原人參二醇組皂苷選擇性制備人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5及其生成機(jī)理研究

張浩然，朱小涵，張躍偉，李琳，李玲，成樂琴*

1(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林，132022)2(長春市公安司法鑒定中心，吉林 長春，130000) 3(吉林省彩森仁生物科技有限責(zé)任公司，吉林 吉林，132022)

人參(PanaxginsengC.A.Mey)是一種五加科人參屬多年生草本植物，其根含有多種活性成分，具有很高的藥用價值。人參作為一種中草藥，在中國已有兩千多年的歷史，有“百草之王”的美譽(yù)，現(xiàn)今在中國、韓國等亞洲國家廣泛使用。人參皂苷是人參的重要活性成分之一，具有增強(qiáng)記憶力[1]、提高免疫力[2]、改善心血管系統(tǒng)[3]、延緩衰老[4]、預(yù)防癌癥[5]等藥理作用。

稀有人參皂苷Rg3和Rg5是原人參二醇型(protopanaxadiol，PD)皂苷的降解產(chǎn)物，對其藥理活性研究發(fā)現(xiàn)，它們在抗抑郁[6]、抑制腫瘤細(xì)胞增殖(乳腺癌[7]、胃癌[8])、改善糖尿病并發(fā)癥[9]、改善記憶力[10]等方面具有良好的藥效，同時因毒性小，成為了近年來研究熱點。

稀有人參皂苷Rg3存在20(R)-Rg3和20(S)-Rg3兩種差向異構(gòu)體，它們的生化特性因C-20位羥基的空間排列差異而異。如20(S)-Rg3對人肝癌細(xì)胞[11]，肺癌細(xì)胞[12]及卵巢癌細(xì)胞[13]等都顯示出比20(R)-Rg3更強(qiáng)的抑制作用；20(S)-Rg3對于治療白血病也起一定作用；20(S)-Rg3也可阻斷Ca2+、K+和Na+通道并抑制內(nèi)皮細(xì)胞的冠狀動脈收縮[14-15]，這表明Rg3的2種差向異構(gòu)體在某些藥物活性方面顯示出一定差異。另據(jù)報道[16]，20(S)-Rg3比20(R)-Rg3在生物體內(nèi)顯示出更好的水溶性、生物利用度及耐受性，因此20(S)-Rg3的立體選擇性制備受到廣泛關(guān)注。目前Rg5的制備方法主要還是借助于加工人參(如紅參、黑參)中分離[17]，而20(S)-Rg3的制備方法主要采用酶催化法[18-19]。通過人參的熱加工可以提高人參皂苷20(R/S)-Rg3和Rg5的含量，但加工時間長，而且S-Rg3的選擇性低；酶催化法立體選擇性很高，但酶容易失活，而且制備成本高。

PD型皂苷的降解是復(fù)雜的反應(yīng)過程。以人參皂苷Rb1為例，通過不同糖苷鍵的水解反應(yīng)，可以生成人參皂苷Rd、F2、(R,S)-Rg3、(R,S)-Rh2、(R,S)-PPD以及絞股藍(lán)皂苷Gypenoside ⅩⅤⅡ和Gypenoside LⅩⅩⅤ等次級皂苷；還可以經(jīng)C-20位糖苷鍵的水解，支鏈又可以發(fā)生多種變化，如生成烯烴(包括順反異構(gòu)體、位置異構(gòu)體)、醇、環(huán)醚等物質(zhì)[20-22](圖1)，人參皂苷Rg5就是在支鏈的C-20和C-22之間生成新的E-構(gòu)型雙鍵的次級皂苷。

由此可見，在眾多可能的降解產(chǎn)物中，如何通過控制區(qū)域選擇性和立體選擇性低成本制備高生物活性次級稀有皂苷Rg5和20(S)-Rg3具有重要價值。本實驗以PD型皂苷為原料，通過成本低廉的鹽酸作酸催化劑高立體選擇性制備Rg5和20(S)-Rg3，并探討其反應(yīng)機(jī)理，為Rg5和20(S)-Rg3的制備提供新的思路。

圖1 人參皂苷Rb1的部分降解產(chǎn)物示意圖Fig.1 Schematic diagram of partial degradation products of ginsenoside Rb1

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PD型皂苷(80%)，恒久生物科技有限公司；人參皂苷Rb1(≥98%)，成都曼斯特生物科技有限公司(甲醇)，色譜純、無水乙醇(分析純，≥99%)、濃硫酸(色譜純)，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸(分析純)，哈爾濱化工化學(xué)試劑廠；乙腈(色譜純)，美國Tedia公司；氯化鈉、氯化鈣，天津市大茂化學(xué)試劑廠；重氧水，薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；LC3000 I型高效液相色譜儀，北京鋼臣科技有限公司；80-1型電動離心機(jī)，金壇市華城開元實驗儀器廠；BT25S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；TS-200B型恒溫?fù)u床，上海天呈實驗儀器制造有限公司；PinnacleⅡ C18色譜柱，美國Restek。

1.3 實驗方法

1.3.1 PD型皂苷的純化

向質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的PD型皂苷中加入10倍體積乙醚回流2 h，分出乙醚，自然干燥得脫脂PD型皂苷。向預(yù)處理的D101C大孔吸附樹脂中加入質(zhì)量濃度為15 mg/mL的脫脂PD型皂苷溶液，在恒溫?fù)u床中60 ℃、250 r/min條件下吸附12 h。將吸附人參皂苷的大孔樹脂依次使用體積分?jǐn)?shù)為30%、80%乙醇水溶液于60 ℃、250 r/min下分別靜態(tài)解吸12 h，并將80%乙醇解析液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，干燥得到含量為89.33%的PD皂苷，其中人參皂苷Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd的含量分別為41.39%、13.19%、3.63%、4.52%和26.60%。

1.3.2 人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的制備方法

取1.5 mL離心管，分別加入1.5 mg純化PD皂苷和100 μL乙醇至PD皂苷溶液質(zhì)量濃度為15 mg/mL，再加入等體積的酸溶液，在恒溫水浴鍋中磁力攪拌下加熱反應(yīng)，并分別探索酸的種類、酸濃度、乙醇濃度、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間對人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的收率影響。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)冷卻，加入適量的飽和碳酸鈉溶液調(diào)pH至6左右，在45 ℃溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干。殘留物用3 mL色譜純甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)Rg3的2種差向異構(gòu)體的收率(Y)計算20(S)-Rg3的非對映異構(gòu)體過量百分比(de%)。計算如公式(1)所示：

(1)

式中：YS-Rg3表示差向異構(gòu)體S-Rg3的收率；YR-Rg3表示差向異構(gòu)體R-Rg3的收率。

1.3.3 HPLC分析方法

本實驗中采用的色譜條件為：色譜柱PinnacleⅡC18(250 mm×4.60 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫為室溫；進(jìn)樣量15 μL；流動相A：乙腈；流動相B：純凈水(超聲除氣處理)；梯度洗脫程序按照張仔豪等[20]的方法進(jìn)行。

1.3.4 無水甲醇-鹽酸溶液的制備

三口燒瓶中加入氯化鈉固體，安裝滴液漏斗和導(dǎo)氣管。滴液漏斗中加入濃硫酸，室溫下緩慢滴加到氯化鈉中，此時產(chǎn)生的氯化氫氣體由導(dǎo)氣管經(jīng)過氯化鈣干燥管進(jìn)入由冷肼冷卻的無水甲醇溶液得到無水甲醇-鹽酸溶液，用氫氧化鈉重復(fù)標(biāo)定3次，測得濃度為0.931 8 mol/L，密封，置于冰箱冷凍室備用。

1.3.5 20(S)-Rg3的生成機(jī)理研究

取1.5 mL離心管，加入100 μL質(zhì)量濃度為15 mg/mL的人參皂苷Rb1，再分別加入濃度為0.02 mol/L無水甲醇-鹽酸水溶液和無水甲醇-鹽酸重氧水溶液，在恒溫水浴鍋中攪拌下60 ℃加熱反應(yīng)3.5 h。待反應(yīng)產(chǎn)物冷卻，加入適量飽和碳酸鈉溶液將pH調(diào)至6后，在45 ℃溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，殘留物用3 mL色譜純甲醇溶解，0.45 μm濾膜過濾，進(jìn)行LC-MS分析，并根據(jù)Rg3的主要分子離子峰探索20(S)-Rg3的生成機(jī)理。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的制備條件優(yōu)化

2.1.1 酸種類對制備人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的影響

固定PD皂苷質(zhì)量濃度為15 mg/mL，依次加入100 μL濃度為0.02 mol/L無水乙醇-鹽酸、無水乙醇-硫酸、無水乙醇-磷酸、無水乙醇-D-乳酸、無水乙醇-L-乳酸以及無水乙醇-乙酸溶液，在60 ℃條件下反應(yīng)4 h。反應(yīng)液經(jīng)后處理，通過HPLC進(jìn)行人參皂苷的定量分析，并以酸種類為橫坐標(biāo)，以20(S)-Rg3、20(R)-Rg3和Rg5的收率為縱坐標(biāo)繪制如圖2所示。

圖2 不同種類的酸對制備20(S)-Rg3和Rg5的影響Fig.2 Effects of different acids on the preparation of 20(S)-Rg3 and Rg5

由圖2可知，無機(jī)酸作酸催化劑時，均能生成人參皂苷Rg5，其中鹽酸作酸催化劑時，Rg5的收率明顯高于硫酸和磷酸催化劑。與此形成鮮明對比的是，D-乳酸、L-乳酸和乙酸等有機(jī)酸作酸催化劑時，幾乎不生成人參皂苷Rg5。在人參皂苷Rg3的生成方面，同樣鹽酸顯示出最好的收率，而且20(S)-Rg3的選擇性非常高。因此，無論是從20(S)-Rg3和Rg5的收率方面還是20(S)-Rg3的立體選擇性方面考慮，鹽酸都是比較好的選擇。

2.1.2 鹽酸濃度對制備人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的影響

固定PD皂苷質(zhì)量濃度為15 mg/mL，依次加入100 μL濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mol/L的鹽酸乙醇溶液，在60 ℃反應(yīng)4 h。實驗結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，酸濃度對20(S)-Rg3、20(R)-Rg3和Rg5的影響有規(guī)律性變化。當(dāng)酸濃度為0.01～0.02 mol/L時，20(S)-Rg3和Rg5的收率隨酸濃度的增大而增大，當(dāng)酸濃度進(jìn)一步增大時，因20(S)-Rg3和Rg5的分解，收率逐步減小。對應(yīng)不同酸濃度下的Rg3的de%值為89.67%、98.28%、97.55%、96.28%、96.93%，說明在0.02 mol/L及以上濃度鹽酸催化下，均顯示出非常高的非對映體過量百分比(de%)。

圖3 鹽酸濃度對制備20(S)-Rg3和Rg5的影響Fig.3 Effect of hydrochloric acid concentration on the preparation of 20(S) -Rg3 and Rg5

2.1.3 乙醇濃度對制備人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的影響

為了考察乙醇濃度對反應(yīng)的影響，固定PD皂苷質(zhì)量濃度為15 mg/mL，分別加入100 μL濃度為0.02 mol/L的用體積分?jǐn)?shù)為99%、95%、90%、85%、80%的乙醇-水溶液配制的鹽酸溶液，在60 ℃反應(yīng)4 h。實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇濃度對制備20(S)-Rg3和Rg5的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the preparation of 20(S) -Rg3 and Rg5

由圖4可知，人參皂苷Rg5、20(S)-Rg3和20(R)-Rg3的收率隨著乙醇濃度的升高顯示出不同的變化規(guī)律。人參皂苷Rg5的收率隨著乙醇濃度的升高顯示逐漸上升趨勢；20(S)-Rg3的收率先上升后小幅下降，并在90%～100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇溶液中保持基本穩(wěn)定；而人參皂苷20(R)-Rg3收率變化規(guī)律不同于人參皂苷Rg5和20(S)-Rg3，顯示出逐漸下降的變化趨勢。這說明乙醇濃度的變化對Rg5的收率影響明顯高于其對Rg3的收率影響，而且隨著乙醇濃度的升高，20(S)-Rg3和20(R)-Rg3收率的不同變化規(guī)律對于提高20(S)-Rg3立體選擇性非常有利，這也可以從隨著乙醇濃度的升高，de%值(64.73%、51.70%、70.61%、86.81%、98.28%)逐漸增大的變化趨勢得到印證。

2.1.4 反應(yīng)溫度對制備人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的影響

固定PD皂苷質(zhì)量濃度為15 mg/mL，加入0.02 mol/L無水乙醇-鹽酸溶液100 μL，分別在40、50、60、70、80 ℃下進(jìn)行反應(yīng)4 h。實驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)溫度對制備20(S)-Rg3和Rg5的影響Fig.5 Effect of reaction temperature on the preparation of 20(S) -Rg3 and Rg5

由圖5可知，反應(yīng)溫度對Rg5的收率影響非常顯著。在反應(yīng)溫度為40～70 ℃，人參皂苷Rg5的收率呈現(xiàn)上升趨勢，而溫度進(jìn)一步升高，因為皂苷的分解加速，收率逐漸降低；20(S)-Rg3的收率在40～60 ℃緩慢升高，進(jìn)一步升高溫度開始下降；而20(R)-Rg3在40～60 ℃幾乎不生成，而隨著溫度的進(jìn)一步升高，20(R)-Rg3的收率逐漸緩慢升高，到60～70 ℃時其收率與20(S)-Rg3的收率曲線發(fā)生交叉，這說明較高的反應(yīng)溫度不利于20(S)-Rg3的立體選擇性制備。而反應(yīng)溫度由低到高的de%為99.85%、97.29%、98.28%、67.59%、86.85%[67.59%、86.85%是20(R)-Rg3對20(S)-Rg3的過量百分比]，說明在40～60 ℃，20(S)-Rg3對20(R)-Rg3的de%很高，而進(jìn)一步升高溫度，反而是20(R)-Rg3對20(S)-Rg3的de%升高。綜合考慮Rg5和20(S)-Rg3的收率和de%，選擇60 ℃進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化。

2.1.5 反應(yīng)時間對制備人參皂苷20(S)-Rg3和Rg5的影響

固定PD皂苷質(zhì)量濃度為15 mg/mL，依次加入100 μL濃度為0.02 mol/L的無水乙醇-鹽酸溶液，在60 ℃分別反應(yīng)1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，實驗結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)時間對制備20(S)-Rg3和Rg5的影響Fig.6 Effect of reaction time on the preparation of 20(S)-Rg3 and Rg5

由圖6可知，反應(yīng)時間對Rg5的收率影響較大，但對20(S)-Rg3、20(R)-Rg3影響不是很大。在反應(yīng)時間為3.5 h時，人參皂苷Rg5和20(S)-Rg3的如率達(dá)到最高，在反應(yīng)時間高于3.5 h，人參皂苷Rg5的收率有所降低。對應(yīng)反應(yīng)時間由小到大的20(S)-Rg3的de%值分別為90.73%、93.77%、90.89%、92.88%、98.28%，表明在60 ℃條件下在無水乙醇溶劑中整體顯示出較高水平，且4 h時de%值最高，此時Rg5和20(S)-Rg3的收率分別為50.12%和15.32%。

為了考察其他醇溶劑對反應(yīng)的影響，在上述較優(yōu)反應(yīng)條件下，用無水甲醇為溶劑進(jìn)行了反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC分析結(jié)果表明(圖7)，甲醇為反應(yīng)溶劑時與乙醇一樣主要生成人參皂苷Rg5，同時也會高立體選擇性生成20(S)-Rg3。

圖7 無水甲醇和無水乙醇中PD人參皂苷的 酸水解產(chǎn)物HPLC對比圖Fig.7 HPLC comparison of acid hydrolysates of PD ginsenosides in anhydrous methanol and ethanol

由圖7可知，無論是無水甲醇或無水乙醇作為溶劑，PD型人參皂苷在酸催化下的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物主要都是人參皂苷Rg5。人參皂苷Rz1和人參皂苷Rk1是人參皂苷Rg5的同分異構(gòu)體，其中Rg5和Rz1是內(nèi)烯烴，是符合Zaitsev’s規(guī)則產(chǎn)物，相對較穩(wěn)定，Rk1是端烯烴，是非Zaitsev’s規(guī)則(Hofmann規(guī)則)產(chǎn)物，相對不穩(wěn)定。由于人參皂苷Rg5是能量上更穩(wěn)定的E-構(gòu)型結(jié)構(gòu)，因此很容易判斷3種同分異構(gòu)體中其主要生成物為人參皂苷Rg5。人參皂苷Rg3作為PD型皂苷在C-20位的糖降解產(chǎn)物，由于降解方式的不同可分為構(gòu)型保持的20(S)-Rg3和構(gòu)型發(fā)生Walden翻轉(zhuǎn)的20(R)-Rg3，僅從C-20位羥基的空間排列不同，無法從穩(wěn)定性直接判斷哪一種構(gòu)型為主產(chǎn)物，為此對人參皂苷S-Rg3的生成機(jī)理進(jìn)行了進(jìn)一步的探索。

2.2 人參皂苷S-Rg3的生成機(jī)理

由文獻(xiàn)[23-24]可知，人們普遍認(rèn)為酸性條件下人參皂苷Rg3是通過碳正離子中間體機(jī)理生成，即反應(yīng)是SN1機(jī)理。而在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，酸性條件下水解PD型皂苷，有時R-Rg3的生成遠(yuǎn)多于S-Rg3[24]，有時如同本文中S-Rg3的生成遠(yuǎn)多于R-Rg3，因此對其生成機(jī)理產(chǎn)生了濃厚興趣。為了探索本研究中高立體選擇性生成S-Rg3的反應(yīng)機(jī)理，利用Winstein離子對機(jī)理進(jìn)行了2種Rg3差向異構(gòu)體的生成預(yù)測，同時選擇PD皂苷中含量最高的人參皂苷Rb1為原料，利用同位素標(biāo)記法進(jìn)行了人參皂苷的水解反應(yīng)。

如圖8所示，假設(shè)人參皂苷Rg3是SN1反應(yīng)產(chǎn)物，按照Winstein離子對機(jī)理，PD型皂苷在酸性條件下質(zhì)子化后生成自由三級碳正離子的過程中，分別經(jīng)過三級碳正離子和二糖(或單糖)的緊密離子分子對、溶劑分離子分子對以及最后的自由碳正離子和二糖(或單糖)階段，而親核試劑在其中任何一個階段都可以進(jìn)攻碳正離子。如果親核試劑H2O在緊密離子分子對階段或溶劑分離子分子對階段進(jìn)攻碳正離子，由于糖分子的空間阻礙，H2O主要從糖的反向進(jìn)攻碳正離子，因此主要得到構(gòu)型發(fā)生Walden翻轉(zhuǎn)的R-構(gòu)型產(chǎn)品；當(dāng)親核試劑H2O在自由離子階段進(jìn)攻碳正離子時，碳正離子和糖之間足夠遠(yuǎn)離，不會阻礙親核試劑的進(jìn)攻路線，此時H2O從碳正離子正反兩端進(jìn)攻幾率相等，會得到1∶1的R-Rg3和S-Rg3。顯然，酸性條件下的Rg3的生成如果為SN1反應(yīng)機(jī)理，理論上構(gòu)型翻轉(zhuǎn)的R-Rg3多于構(gòu)型保持的S-Rg3。而本實驗中生成S-Rg3的立體選擇性非常高，這表明S-Rg3的生成主要反應(yīng)機(jī)理并非SN1機(jī)理，可能是SN2機(jī)理。

圖8 基于Winstein離子對機(jī)理的人參皂苷Rg3的生成示意圖Fig.8 Schematic diagram of ginsenoside Rg3 based on Winstein ion pair mechanism

A-99%甲醇；B-95%甲醇；C-50%甲醇圖9 甲醇水溶液中的Rb1的酸催化反應(yīng)產(chǎn)物的LC-MS 分析圖Fig.9 LC-MS analysis of acid catalyzed reaction products of Rb1 in methanol aqueous solution

A-99%甲醇；B-95%甲醇；C-50%甲醇圖10 甲醇重氧水溶液中的Rb1的酸催化 反應(yīng)產(chǎn)物的LC-MS分析圖Fig.10 LC-MS analysis of acid catalyzed reaction products of Rb1 in methanol heavy oxygen aqueous solution

圖11 立體選擇性生成S-Rg3的反應(yīng)機(jī)理Fig.11 Reaction mechanism of stereoselective formation of S-Rg3

3 結(jié)論

PD型人參皂苷在結(jié)構(gòu)上因含有雙鍵及C-3和C-20位連有不等糖基數(shù)目的糖苷鍵，降解產(chǎn)物復(fù)雜多樣。本文利用價格相對低廉的PD型皂苷為原料，探索了通過酸催化法高立體選擇性制備人參皂苷Rg5和20(S)-Rg3的方法，并研究了立體選擇性生成20(S)-Rg3的生成機(jī)理。實驗表明，酸的類型和溶劑的種類以及溶劑中水含量對于人參皂苷Rg5的收率以及立體選擇性生成S-Rg3有非常大的影響。通過鹽酸作催化劑，無水乙醇或甲醇作反應(yīng)溶劑進(jìn)行皂苷降解反應(yīng)，可以得到較高收率的人參皂苷Rg5，同時可以高立體選擇性得到20(S)-Rg3。通過同位素標(biāo)記法進(jìn)行Rg3的生成機(jī)理研究表明，水含量對Rg3的生成機(jī)理影響顯著，水含量越多，越有利于進(jìn)行SN1反應(yīng)生成Rg3差向異構(gòu)體混合物，水含量越少，越有利于進(jìn)行SN2反應(yīng)生成構(gòu)型保持的S-Rg3。S-Rg3的制備過去主要依賴于酶催化方法，雖然選擇性很高，但酶的底物特異性導(dǎo)致皂苷的適用范圍受限，而且酶容易失活，難以保存，導(dǎo)致成本較高。本研究表明，利用簡單的化學(xué)方法可以實現(xiàn)較高收率制備稀有人參皂苷Rg5，同時又可以像酶催化一樣高立體選擇性制備人參皂苷S-Rg3，從而降低S-Rg3的制備成本，這對于同時選擇性制備高附加值稀有皂苷具有重要參考價值。