原料乳冷藏時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪理化指標(biāo)的影響

邱婷，張忠明，張衛(wèi)兵*，宋雪梅*，王瑩，文鵬程

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州，730070)

原料乳質(zhì)量是乳制品加工業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵影響因素。目前，各牧場和乳制品加工企業(yè)廣泛使用低溫來貯藏原料乳。低溫是控制原料乳貯藏過程中細(xì)菌生長繁殖的有效措施。然而，冷藏雖能抑制大多數(shù)嗜溫微生物，但隨著貯藏時(shí)間的延長，嗜冷菌仍可持續(xù)生長，其產(chǎn)生的蛋白酶和脂肪酶分解蛋白質(zhì)和脂肪，會(huì)使原料乳質(zhì)量發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致加工特性發(fā)生改變[1-2]。

不同學(xué)者關(guān)于原料乳冷藏時(shí)間對(duì)原料乳和干酪理化特性的影響已有研究。ALI等[3]研究了原料乳貯存對(duì)酪蛋白在膠束和可溶性相之間分布的影響，得出原料乳貯藏時(shí)間越長，酪蛋白膠束越不穩(wěn)定；BAGLINIéRE等[4]從低溫貯存的原料乳中分離出高蛋白水解菌株，可以使其酪蛋白不穩(wěn)定從而出現(xiàn)蛋白質(zhì)凝膠、乳清析出的現(xiàn)象。MANKAI等[5]對(duì)4 ℃條件下貯藏12～96 h原料乳及所制作的干酪品質(zhì)變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)冷藏96 h制成的干酪脂肪含量最低，蛋白水解水平最高。YUAN等[6]研究發(fā)現(xiàn)低溫貯藏下的原料乳，相應(yīng)的乳制品會(huì)出現(xiàn)苦味等非正常風(fēng)味；綜上，原料乳冷藏時(shí)間對(duì)原料乳和干酪理化特性產(chǎn)生影響。牦牛乳硬質(zhì)干酪以牦牛乳為原料，經(jīng)發(fā)酵、凝乳等環(huán)節(jié)制作而成，出品率高、營養(yǎng)價(jià)值高以及風(fēng)味濃郁[7]，然而，鮮有不同冷藏時(shí)間牦牛乳制作的硬質(zhì)干酪的理化性質(zhì)研究。

牦牛乳營養(yǎng)全面，蛋白質(zhì)含量、脂肪含量平均高出荷斯坦牛乳1倍以上，以天然的濃縮奶相稱[8]，然而，牦牛大多分布在青藏高原地區(qū)，奶源分布零散，產(chǎn)奶量低、收集時(shí)間較長，因此，牦牛乳在加工前一般需要較長時(shí)間的低溫貯藏。因此，本實(shí)驗(yàn)以冷藏不同時(shí)間的牦牛乳為原料，制作成牦牛乳硬質(zhì)干酪，通過測定干酪成熟期間的理化性質(zhì)、蛋白水解程度來揭示不同冷藏時(shí)間的牦牛乳制作成的硬質(zhì)干酪之間的差異性，進(jìn)而判斷對(duì)其牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟過程中理化性質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛乳采自甘南藏族自治州卓尼縣木耳鄉(xiāng)大峪溝，置于冰盒中迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室；凝乳酶、發(fā)酵劑(嗜溫發(fā)酵劑和嗜熱發(fā)酵劑1∶1混合而成)，北京多愛特生物科技有限公司。

氯化鈣、氯化鈉、醋酸、三氯乙酸、水合茚三酮、鹽酸、氯化鎘、L-亮氨酸、氫氧化鈉、硝酸銀、濃硫酸等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

干酪槽，自制；TGL-20 M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-3 C精密pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；723型可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；HWS 26-電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；真空包裝機(jī)，溫州市大江真空包裝機(jī)械有限公司；K 9840自動(dòng)凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牦牛乳前處理

將新鮮牦牛乳分成3份置于無菌瓶中，于4 ℃冰箱中分別冷藏24、48、72 h，然后用于牦牛乳硬質(zhì)干酪制作。

1.3.2 干酪制作與取樣

參考劉興龍等[9]方法，制作牦牛乳硬質(zhì)干酪。將檢驗(yàn)合格的原料乳進(jìn)行巴氏殺菌(63 ℃， 30 min)后冷卻至35 ℃，添加已活化的發(fā)酵劑(0.006 25 g/L)，攪拌均勻，35 ℃發(fā)酵約60 min后測其pH值，待pH值降至6.2時(shí)一邊緩慢加入CaCL2(0.3 g/L)一邊慢速攪拌，防止起泡。10 min后加入凝乳酶(1 g/1.5L)，待2 h后測定pH值使其降至5.6。當(dāng)乳凝固后將其切割成約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm的小方塊，排乳清，45 ℃下加入2%食鹽并不斷攪拌，堆釀約2 h后加壓成型，真空包裝后置于4 ℃條件下分別成熟0、1、2、3、4、5、6個(gè)月，將成熟后的干酪貯藏在-80 ℃，用于后續(xù)試驗(yàn)指標(biāo)測定。

1.3.3 干酪理化指標(biāo)的測定

1.3.3.1 水分含量測定

采用GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》中第一法直接干燥法進(jìn)行各成熟期干酪水分含量的測定。

1.3.3.2 pH值測定

參考宋雪梅等[10]方法，稍作修改。稱取5 g干酪于10 mL去離子水中研磨勻漿后，用精密pH計(jì)進(jìn)行測定。

1.3.3.3 NaCl含量測定

參照GB 5009.44—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氯化物的測定》第三法銀量法(摩爾法或直接滴定法)，根據(jù)硝酸銀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的消耗量來計(jì)算各成熟期干酪中氯的含量。

1.3.3.4 脂肪含量測定

根據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》第三法堿水解法進(jìn)行各成熟期干酪脂肪含量的測定。

1.3.4 干酪蛋白水解程度的測定

1.3.4.1 pH 4.6可溶性氮(pH 4.6 soluble nitrogen, pH 4.6-SN)含量測定

參考穆碩等[11]方法。準(zhǔn)確稱取0.75 g干酪于研缽中，加入25 mL pH 4.6醋酸鹽緩沖液中充分研磨后裝于50 mL離心管中，再用25 mL醋酸鹽緩沖液沖洗。將懸浮液在4 ℃、4 000 r/min條件下離心20 min。取上清液20 mL于消化管中進(jìn)行消化處理，待消化管中的液體為綠色透明狀后進(jìn)行凱氏定氮測定，并以SN/TN來表示。

1.3.4.2 12%三氯乙酸可溶性氮(12% trichloroacetic acid-soluble nitrogen, 12% TCA-SN)含量測定

參考AGBOOLA等[12]方法，并加以改進(jìn)后測定。準(zhǔn)確稱取1.50 g干酪于研缽中，加入25 mL 12% TCA溶液中進(jìn)行研磨，磨碎后移入50 mL離心管中，再用25 mL溶液沖洗。所得的懸浮液以4 ℃ 4 000 r/min離心20 min。取離心后的上清液20 mL進(jìn)行消化處理，待消化管中的液體呈綠色透明狀后進(jìn)行凱氏定氮，并以SN/TN來表示。

1.3.4.3 總游離氨基酸含量測定

參考FOLKERTSMA等[13]方法，以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，采用鎘-茚三酮法進(jìn)行總游離氨基酸測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

各項(xiàng)試驗(yàn)指標(biāo)的結(jié)果均3次重復(fù)。采用Excel 2010軟件對(duì)其數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)結(jié)果均以平均值標(biāo)準(zhǔn)差來表示，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差和顯著性分析(Duncan法)，利用Origin 2019軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間理化指標(biāo)的變化

2.1.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間水分含量的變化

水分含量通過影響溶質(zhì)濃度，進(jìn)而影響到水分活度，從而對(duì)微生物繁殖代謝和生長產(chǎn)生影響。不同冷藏時(shí)間原料乳制作的牦牛乳硬質(zhì)干酪在0～6個(gè)月成熟過程中水分含量變化見圖1。

圖1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間水分含量的變化Fig.1 Changes of moisture content in yak hard cheese during ripening 注：樣品間用大寫字母表示差異顯著，不同成熟時(shí)間用小寫字母 表示差異顯著(P<0.05)(下同)

由圖1可知，在成熟過程中，3組硬質(zhì)干酪的水分含量隨著成熟時(shí)間的延長都呈緩慢下降的趨勢。在整個(gè)成熟期內(nèi)，冷藏24、48、72 h原料乳制成的硬質(zhì)干酪中水分含量分別下降了1.7%、1.5%、2.4%，冷藏72 h制成的硬質(zhì)干酪中水分含量下降程度最大。成熟初期，水分降低是因?yàn)槿榍逦磸氐着懦?，真空包裝后部分水分隨乳清析出，殘留在包裝袋。成熟后期，由于蛋白質(zhì)分解，酪蛋白網(wǎng)絡(luò)減弱并逐漸解體，干酪中游離的水分在貯存過程中以滲出物的形式釋放出來[14]。整個(gè)成熟過程中，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪中水分含量始終為冷藏72 h組>冷藏48 h組>冷藏24 h組，這與CHAPMAN等[15]研究結(jié)果一致。原料乳冷藏過程中可能發(fā)生酪蛋白和磷酸鈣的解體，從而影響干酪的保水性和干酪結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響干酪中的水分含量[15]。

2.1.2 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH值的變化

pH通過影響硬質(zhì)干酪中微生物環(huán)境、酶的活性，進(jìn)而對(duì)干酪成熟期間一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)產(chǎn)生影響。表1反映了牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH的變化。

表1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH值的變化Table 1 Changes of pH value of yak hard cheese during ripening

由表1可知，3組硬質(zhì)干酪在成熟初期都呈現(xiàn)下降趨勢，而在后期都呈現(xiàn)升高趨勢，即有著先降低后增加的變化，與MANKAI等[5]結(jié)論一致。新鮮牦牛乳硬質(zhì)干酪的pH值分別為5.427、5.177、5.327，成熟1個(gè)月時(shí)，pH分別降低到4.993、4.787、4.920。成熟初期，硬質(zhì)干酪中乳糖被分解而產(chǎn)生乳酸，從而使干酪pH降低[16]。成熟1個(gè)月后，pH分別升高到5.727、5.663、5.740。成熟后期，乳糖被消耗完后，由于蛋白質(zhì)降解作用，可溶性氮含量增加，使得pH又不斷升高[17]。另外，也有研究表明，NaCl含量的增加也影響pH值變化[18]。整個(gè)成熟過程中，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪中pH始終為冷藏24 h組>冷藏72 h組>冷藏48 h組，TAVARIA等[19]研究表明，原料乳冷藏時(shí)間的延長總體上降低了pH值，因此有利于某些氨基酸殘基的釋放。

2.1.3 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間NaCl含量的變化

干酪中鹽的添加有利于促進(jìn)乳清的進(jìn)一步排放，改善風(fēng)味，控制干酪含水量及最終硬度，NaCl含量直接影響干酪成熟[20]。3組牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間NaCl含量如圖2所示。

圖2 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間NaCl含量的變化Fig.2 Changes of NaCl content in yak hard cheese during ripening

由圖2可知，干酪中NaCl含量隨著成熟時(shí)間的延長呈增長趨勢。在0～6個(gè)月成熟過程中，冷藏24、48、72 h牦牛乳制成的硬質(zhì)干酪中NaCl含量分別上升了0.22%、0.25%、0.29%，干酪中NaCl含量越高，則越快排出乳清，排出乳清的同時(shí)會(huì)消失更多的鹽分和水分，這與牦牛乳硬質(zhì)干酪中水分含量變化趨勢一致。KATSIARI等[21]發(fā)現(xiàn)NaCl含量上升程度與水分降低程度基本一致，干酪中NaCl添加量與水分含量呈顯著負(fù)相關(guān)。整個(gè)成熟過程中，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪中NaCl含量始終為冷藏24 h組>冷藏48 h組>冷藏72 h組。有研究表明，同一成熟期內(nèi)，原料乳冷藏時(shí)間越短，所制作的硬質(zhì)干酪中NaCl含量越高[22]。

2.1.4 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間脂肪含量的變化

牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間脂肪含量的變化結(jié)果見圖3。

圖3 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間脂肪含量的變化Fig.3 Changes in fat content in yak hard cheeses during ripening

由圖3可知，3組硬質(zhì)干酪的脂肪含量在0個(gè)月時(shí)都在27%～31%，成熟6個(gè)月時(shí)降低到23%～26%。3組硬質(zhì)干酪的脂肪含量分別下降了5.34%、4.45%、3.33%，冷藏24 h原料乳制成的硬質(zhì)干酪脂肪含量下降程度最大。脂肪含量降低主要是因?yàn)橹驹陉笈Ｈ樽陨砗臀⑸锎x產(chǎn)生的脂肪酶作用下分解，導(dǎo)致其脂肪含量減少。脂肪是干酪中重要的組成之一，脂肪含量的降低，可能會(huì)對(duì)干酪質(zhì)地、風(fēng)味特征以及功能特性產(chǎn)生不利影響[23]。整個(gè)成熟期內(nèi)，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪中脂肪含量始終為冷藏24 h組>冷藏48 h組>冷藏72 h組，且24 h硬質(zhì)干酪脂肪含量顯著高于48 h和72 h硬質(zhì)干酪(P<0.05)。這可能是由于隨著原料乳冷藏時(shí)間的延長，嗜冷菌數(shù)量越多，因而脂肪被降解所致，這與LAW等[24]研究結(jié)果相一致。

2.2 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間蛋白水解程度的變化

2.2.1 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH 4.6-SN的變化

pH 4.6-SN是蛋白質(zhì)次級(jí)降解產(chǎn)物，其高低表明了蛋白質(zhì)水解程度的高低，表示干酪蛋白質(zhì)降解的廣度，是干酪成熟程度的標(biāo)志[25]。本實(shí)驗(yàn)測定pH 4.6-SN含量的目的是了解成熟過程中多肽的含量及其降解程度[26]。牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH 4.6-SN含量的變化見圖4。

圖4 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間pH 4.6-SN/TN的變化Fig.4 Changes of pH 4.6-SN/TN during yak hard cheese ripening

由圖4可知，3組硬質(zhì)干酪隨著時(shí)間的延長pH 4.6-SN含量均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。這與曹瑛瑛等[27]的研究結(jié)果一致。3組新鮮牦牛乳硬質(zhì)干酪中pH4.6-SN含量分別為13.95%、14.07%、14.50%，成熟6個(gè)月時(shí)，3組干酪中pH 4.6-SN含量分別增加了8.02%、8.53%、10.07%，說明了成熟時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪中pH 4.6-SN含量影響顯著(P<0.05)。在整個(gè)成熟期內(nèi)，4 ℃冷藏72 h原料乳制成的干酪pH 4.6-SN含量最高，冷藏48 h原料乳制成的干酪次之，冷藏24 h原料乳制成的干酪最低。這可能是因?yàn)槔洳?2 h原料乳中存在大量微生物，蛋白水解細(xì)菌水解酪蛋白，并可能利用這種蛋白質(zhì)來源生長。WITING[28]研究表明，冷藏原料乳的凝固時(shí)間延長，這會(huì)使產(chǎn)生的凝固物不堅(jiān)硬，并促進(jìn)嗜冷菌(產(chǎn)耐熱蛋白酶)的生長。

2.2.2 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間12% TCA-SN的變化

TCA-SN是反映蛋白質(zhì)二次降解后的提取物，主要包括小肽、游離氨基酸和一些小的含氮化合物，其主要是在硬質(zhì)干酪加工過程中加入的凝乳酶和發(fā)酵劑肽酶共同催化產(chǎn)生的，體現(xiàn)了干酪蛋白質(zhì)降解的深度[29]。牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間12% TCA-SN含量的變化見圖5。

圖5 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間12% TCA-SN/TN的變化Fig.5 Changes of 12%TCA-SN/TN during yak hard cheese ripening

由圖5可知，隨著成熟期的延長，3組硬質(zhì)干酪中的12% TCA-SN含量都呈上升趨勢，這與宋雪梅[30]的研究結(jié)果一致。在整個(gè)成熟過程中，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪中12% TCA-SN含量分別上升了11.84%、11.54%、13.65%。12% TCA-SN含量取決于蛋白酶、肽酶將酪蛋白水解成小肽和氨基酸。在成熟過程中，蛋白質(zhì)不斷水解，可溶性氮含量增加[17]。整個(gè)成熟期內(nèi)，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪中12%TCA-SN含量始終為冷藏72 h組>冷藏48 h組>冷藏24 h組。原料乳冷藏時(shí)間越長，硬質(zhì)干酪中12% TCA-SN含量越高，說明了不同冷藏時(shí)間的原料乳制成的硬質(zhì)干酪中蛋白水解水平不同，冷藏72 h原料乳制成的硬質(zhì)干酪的蛋白水解能力強(qiáng)。

2.2.3 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間總游離氨基酸的變化

在硬質(zhì)干酪成熟過程中，酪蛋白分子先分解成多肽，再分解成游離氨基酸。其游離氨基酸對(duì)硬質(zhì)干酪風(fēng)味形成起著重要的作用[31]。牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間游離氨基酸總量的變化見圖6。

由圖6可知，3組硬質(zhì)干酪在整個(gè)成熟期間，游離氨基酸總量均呈增加趨勢。3組新鮮牦牛乳硬質(zhì)干酪中游離氨基酸總量分別為0.245、0.274、0.402 mg/g，24 h組和48 h組游離氨基酸總量不存在顯著差異(P>0.05)，含量相當(dāng)。隨著成熟時(shí)間的延長，游離氨基酸總量幾乎直線上升，成熟6個(gè)月時(shí)，3組干酪中游離氨基酸總量分別到達(dá)3.656、4.224、4.482 mg/g。這說明隨著成熟時(shí)間的延長，蛋白質(zhì)不斷被降解。在整個(gè)成熟期內(nèi)，冷藏72 h組游離氨基酸總量高于冷藏48 h組和冷藏24 h組。這說明原料乳冷藏時(shí)間延長，提高了牦牛乳硬質(zhì)干酪中的總游離氨基酸含量。游離氨基酸的增多，一方面，有利于增加干酪風(fēng)味，另一方面，如存在產(chǎn)胺微生物時(shí)，這表明存在生物胺增多的風(fēng)險(xiǎn)[32]。

圖6 牦牛乳硬質(zhì)干酪成熟期間游離氨基酸總量的變化Fig.6 Changes of total free amino acids during yak hard cheese ripening

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以不同冷藏時(shí)間的牦牛乳為原料制作成牦牛乳硬質(zhì)干酪，比較了3組牦牛乳硬質(zhì)干酪在成熟期間水分含量、pH值、鹽含量和脂肪含量及其蛋白質(zhì)水解程度，研究了原料乳冷藏時(shí)間對(duì)牦牛乳硬質(zhì)干酪理化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明在成熟過程中，3組牦牛乳硬質(zhì)干酪pH有著先降低后升高的變化趨勢，冷藏72 h原料乳制成的干酪中水分含量最高，冷藏48 h組次之，冷藏24 h組最低。NaCl含量、脂肪含量變化趨勢則與前面水分含量相反。冷藏時(shí)間越長的原料乳，制成的硬質(zhì)干酪在成熟過程中pH 4.6-SN、12%TCA-SN、總游離氨基酸含量越高，說明蛋白質(zhì)不斷被水解，蛋白水解程度深。本研究可為原料乳和牦牛乳硬質(zhì)干酪品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。