消化腺中最高，鰓中次之，外套膜中最低，這與SOD、CAT、GPX這些抗氧化酶相一致，可見縊蟶機體抗氧化防御能力與SOD等抗氧化酶活性高低緊密相關(guān)，也表明了縊蟶消化腺的總抗氧化防御能力高于鰓和外套膜。

圖7 急性溫度脅迫對縊蟶不同組織T-AOC的影響Fig.7 Effects of acute temperature stress on T-AOC in different tissues of Sinonovacula constricta

3 討論

逆境條件下機體產(chǎn)生的氧自由基會攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)，通過脂質(zhì)過氧化作用，生成大量脂質(zhì)氫過氧化物(lipid hydroperoxide，LOOH)[14]，使縊蟶顏色、香味和質(zhì)地發(fā)生改變。與此同時，脂質(zhì)過氧化反應還會形成MDA等有毒物質(zhì)，導致縊蟶肌肉進一步發(fā)生有害變化。MDA作為氧化終產(chǎn)物之一，通過其含量高低可以判斷機體受到自由基損傷的程度以及肉質(zhì)是否出現(xiàn)異味或酸敗現(xiàn)象[15]。本研究中，各組織中MDA含量隨著脅迫溫度的升高大幅上升，可見高溫顯著影響了縊蟶活性氧代謝，洪美玲等[16]研究了中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis) 20～32 ℃的升溫脅迫過程，同樣發(fā)現(xiàn)脅迫6 h后其MDA含量顯著上升。此外，在較高溫度的脅迫條件下，外套膜中MDA含量顯著高于鰓和消化腺，表明縊蟶外套膜對升溫有著極高的敏感性，細胞膜受損程度嚴重，而在鰓和消化腺中MDA含量得到有效抑制。H2O2是一種氧化性很強的物質(zhì)，在機體活性氧代謝中會穿透細胞膜，與細胞內(nèi)一些金屬離子發(fā)生反應生成具有極強細胞毒性的羥自由基(·OH)，因此H2O2含量也代表了機體活性氧水平[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，溫度脅迫產(chǎn)生的活性氧打破了原有氧化還原循環(huán)的平衡，鰓中H2O2含量顯著低于外套膜和消化腺，推測升溫導致耗氧量的大幅上升，而相較于外套膜和消化腺，鰓作為呼吸器官能進行氧交換，從而補充更多O2維持正常代謝，使得H2O2處在較低水平[18-19]。

T-AOC是衡量機體抗氧化能力的綜合指標[13]。本研究中，各組織T-AOC先升高后降低，與SOD活性的變化趨勢有一致性，可見在縊蟶抗氧化防御體系中，酶促體系起到了主導作用，升溫誘導抗氧化酶水平的升高，SOD在響應氧化應激與清除過量中起重要作用；且在閾值溫度左右，T-AOC達到最大值，表明在該溫度臨界區(qū)間附近，適宜的升溫提高了抗氧化酶的表達以及誘導釋放更多的低分子清除劑，如GSH[12]。而外套膜中T-AOC始終處于較低水平，說明外套膜組織在升溫后仍處于應激狀態(tài)，大量活性氧未得到及時清除，需要更長的時間恢復原有的代謝平衡。

縊蟶的外套膜能夠分泌形成貝殼，同時包裹著內(nèi)臟團，在防護免疫過程中發(fā)揮著作用[23]。鰓是其重要的呼吸器官，能與外界環(huán)境直接作氣體交換，同時也是負責一些酶的生物轉(zhuǎn)化過程的組織器官[24]。雙殼貝類的消化腺主要為肝胰腺，是體內(nèi)的消化器官[25]。本研究中，縊蟶外套膜中主要抗氧化酶活性在響應高溫脅迫帶來的氧化應激時受到了不同程度的抑制，可能由于外套膜同樣也是作為縊蟶抵擋外界有害物質(zhì)入侵機體的第一道防線，組織中抗氧化系統(tǒng)受損較為嚴重；鰓組織在應對高溫脅迫時能及時補充O2從而顯著抑制H2O2的積累；消化腺組織在活性氧代謝過程中，氧化應激促進了抗氧化酶的合成，誘導抗氧化酶活性的升高，有效地減輕了脂質(zhì)過氧化反應帶來的生物膜損傷。

4 結(jié)論

在25～35 ℃溫度脅迫下，相比外套膜和鰓，縊蟶消化腺維持著最高的SOD、T-AOC活性以及GSH含量，且隨溫度升高而先升高后降低，在28 ℃達到最高值。此外，縊蟶CAT活性持續(xù)下降并于35 ℃時達到最低值，而GPX活性則呈現(xiàn)出不斷升高的趨勢?？O蟶3個組織中MDA含量均受脅迫溫度的升高而升高，但在同一脅迫溫度下，消化腺中的MDA積累最少。綜合對比3個組織，消化腺維持著顯著最高的SOD、CAT、GPX、T-AOC活性和GSH含量以及顯著最低的MDA含量，這表明縊蟶消化腺較外套膜和鰓在應對外界升溫脅迫時能更好地引起抗氧化酶的大量表達以及激活非酶促體系，有效地減輕了縊蟶在不利溫度脅迫條件下的氧化損傷。因此，消化腺是縊蟶活性氧代謝的主要場所，同時也是較能代表縊蟶機體抗氧化防御變化的組織。