生漿豆渣混菌發(fā)酵過程中的營養(yǎng)品質(zhì)和功能特性變化規(guī)律

鄭潤敏，戴易祎，謝其輝，彭露湫，王承明

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430070)

在腐竹、豆?jié){、豆腐等豆制品加工過程中，將充分浸泡的大豆進(jìn)行磨漿成為豆糊，然后將豆糊直接進(jìn)行漿渣分離或煮沸后漿渣分離，得到大量的副產(chǎn)物豆渣，前者得到的豆渣為生漿豆渣，后者得到的豆渣為熟漿豆渣[1]。生漿豆渣含有蛋白質(zhì)、脂肪、膳食纖維、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，保留了較多的可溶性蛋白及脂肪[2]，但由于其水分含量很高，易于腐敗變質(zhì)，其中少量豆渣被用作動物飼料，大部分則成為廢料物，這不僅造成了環(huán)境污染，也極大地浪費(fèi)了生產(chǎn)資源[3]。因此，生漿豆渣是一種亟待利用的食品源和營養(yǎng)源。

通過微生物發(fā)酵來利用生漿豆渣是一種可行的方法。目前應(yīng)用于豆渣發(fā)酵的微生物種類有很多，包括毛霉、食用真菌、酵母以及部分細(xì)菌等。高天宇等[4]為消除新鮮豆粕豆渣(豆粕提取大豆蛋白后產(chǎn)生的副產(chǎn)物)中的不良風(fēng)味，采用茯苓菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后豆渣中的不良風(fēng)味成分明顯減少，優(yōu)良風(fēng)味成分明顯增加，整體感官品質(zhì)得到提升。白海軍等[5]利用植物乳桿菌、嗜酸鏈球菌以及雙歧桿菌聯(lián)合發(fā)酵蕓豆渣制備可溶性膳食纖維，并將其用于大鼠灌胃給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后豆渣能夠有效緩解小鼠的運(yùn)動性疲勞。同時，由于豆渣富含膳食纖維，可在馬克斯克魯維酵母的發(fā)酵作用下作為誘導(dǎo)纖維素酶的良好載體，所生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶具備良好的活性和穩(wěn)定性[6]。除了所提及的食用真菌、酵母以及細(xì)菌外，豆渣也非常適合作為毛霉的發(fā)酵基質(zhì)[7]。豆渣表面粗糙且黏附力較強(qiáng)，可以很好地附著毛霉菌絲，同時菌絲透過底物內(nèi)部基質(zhì)，可以提高利用效率。雅致放射毛霉是一種可以產(chǎn)生多種酶系的毛霉，是我國傳統(tǒng)發(fā)酵食品用微生物菌種之一，具有較好的食用安全性，常被用來發(fā)酵油豆腐、腐乳和豆豉等[8]；運(yùn)動發(fā)酵單胞菌是可以應(yīng)用于食品領(lǐng)域的公認(rèn)為安全的菌株，在改善發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味方面具有重要的作用[9]。前期試驗發(fā)現(xiàn)，雅致放射毛霉和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌混菌發(fā)酵可以有效提升生漿豆渣的營養(yǎng)品質(zhì)和感官評分。

目前很少有研究指出所使用的豆渣來源于何種工藝，且有關(guān)于豆渣的發(fā)酵研究多集中在其發(fā)酵前后的性質(zhì)對比或是一些功能性成分的提取。因此，本研究以雅致放射毛霉和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌為發(fā)酵菌種，旨在探索生漿豆渣混菌發(fā)酵過程中的營養(yǎng)品質(zhì)和功能特性變化規(guī)律，并利用蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶酶活力的變化進(jìn)行分析，為生漿豆渣的微生物改性、工藝優(yōu)化以及產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗原料與發(fā)酵菌種

新鮮生漿豆渣，建始縣容華食品有限公司，使用前于-20 ℃保存。

雅致放射毛霉(ActinomucorelegansCICC3118)、運(yùn)動發(fā)酵單胞菌(ZymomonasmobilisIFFI10232)，上海保藏生物技術(shù)中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

綜合馬鈴薯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基，海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要試劑

30～60 ℃沸程石油醚、丙酮、甲醛水溶液、無水葡萄糖、可溶性淀粉、羧甲基纖維素鈉等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白、阿拉伯樹膠粉等，上海源葉生物科技有限公司；福林酚等，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KJELTEC 8400/8420全自動定氮儀，丹麥FOSS公司；JH-11-06可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；Beta2-8LD真空冷凍干燥機(jī)，日本尼康公司；GR60DA高壓滅菌鍋，武漢遞熱愛生物科技有限公司；SPX-150B Ⅲ生化培養(yǎng)箱、101-0AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津泰斯特儀器有限公司；SX2-2.5-10A馬弗爐，紹興市上虞道墟科析儀器廠；Allegra X-30R Centrifuge離心機(jī)，美國BECKMAN公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 霉菌孢子懸液與細(xì)菌菌懸液制備

挑取雅致放射毛霉菌絲接種于綜合馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)3 d進(jìn)行活化，活化完成后繼續(xù)挑取少量菌絲接種到裝有綜合馬鈴薯培養(yǎng)基的三角瓶內(nèi)，于28 ℃下培養(yǎng)5 d充分產(chǎn)孢。隨后向三角瓶內(nèi)分?jǐn)?shù)次加入100 mL帶少量玻璃珠的無菌生理鹽水，充分振搖至生理鹽水渾濁，將其經(jīng)4層無菌紗布過濾，收集濾液并用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，制得孢子數(shù)量約為105CFU/mL的霉菌孢子懸液。

挑取運(yùn)動發(fā)酵單胞菌接種于綜合馬鈴薯培養(yǎng)基平板上，于28 ℃培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化，活化完成后挑取平板中的單菌落于裝有馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基的三角瓶中，放入搖床中于28 ℃、約100 r/min的條件下培養(yǎng)8～12 h至培養(yǎng)基剛好渾濁，隨后用無菌生理鹽水適當(dāng)稀釋，制得菌體數(shù)量約107CFU/mL的菌懸液。

1.3.2 發(fā)酵豆渣制備

根據(jù)前期優(yōu)化的發(fā)酵條件，稱取適量豆渣裝入發(fā)酵罐中用錫紙包裹好，于121 ℃下滅菌15 min，充分冷卻。在自然pH值(pH=5.9)條件下接入3.6%的霉菌孢子懸液以及0.3%的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌懸液(即100 g的新鮮豆渣中需要接入3.6 mL的雅致放射毛霉孢子懸液以及0.3 mL的運(yùn)動發(fā)酵單胞菌菌懸液)，混合均勻后將豆渣用專用模具定型，放入無菌一次性培養(yǎng)皿中，用保鮮膜包好，在保鮮膜上每隔1 cm扎上小孔透氣，分別于28.6 ℃的條件下發(fā)酵3 d，每隔12 h取1次樣，作為濕樣，將濕樣凍干、粉碎，過80目篩后作為干樣備用。

1.3.3 蛋白質(zhì)降解情況及蛋白酶活力測定

蛋白提取液：稱取1 g(精確到0.000 1 g)的豆渣凍干粉，加入25 mL的硼酸-氫氧化鈉緩沖溶液(pH=9.0)溶解，在室溫下以200 W功率超聲輔助提取1 h，然后在4 ℃下(8 000×g、15 min)離心，吸取上清液。

待測蛋白酶液：稱取豆渣凍干粉1 g(精確至0.000 1 g)，加入pH 7.5、0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液25 mL，于室溫條件下間歇振蕩提取1 h，然后4 ℃離心(8 000×g、15 min)，取上清液。

粗蛋白：參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法；氨基酸態(tài)氮：參考GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的滴定法；蛋白酶活力：參考GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林法，以酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(0～50 μg/mL)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白酶活力(y=0.010 1x-0.004 7，R2=0.999 9)。

可溶性蛋白：采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白提取液中的可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度(20～100 μg/mL)為橫坐標(biāo)，在595 nm處測定其吸光值，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出可溶性蛋白含量(y=0.005 5x+0.100 2，R2=0.990 1)。吸取1 mL適當(dāng)稀釋的蛋白提取液加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染色液，混勻之后避光反應(yīng)5 min，通過回歸方程進(jìn)行計算，結(jié)果以牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)當(dāng)量表示(mg BSA/g，以豆渣凍干粉計)。

蛋白質(zhì)分子質(zhì)量：采用SDS-PAGE法測定，并配制12%的分離膠與5%的濃縮膠。

1.3.4 粗脂肪含量變化及脂肪酶活力測定

粗脂肪：參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法。

待測脂肪酶液：稱取豆渣凍干粉1 g(精確到0.000 1 g)，加入20 mL蒸餾水，充分混勻，40 ℃條件下提取1 h，期間每隔10 min振搖1次，隨后4 ℃離心(8 000×g、15 min)，取上清液。

底物溶液：A液：用異丙醇配制50 mL 30 mg/mL的棕櫚酸對硝基苯酯。B液：取2 g Tritox-100、0.5 g阿拉伯樹膠溶于450 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0，50 mmol/L)。在超聲條件下，向B液中緩慢滴入A液，混合均勻，靜置3 h。

脂肪酶活力：采用對硝基苯酚法測定脂肪酶活力。用異丙醇配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液，以對硝基苯酚的含量(0.2～1.0 mg/mL)為橫坐標(biāo)，在405 nm處測定吸光值，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.548 0x+0.120 1，R2=0.998 3)。

將5 mL底物溶液加入刻度試管中，同時加入適當(dāng)稀釋的待測脂肪酶液1 mL，混勻，40 ℃水浴反應(yīng)30 min，隨后立即用流水冷卻，按照上述方法進(jìn)行測定，并根據(jù)回歸方程進(jìn)行計算。酶活力定義為在溫度40 ℃條件下每1 min水解底物溶液生成1 μmol對硝基苯酚為1個酶活力單位(U)。

1.3.5 膳食纖維、可溶性總糖含量變化及纖維素酶活力測定

膳食纖維：參考GB 5009.88—2014 《食品中膳食纖維的測定》中的酶重量法，測定發(fā)酵豆渣中的不溶性膳食纖維(insoluble dietary fiber，IDF)以及可溶性膳食纖維(soluble dietary fiber，SDF)含量，總膳食纖維(total dietary fiber，TDF)含量為兩者之和。

提取液制備：稱取豆渣凍干粉1 g(精確到0.000 1 g)于100 mL錐形瓶中，加入20 mL煮沸的蒸餾水并于沸水浴下浸提30 min，浸提過程中適時搖動，浸提結(jié)束之后進(jìn)行過濾，得到濾液。

待測纖維素酶液制備：稱取豆渣凍干粉1 g(精確到0.000 1 g)，加入pH 4.6、0.2 mol/L的醋酸緩沖液20.0 mL，充分混勻，4 ℃條件下振搖提取1 h，隨后4 ℃離心(8 000×g、15 min)，取上清液。

可溶性總糖含量：配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，在比色管中分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用去離子水補(bǔ)足到1.0 mL，然后向每管中加入1.0 mL 5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))苯酚和5.0 mL濃硫酸，混勻，然后置于水浴條件下中，沸水反應(yīng)20 min，流水冷卻，在490 nm處測定吸光度值。以1.0 mL的蒸餾水為對照，以葡萄糖含量(0.02～0.1 mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=7.891 7x+0.008 9，R2=0.999 3)。取1 mL適當(dāng)稀釋后的待測液按照上述方法進(jìn)行測定，根據(jù)回歸方程進(jìn)行計算。最終計算結(jié)果用葡萄糖當(dāng)量表示(mg 葡萄糖/g，以豆渣凍干粉計)。

纖維素酶活力：以pH 4.6醋酸緩沖液作為空白對照，配制1 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用醋酸緩沖液補(bǔ)足到1 mL，然后向每管中加入0.75 mL的DNS試劑，混勻，置于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，隨后立即取出，用冷水冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，在540 nm處測定吸光值。以葡萄糖含量(0.2～1.0 mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.003 8x-0.016 3，R2=0.999 9)。

將0.5 mL 5 g/L的羧甲基纖維素鈉溶液(用pH 4.6 的0.2 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)加入刻度試管中，50 ℃水浴預(yù)熱10 min，加入適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，50 ℃水浴30 min，按照上述方法進(jìn)行測定，并根據(jù)回歸方程進(jìn)行計算。酶活力定義為在pH 4.6、溫度50 ℃條件下每1 min水解5 g/L羧甲基纖維素鈉生成1 μmol葡萄糖為1個酶活力單位(U)。

1.3.6 還原糖含量及淀粉酶活力測定

提取液制備：同1.2.5中的提取液制備。

待測淀粉酶液：稱取豆渣凍干粉1 g(精確到0.000 1 g)，加入pH 5.6、0.1 mol/L的檸檬酸緩沖液20 mL，充分混勻，4 ℃條件下提取4 h，隨后4 ℃離心(8 000×g、15 min)，取上清液。

還原糖含量：配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，用去離子水補(bǔ)足到1.0 mL，然后向每管中加入0.75 mL的DNS試劑，混勻，然后置于水浴條件下中，沸水反應(yīng)10 min，流水冷卻，定容到10 mL，于540 nm下測定吸光度值。以1 mL的蒸餾水為對照，以葡萄糖含量(0.05～0.25 mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=2.912x+0.004 4，R2=0.999 7)。取1 mL稀釋后的待測液按照上述方法進(jìn)行測定，根據(jù)回歸方程進(jìn)行計算。最終計算結(jié)果用葡萄糖當(dāng)量表示(mg 葡萄糖/g，以豆渣凍干粉計)。

淀粉酶活力：以pH 5.6檸檬酸緩沖液作為空白對照，配制1 g/L的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加入0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液，用檸檬酸緩沖液補(bǔ)足到1.0 mL，然后向每管中加入1 mL的DNS試劑，混勻，置于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)10 min，隨后立即取出，用冷水冷卻，用蒸餾水定容至10 mL，在520 nm處測定吸光值。以麥芽糖含量(0.1～1 mg/mL)為橫坐標(biāo)，以對應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=1.118 5x-0.020 2，R2=0.993 1)。

將0.5 mL 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的可溶性淀粉溶液(用pH 5.6的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液配制)加入刻度試管中，同時加入適當(dāng)稀釋的粗酶液0.5 mL，再加入1.5 mL的蒸餾水，60 ℃水浴預(yù)熱10 min，取出，每支試管中加入0.5 mL的pH 5.6檸檬酸緩沖液，60 ℃水浴反應(yīng)30 min，按照上述方法進(jìn)行測定，并根據(jù)回歸方程進(jìn)行計算。

酶活力定義為在pH 5.6，溫度60 ℃條件下每1 min水解2%可溶性淀粉生成1 mg麥芽糖為1個酶活力單位(U)。

1.3.7 粒度測定

參考張瑜[10]的方法，并做一定的修改，取0.5 g(精確到0.000 1 g)豆渣干粉溶于30 mL的超純水中，充分混勻并以200 W功率超聲30 min，隨后進(jìn)行離心，取上清液稀釋1倍。采用粒度分析儀對樣品顆粒的粒度進(jìn)行分析。

1.3.8 持水性、持油性、水溶性和膨脹性測定

按照LI等[11]的方法進(jìn)行測定，并作適當(dāng)改進(jìn)。相關(guān)計算如公式(1)～公式(4)所示：

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：md，豆渣干粉質(zhì)量，g；mw，豆渣干粉濕重，g；mp，豆渣干粉與大豆油混合反應(yīng)后的濕重，g；m1，殘留物質(zhì)量，g；Vt，水合后豆渣干粉體積，mL；V0，水合前豆渣干粉體積，mL。

1.4 統(tǒng)計分析

所有實驗均重復(fù)3次，實驗結(jié)果以“平均值±相對標(biāo)準(zhǔn)偏差”來表示。用Excel 2019和SPSS 26.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Origin 2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)降解情況及蛋白酶活力變化

由圖1-a可知，豆渣發(fā)酵從開始到結(jié)束，粗蛋白含量從18.22%下降到13.43%，這與李東華等[12]利用少孢根霉發(fā)酵豆渣的研究結(jié)果不同(粗蛋白含量從30.57%上升至33.68%)，這是由于凱氏定氮法測定豆渣粗蛋白含量的原理是總氮量乘以轉(zhuǎn)換系數(shù) 6.25，而有研究表明豆渣發(fā)酵過程中很可能會產(chǎn)生吡嗪、氨氣等揮發(fā)性物質(zhì)，造成基質(zhì)中總氮量的減少，間接導(dǎo)致粗蛋白含量降低[13]。因此，粗蛋白含量并不能完全反應(yīng)豆渣發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)水平的變化情況，仍需要借助其他指標(biāo)綜合評判。

由圖1-a可知，發(fā)酵0 h的豆渣可溶性蛋白含量為4.47 mg BSA/g。發(fā)酵12 h后，可溶性蛋白含量沒有顯著性的提升(P>0.05)。發(fā)酵24 h后，可溶性蛋白含量顯著增加(P<0.05)，達(dá)到7.65 mg BSA/g。發(fā)酵24～60 h，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵60 h時達(dá)到最大值，可溶性蛋白含量為11.01 mg BSA/g，約為發(fā)酵0 h豆渣的2.5倍。這是因為在豆渣發(fā)酵過程中，蛋白質(zhì)被分解成了多肽以及分子質(zhì)量相對較小的蛋白質(zhì)，從而使其溶解度得到提升。發(fā)酵60～72 h，可溶性蛋白含量出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)，管瑛[14]利用雅致放射毛霉DCY-1單菌發(fā)酵豆渣，同樣發(fā)現(xiàn)豆渣中的可溶性蛋白含量在發(fā)酵后期出現(xiàn)了下降，這可能是由于在豆渣發(fā)酵后期，較多的蛋白質(zhì)被降解成了小分子的肽和氨基酸，而考馬斯亮藍(lán)法只能檢測大分子的可溶性蛋白。氨基酸態(tài)氮含量是衡量蛋白質(zhì)降解程度的重要指標(biāo)，代表發(fā)酵豆制品的游離氨基酸總量。根據(jù)豆渣氨基酸態(tài)氮含量的變化情況可以看出，在豆渣的發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)降解程度不斷上升，這與可溶性蛋白的變化情況相似，且在發(fā)酵60～72 h時氨基酸態(tài)氮含量仍然有顯著性的上升(P<0.05)，說明此時蛋白質(zhì)還在繼續(xù)水解。

可溶性蛋白和氨基酸態(tài)氮含量的上升原因可能是微生物產(chǎn)生了蛋白酶，由圖1-a可知，發(fā)酵前36 h，蛋白酶活力水平相對較低，只有137.55 U/g；當(dāng)發(fā)酵48 h時，蛋白酶活力出現(xiàn)大幅度升高，達(dá)到了747.58 U/g；發(fā)酵60 h后，蛋白酶活力繼續(xù)升高，達(dá)到963.02 U/g；發(fā)酵72 h時，蛋白酶活力雖然出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)，但升高幅度不大，處于一個比較穩(wěn)定的狀態(tài)，豆渣中的氨基酸態(tài)氮和可溶性蛋白含量與蛋白酶活力的變化趨勢基本一致。TAN等[15]也在利用6種霉菌(米曲霉2339、米曲霉41380、米曲霉40188、總狀毛霉、五通橋毛霉和雅致放射毛霉)分別發(fā)酵豆豉的研究中發(fā)現(xiàn)，6組豆豉中的游離氨基氮含量均在預(yù)發(fā)酵時期增長迅速，隨后趨于平緩，原因可能是發(fā)酵后期酸性物質(zhì)的積累會降低蛋白酶活力。

大豆蛋白的組成主要為7S球蛋白(α，α’，β亞基)和11S球蛋白(AS和BS亞基)，7S球蛋白一般位于45～91 kDa，11S球蛋白一般位于14.4～42 kDa[16]。根據(jù)Marker對比可以看出，在pH 9.0時提取的生漿豆渣蛋白亞基組成與大豆中的蛋白亞基組成基本一致。

由圖1-b可知，發(fā)酵0～12 h，7S球蛋白迅速水解，發(fā)酵24 h時幾乎全部消失，這與GUAN等[17]的研究一致，同時11S球蛋白也出現(xiàn)小幅度水解，到發(fā)酵48 h時，25 kDa分子質(zhì)量以上的蛋白質(zhì)幾乎被全部降解。而0～72 h發(fā)酵過程中，15～25 kDa分子質(zhì)量的11S球蛋白含量先減少后增加，在60 h時出現(xiàn)較大程度的累積。結(jié)合可溶性蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量以及蛋白酶活力的實驗結(jié)果可以推測，在0～72 h發(fā)酵過程中，混菌發(fā)酵可以通過蛋白酶水解豆渣中的蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生分子質(zhì)量相對較小的蛋白質(zhì)和氨基酸，有利于蛋白質(zhì)的有效利用。

M-Marker a-粗蛋白含量、可溶性蛋白含量、氨基酸態(tài)氮含量以及蛋白酶活力 變化情況；b-不同發(fā)酵時間的SDS-PAGE電泳圖譜圖1 發(fā)酵過程中蛋白質(zhì)降解程度和蛋白酶活力的變化Fig.1 Changes in degree of protein degradation and protease activity during fermentation 注：不同字母表示處理組間差異性顯著(P<0.05)(下同)

2.2 粗脂肪含量及脂肪酶活力變化

由圖2中可知豆渣發(fā)酵過程中粗脂肪含量逐漸下降。發(fā)酵0 h豆渣中的粗脂肪含量為12.00%，發(fā)酵0～12 h沒有顯著性變化(P>0.05)，發(fā)酵12～48 h出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)，因為此時處于發(fā)酵前期，微生物會同化豆渣中的脂質(zhì)用于生產(chǎn)生物量和自身的細(xì)胞活動[18]，當(dāng)發(fā)酵時間48～72 h，此時脂肪酶活力出現(xiàn)顯著性提升(P<0.05)，但豆渣中的粗脂肪含量卻處于一個比較穩(wěn)定的狀態(tài)，變化較小。因為微生物雖然會產(chǎn)生脂肪酶，將脂肪水解成甘油和脂肪酸[19]，但其產(chǎn)物脂肪酸是脂溶性的，會作為粗脂肪的一部分被提取出來[20]，所以酶解后粗脂肪減少的是甘油，其在脂肪中占比較少，因而粗脂肪含量變化不明顯。

圖2 發(fā)酵過程中粗脂肪含量和脂肪酶活力的變化Fig.2 Changes in crude fat content and lipase activity during fermentation 注：不同小寫字母、大寫字母表示存在顯著性差異(P<0.05)

2.3 膳食纖維、可溶性總糖含量及纖維素酶活力變化

由圖3-a可知，發(fā)酵0 h豆渣中的TDF占豆渣干重63.90%，IDF含量為59.01%，SDF含量僅有4.89%，SDF/TDF值為7.65%。但經(jīng)過微生物的發(fā)酵，TDF下降到60.46%，IDF下降到53.25%，SDF上升到7.21%，SDF/TDF值上升到11.93%，符合優(yōu)質(zhì)膳食纖維中SDF/TDF值至少為10%的要求[21]。同時，IDF含量的降低也使得包埋作用減小，提高了小分子營養(yǎng)物質(zhì)的生物可獲得性。因此經(jīng)過微生物發(fā)酵，豆渣中的膳食纖維品質(zhì)得到提升，具備更好的營養(yǎng)價值與功能活性。豆渣中的SDF包括多糖和單糖等物質(zhì)，IDF則包括纖維素和半纖維素等物質(zhì)。HU等[3]利用馬克斯克魯維酵母發(fā)酵豆渣，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬克斯克魯維酵母分泌的纖維素酶(可能是β-葡萄糖苷酶)可以使IDF向SDF發(fā)生轉(zhuǎn)化。因此，本研究中IDF與SDF含量的變化也很有可能和纖維素酶有關(guān)。

由圖3-b可知，0～72 h時可溶性總糖含量呈現(xiàn)先降后升的趨勢。發(fā)酵0 h豆渣中可溶性總糖含量為48.85 mg 葡萄糖/g；發(fā)酵0～36 h，可溶性總糖含量呈現(xiàn)下降趨勢，此時可溶性總糖含量僅為22.62 mg葡萄糖/g。在發(fā)酵36 h之后的各個階段，可溶性總糖含量均出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)。發(fā)酵72 h時，豆渣的可溶性總糖含量達(dá)到了80.26 mg 葡萄糖/g。

通過纖維素酶活力的變化趨勢可以看出，在豆渣發(fā)酵過程中，微生物可以提供纖維素酶，在發(fā)酵48 h之前酶活力穩(wěn)步上升，在發(fā)酵48～60 h時出現(xiàn)大幅度升高，發(fā)酵60 h時的酶活力達(dá)到12.30 U/g，發(fā)酵72 h時酶活力變化幅度較小，為12.41 U/g。因此，發(fā)酵前36 h可溶性總糖含量下降，可能是微生物的生長繁殖需要利用到單糖類物質(zhì)，而發(fā)酵前期纖維素酶活性較低，分解產(chǎn)生的糖量不足以平衡消耗量。在發(fā)酵36 h之后，纖維素酶會把更多的纖維素降解為溶解性更好的單糖類物質(zhì)，可溶性總糖含量的增加，可以有效提升發(fā)酵豆渣的風(fēng)味和細(xì)膩程度[22]。

a-膳食纖維含量變化情況；b-可溶性總糖含量及纖維素酶 活力變化情況圖3 發(fā)酵過程中膳食纖維含量、可溶性總糖含量和 纖維素酶活力的變化Fig.3 Changes in dietary fiber content, total soluble sugar content, and cellulase activity during fermentation

2.4 還原糖含量及淀粉酶活力變化

由圖4可知，發(fā)酵0 h的豆渣還原糖含量為4.81 mg 葡萄糖/g，發(fā)酵0～12 h還原糖含量出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)。發(fā)酵12～36 h，還原糖含量并無顯著性變化(P>0.05)，處于一個比較穩(wěn)定的狀態(tài)。發(fā)酵36～72 h各個階段均出現(xiàn)顯著性的上升(P<0.05)。發(fā)酵72 h后，豆渣中的還原糖含量達(dá)到了7.56 mg葡萄糖/g。總體而言，還原糖含量的變化趨勢與可溶性總糖含量相似。

根據(jù)淀粉酶活力的變化趨勢可以發(fā)現(xiàn)，豆渣在0～72 h發(fā)酵過程中，微生物可以提供活力較強(qiáng)的淀粉酶，發(fā)酵60 h前各階段均有顯著性的提升(P<0.05)，發(fā)酵60 h淀粉酶活力達(dá)到了3.79 U/g。由此可判斷，在發(fā)酵0～36 h時，還原糖含量下降的原因可能是微生物生長代謝所致，此時微生物生長繁殖所需的還原糖量大于淀粉水解產(chǎn)生的還原糖量。發(fā)酵36 h之后，淀粉酶活力變強(qiáng)，可以水解更多的淀粉產(chǎn)生還原糖，從而使得豆渣中的還原糖含量積累，在發(fā)酵中后期的含量逐漸上升。

圖4 發(fā)酵過程中還原糖含量和淀粉酶活力的變化Fig.4 Changes in reducing sugar content and amylase activity during fermentation

2.5 粒度、持水性、持油性、水溶性和膨脹性變化

由表1可知，豆渣發(fā)酵過程中粒度逐漸降低，從發(fā)酵0 h的857.05 nm到發(fā)酵72 h時的200.83 nm，幾乎每一個發(fā)酵階段均出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)。原因是微生物的酶作用會使大顆粒轉(zhuǎn)變?yōu)樾☆w粒，降低基質(zhì)粒度[10]。較小的粒度有利于物料內(nèi)部氧氣和二氧化碳的熱傳遞和熱交換，促進(jìn)微生物生長的同時也會提高物料的通氣效率；WANG等[23]利用超離心研磨+蒸汽加熱+纖維素酶聯(lián)合處理豆渣，結(jié)果發(fā)現(xiàn)豆渣粒度減小的同時，纖維素酶的有效作用面積和作用效果也得到提升。因此，豆渣粒度的減小可能對豆渣中酶的作用效率有促進(jìn)作用。從感官上來看，豆渣粒度的減小也有利于降低豆渣渣感，使豆渣由粗糙變得細(xì)膩，口感和消化率得到提升[24]。

持水性、水溶性和膨脹性是衡量豆渣膳食纖維水合性質(zhì)的重要指標(biāo)，可以反應(yīng)基質(zhì)保留水分的能力，它們與多糖中的親水基團(tuán)有關(guān)，較好的水合性質(zhì)可以使食品原料在加工過程中保持較好的黏度和質(zhì)地；持油性則通常用來評估吸附脂肪的能力，較強(qiáng)的持油性可以有效防止烹飪過程中的脂肪流失；豆渣水合性能和持油性能與發(fā)酵過程中SDF含量、膳食纖維結(jié)構(gòu)等有關(guān)[25]。

表1 發(fā)酵過程中粒度、持水性、持油性、水溶性 和膨脹性的變化Table 1 Changes in particle size, water holding capacity, oil holding capacity, water solubility, and swelling property during fermentation

由表1可知，經(jīng)由微生物發(fā)酵后，4項指標(biāo)均得到不同程度的提升。持水性先上升后穩(wěn)定，在發(fā)酵24 h時出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)，發(fā)酵36～72 h無顯著性變化(P>0.05)，最終的持水性為10.20 g/g。持油性的變化趨勢與持水性相似，在發(fā)酵24～48 h開始出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)，發(fā)酵48 h達(dá)到最高值6.04 g/g，但在發(fā)酵72 h時出現(xiàn)顯著性下降(P<0.05)；持水性和持油性上升是因為纖維素酶的水解會破壞纖維素和半纖維素的分子間氫鍵并增加顆粒的比表面積，暴露出更多的親水基團(tuán)，分散性的增加有利于提升物料與水、油之間的接觸程度，持油性在發(fā)酵72 h時下降的原因可能與粒度大小有關(guān)，粒度減小會降低陽離子的交換能力，進(jìn)而引起持油性的降低，但具體原因還需要進(jìn)一步研究[26]；水溶性在發(fā)酵過程中一直上升，在發(fā)酵前36 h有小幅度上升，發(fā)酵48～72 h后開始出現(xiàn)大幅度的顯著性上升(P<0.05)，發(fā)酵72 h達(dá)到最高值21.36%，這意味著豆渣中的可溶性物質(zhì)含量會隨著發(fā)酵時間的延長而增加；膨脹性的變化趨勢與持水性相似，為先上升后穩(wěn)定，在發(fā)酵前48 h的各個階段均出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)，在此后的發(fā)酵時間里維持穩(wěn)定，發(fā)酵終末的豆渣膨脹性達(dá)到了8.82 mL/g，豆渣膨脹性的增加主要是因為溶解在水中的膳食纖維顆粒會增強(qiáng)拉伸和膨脹效果，從而使水合后的豆渣體積擴(kuò)張，膨脹性能變強(qiáng)，膳食纖維自身特殊的蜂窩狀結(jié)構(gòu)也有助于吸水膨脹[27]。

3 結(jié)論

在雅致放射毛霉和運(yùn)動發(fā)酵單胞菌0～72 h混菌發(fā)酵過程中，生漿豆渣的品質(zhì)會發(fā)生一定規(guī)律性的變化。營養(yǎng)品質(zhì)方面，豆渣的粗蛋白含量逐漸下降，蛋白分子質(zhì)量逐漸降低?？扇苄缘鞍缀恐饾u上升，在發(fā)酵60 h達(dá)到峰值11.01 mg BSA/g，發(fā)酵60～72 h略有下降。氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，在發(fā)酵72 h達(dá)到0.31 g/100g。粗脂肪含量在發(fā)酵0～48 h逐漸下降，然后維持在7%左右。發(fā)酵過程中，部分不溶性膳食纖維向可溶性膳食纖維轉(zhuǎn)化，48 h后二者含量趨于穩(wěn)定，分別為54.74%和7.07%?？扇苄钥偺呛瓦€原糖含量的變化趨勢均為先降后升，開始上升的時間點也均在48 h，發(fā)酵72 h時的含量分別為80.26、7.55 mg葡萄糖/g。功能特性方面，粒度逐漸變小，發(fā)酵72 h時下降到200.83 nm；持水性在發(fā)酵0～48 h逐漸上升，隨后穩(wěn)定在10.36 g/g。持油性也在48 h達(dá)到峰值6.04 g/g，但在發(fā)酵60～72 h時出現(xiàn)下降。水溶性和膨脹性均逐漸上升，在發(fā)酵72 h時分別達(dá)到了21.36%和8.82 mL/g。微生物在發(fā)酵過程中可以提供活性逐漸變強(qiáng)的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶和淀粉酶，提升了豆渣的營養(yǎng)價值，并改善了豆渣的加工特性。該研究結(jié)果為生漿豆渣的微生物改性、工藝優(yōu)化以及產(chǎn)品開發(fā)提供理論與技術(shù)支持。