富硒牡蠣肽的制備及其抗氧化和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性研究

夏珍，陳冰冰，黃文，康澳，梁興唐，尹艷鎮(zhèn)，唐德劍，孟莉，劉果，曹庸，苗建銀,,,4*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東省功能食品活性物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)2(北部灣大學(xué) 石油與化工學(xué)院， 欽州市生物廢棄物資源富硒功能化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 欽州，535000)3(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部富硒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)與質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 富硒食品開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 安康市富硒產(chǎn)品研發(fā)中心，陜西 安康，725000)4(廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室，廣西 玉林，537000)

活性氧(reactive oxygen species, ROS)在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和各種生物反應(yīng)中起著重要作用。然而，促氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡會(huì)引起氧化應(yīng)激，損害各種細(xì)胞成分(DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等)并導(dǎo)致系列疾病[1]。氧化應(yīng)激已被證明與高血壓和其他慢性疾病(如關(guān)節(jié)炎、糖尿病和神經(jīng)退行性疾病)的發(fā)展有密切關(guān)系，開(kāi)發(fā)兼具抗氧化、降血壓等多種活性功效的天然成分成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[2]。食源性生物活性肽或蛋白酶解物因具有良好的抗氧化能力、環(huán)保、可持續(xù)性、低成本和無(wú)毒副作用等優(yōu)點(diǎn)引起了人們極大的興趣[3]。已有研究表明，許多抗氧化酶解物或多肽具有良好的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性[4-5]。牡蠣蛋白質(zhì)含量豐富，氨基酸組成完善，同時(shí)牡蠣作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食同源的食品原料，是開(kāi)發(fā)具有抗氧化和ACE抑制活性的生物活性肽的良好來(lái)源。

硒是人體所必需的微量元素，是一些生物酶的輔助因子，如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)，硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase, TrxR)和脫碘酶(iodothyronine deiodinases, DIOs)等，在大多數(shù)生物體中表現(xiàn)出氧化還原酶的功能[6]。近年來(lái)，有機(jī)硒因其良好的安全性、良好的生物活性和生物利用度而受到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注，在均衡飲食的框架下，有機(jī)硒比無(wú)機(jī)硒更值得推薦[7]。與單一的硒化合物和普通的生物活性肽相比，硒肽具有更有效的生物活性，是生物活性肽領(lǐng)域中極具研究?jī)r(jià)值的新穎肽[8]。目前，利用富硒酵母[9]、大豆[6]、堇葉碎米薺[10]和黃粉蟲(chóng)[11]等硒蛋白原料開(kāi)發(fā)生物活性肽的研究已有報(bào)道。富硒生物活性肽具有多種功能活性，如堇葉碎米薺硒肽具有抗氧化和抗疲勞活性[10]，富硒黃粉蟲(chóng)幼蟲(chóng)經(jīng)堿性蛋白酶水解后的蛋白水解物顯示出良好的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性[11]。然而，利用北部灣富硒牡蠣開(kāi)發(fā)天然有機(jī)硒活性肽的研究尚無(wú)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒牡蠣蛋白，北部灣濱海富硒功能農(nóng)業(yè)研究院；堿性蛋白酶(2×105U/g)、中性蛋白酶(2×105U/g)、木瓜蛋白酶(2×105U/g)、胰蛋白酶(2 500 Usp U/mg)、胃蛋白酶(3 000 NF)，南寧龐博生物工程有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(來(lái)源于兔肺)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furyl)acryloyl]-L-phenylalanyl-glycyl-glycine, FAPGG)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸[4-2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid,HEPES]、2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(2,2′-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA)，美國(guó)Sigma公司；噻唑蘭[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide, MTT]、DPPH、ABTS，上海麥克林生化科技有限公司；杜氏改良高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、胎牛血清、雙抗(青霉素/鏈霉素)，美國(guó)Gibico公司；2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride，AAPH)，上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AL104電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DF-101S數(shù)顯恒溫水浴鍋，鞏義予華儀器有限公司；PHS-3CW pH計(jì)，賽多利斯科學(xué)儀器(京)有限公司；L530臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；FD-1型冷凍干燥機(jī)，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；S-433D全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)Sykam公司；AFS-9530原子熒光光度計(jì)，北京海光儀器有限公司；EnSpire2300多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默企業(yè)管理(上海)有限公司；CKX41倒置顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 富硒牡蠣肽的酶法制備及工藝優(yōu)化

1.3.1.1 工藝流程

稱取一定量富硒牡蠣蛋白粉→按一定底物質(zhì)量濃度加去離子水充分溶解→調(diào)節(jié)pH(1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl溶液)→按照不同酶底比加入蛋白酶→水浴酶解→滅酶(95 ℃，10 min)→離心(4 000 r/min，20 min)→上清液(測(cè)定DPPH自由基清除率)→真空冷凍干燥→富硒牡蠣肽凍干粉

1.3.1.2 單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)研究了酶解條件對(duì)富硒牡蠣肽清除DPPH自由基的影響。單因素包括：酶種類(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)；酶解時(shí)間(0.5、1、2、3、4 h)；pH值(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)；底物質(zhì)量濃度(1、3、5、7、9 g/100mL)；酶解溫度(30、35、40、45、50 ℃)、酶底比(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%)。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)因素的過(guò)程中，每次實(shí)驗(yàn)都只改變1個(gè)因素而保持其他因素不變。

1.3.1.3 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以酶解溫度、酶解時(shí)間、酶底比為影響因素，各取3個(gè)水平值，以酶解物的DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，確定富硒牡蠣肽的最佳酶解工藝，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平Table 1 Factor and level of response surface experiment

1.3.2 硒含量測(cè)定

樣品的硒含量測(cè)定參照GB 5009.93—2017《食品中硒的測(cè)定 氫化物原子熒光光譜法》。

1.3.3 氨基酸組成測(cè)定

氨基酸含量測(cè)定參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定 氨基酸分析儀》。

1.3.4 抗氧化評(píng)價(jià)

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

參考MIAO等[12]的方法進(jìn)行測(cè)定。將100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液和100 μL DPPH溶液加入96孔板中，混勻后于室溫、避光條件下反應(yīng)30 min，立即測(cè)定其在517 nm處的吸光值。DPPH自由基清除率的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：A0為100 μL無(wú)水乙醇+100 μL DPPH溶液的吸光值，Ai為100 μL樣品溶液+100 μL DPPH溶液的吸光值，Aj為100 μL樣品溶液+100 μL無(wú)水乙醇的吸光值。

1.3.4.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力的測(cè)定

參考MIAO等[12]的方法配制ABTS工作液，依次加入100 μL ABTS工作液和100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于96孔板中，混勻，于37 ℃下避光反應(yīng)10 min后，在734 nm處測(cè)定吸光值。ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：A0為100 μL去離子水+100 μL ABTS工作液的吸光值，Ai為100 μL樣品溶液+100 μL ABTS工作液的吸光值，Aj為100 μL樣品溶液+100 μL去離子水的吸光值。

1.3.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性試驗(yàn)

HepG2細(xì)胞培養(yǎng)參考LI等[13]的方法。富硒牡蠣肽對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性檢測(cè)參照MIAO等[12]的方法略作修改。將100 μL HepG2細(xì)胞細(xì)胞懸液(1×105cells/mL)接種于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，樣品組加入100 μL富硒牡蠣肽溶液(0.5、5、50、100、250、500、1 000、2 000、5 000 μg/mL)，對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用PBS清洗后，加入100 μL MTT溶液(0.5 mg/mL)繼續(xù)孵育4 h。棄去MTT溶液，加入100 μL 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，振蕩10 min使藍(lán)紫色結(jié)晶全部溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的OD值。

1.3.4.4 細(xì)胞抗氧化活性(cellular antioxidant activity，CAA)測(cè)定

在黑色96孔板中每孔接種100 μL HepG2細(xì)胞懸液(6×105cells/mL)，分為對(duì)照孔(PC)，空白孔(NC)和處理孔(TC)，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用PBS洗滌一遍。對(duì)照組和空白組中加入50 μL DCFH-DA(50 μmol/L)工作溶液和50 μL無(wú)菌水；樣品組中加入50 μL DCFH-DA(50 μmol/L)工作溶液和50 μL不同濃度的富硒牡蠣肽溶液，37 ℃下孵育1 h。棄去處理培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次，在空白組中加入培養(yǎng)基，在對(duì)照組和處理組中加入100 μL 2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽[2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride, ABAP](600 μmol/L)工作溶液。酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)528 nm的熒光值，激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，測(cè)定時(shí)長(zhǎng)為1 h，每5 min測(cè)1次。CAA的計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：AUC代表熒光強(qiáng)度-時(shí)間曲線下的積分面積。

1.3.4.5 對(duì)AAPH誘導(dǎo)損傷HepG2細(xì)胞的保護(hù)作用

將100 μL HepG2細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中，得到每孔2×104個(gè)細(xì)胞，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，空白對(duì)照組加入100 μL培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入100 μL含AAPH的培養(yǎng)基(AAPH濃度為0～16 mmol/L)，繼續(xù)孵育24 h，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，探索合適的AAPH濃度以構(gòu)建細(xì)胞適度損傷模型。

將100 μL HepG2細(xì)胞細(xì)胞懸液(2×105cells/mL)接種于96孔板中，分為空白對(duì)照組、損傷組和保護(hù)組，37 ℃孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，空白對(duì)照組和損傷組加入100 μL培養(yǎng)基，保護(hù)組加入100 μL的富硒牡蠣肽溶液(5、10、25、50、100 μg/mL)繼續(xù)孵育24 h。然后，空白對(duì)照組加入50 μL培養(yǎng)基，損傷組和保護(hù)組加入50 μL含AAPH的培養(yǎng)基(AAPH終濃度為0.5 mmol/L)，繼續(xù)孵育24 h后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗后，采用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.3.5 ACE抑制率測(cè)定

根據(jù)等CAO等[14]的方法加以修改測(cè)定富硒牡蠣肽的ACE抑制活性。依次加入10 μL ACE(0.1 U/mL)溶液，40 μL樣品溶液，最后加入50 μL 1.0 mmol/L的FAPGG底物(用含有0.3 mol/L NaCl的80 mmol/L的HEPES緩沖液配制)?？瞻讓?duì)照組使用等體積的80 mmol/L HEPES緩沖液代替樣品?；靹蚝螅⒖虦y(cè)定在340 nm處的初始OD值，37 ℃保溫30 min后再測(cè)定其OD值。ACE抑制率的計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：ΔAb為空白對(duì)照組吸光度在30 min內(nèi)的變化，ΔAa為樣品組吸光度在30 min內(nèi)的變化。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert v 8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析。采用SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，顯著性分析采用Duncan檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 富硒牡蠣肽的制備

2.1.1 單因素試驗(yàn)

由圖1-a可知，在不同蛋白酶最優(yōu)條件下，胃蛋白酶酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除率最高，達(dá)到(50.47±2.38)%，堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基的清除活性最低,為(28.43±2.22)%。因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，以胃蛋白酶為最適用酶進(jìn)一步優(yōu)化酶解工藝參數(shù)。

如圖1-b所示，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，在酶解3 h時(shí)達(dá)到最大值，之后其清除DPPH自由基的能力略有下降。分析原因可能是隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，底物特異性位點(diǎn)基本被完全反應(yīng)，繼續(xù)反應(yīng)不會(huì)導(dǎo)致額外的活性基團(tuán)暴露，甚至?xí)?dǎo)致底物過(guò)度酶解，產(chǎn)生活性較低的酶解產(chǎn)物[15]。因此，選擇酶解時(shí)間3 h作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

由圖1-c可知，利用胃蛋白酶酶解制備富硒牡蠣肽的最佳pH值為1.0。當(dāng)pH值從1.0增加到3.0時(shí)，酶解物的DPPH自由基清除率呈下降趨勢(shì)，可能是由于胃蛋白酶的最適pH為1.0～2.0，在這一范圍內(nèi)，胃蛋白酶的活性高，酶解效果好。pH繼續(xù)升高會(huì)破壞蛋白酶的活性中心和空間結(jié)構(gòu)，使其催化活性降低，所以確定最佳酶解pH為1.0。

由圖1-d可知，在1～7 g/100mL的底物質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力逐漸增加，但隨著底物質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，活性沒(méi)有明顯變化。由此可見(jiàn)，酶解早期，底物質(zhì)量濃度的增加促進(jìn)酶解過(guò)程的進(jìn)行。然而，底物質(zhì)量濃度過(guò)高會(huì)抑制分子的擴(kuò)散和移動(dòng)，限制蛋白酶的效率，導(dǎo)致酶解產(chǎn)生的活性抗氧化肽的相對(duì)含量降低[16]?？紤]到節(jié)約成本，以7 g/100mL為最佳底物質(zhì)量濃度進(jìn)行進(jìn)一步研究。

如圖1-e所示，溫度在30～40 ℃范圍內(nèi)，酶解物的DPPH自由基清除率隨溫度升高緩慢升高，在40 ℃達(dá)到最大值后下降。這是因?yàn)樵谙鄬?duì)較低的溫度下，酶的活性較小，分子的動(dòng)能較小，酶與底物之間的碰撞也較少，反應(yīng)效率低。當(dāng)超過(guò)其最適溫度后，蛋白酶逐漸變性，酶活性降低，導(dǎo)致酶解作用減弱。因此，選取酶解溫度35、40、45 ℃進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化。

如圖1-f所示，酶底比從0.1%增加到0.4%，酶解產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力提高。而當(dāng)酶底比進(jìn)一步提高到0.5%時(shí)，酶解產(chǎn)物清除DPPH自由基的能力明顯下降。合適的酶添加可提高富硒牡蠣蛋白的利用率，促進(jìn)抗氧化肽的生成，過(guò)高的酶用量可能造成過(guò)度酶解，導(dǎo)致活性抗氧化肽過(guò)度降解，產(chǎn)生活性較低的氨基酸或小分子肽。因此，選擇酶底比0.4%作為優(yōu)化的中心點(diǎn)。

a-酶種類；b-酶解時(shí)間；c-pH；d-底物質(zhì)量濃度；e-酶解溫度；f-酶底比圖1 酶解條件對(duì)富硒牡蠣肽的DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis conditions on DPPH radical scavenging activity of selenium-enriched oyster peptides

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

以酶解溫度(X1)、酶解時(shí)間(X2)和酶底比(X3)3個(gè)因素為自變量，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值(Y)，進(jìn)行3因素3水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到如下二階多項(xiàng)式方程，如公式(5)所示：

Y=58.26-0.54X1+0.53X2+0.080X3-0.96X1X2+0.063X1X3+0.54X2X3-1.61X12+0.10X22+1.34X32

(5)

回歸方程中各變量對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性由F檢驗(yàn)來(lái)判定，概率P值越小，則相應(yīng)變量的顯著程度越高。各因素對(duì)富硒牡蠣肽的DPPH自由基清除率的影響：酶解溫度>酶解時(shí)間>酶底比，且酶解溫度與酶解時(shí)間、酶解時(shí)間與酶底比交互作用影響顯著(P<0.05)，酶解溫度與酶底比交互作用影響不顯著(P>0.05)。

經(jīng)回歸模型預(yù)測(cè)，得到最佳酶解工藝參數(shù)為酶解時(shí)間3.96 h，酶解溫度36.71 ℃，酶底比0.5%，在此條件下DPPH自由基清除率預(yù)測(cè)值為60.979%。在實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證試驗(yàn)中，為了便于操作，選取酶解時(shí)間4 h，酶解溫度37 ℃，酶底比0.5%，pH 1.0，底物質(zhì)量濃度7 g/100mL進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在此工藝條件下所得富硒牡蠣肽的平均DPPH自由基清除率為(61.84±0.63)%，與模型預(yù)測(cè)值接近。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for respond surface analysis

表3 試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Results of variance analysis

2.2 硒含量及氨基酸組成分析

富硒牡蠣蛋白的硒含量為(1.30±0.07) mg/kg，高于DB45/T 1061—2014《富硒農(nóng)產(chǎn)品硒含量分類要求》中水產(chǎn)類硒含量指標(biāo)(0.10～0.50 mg/kg)。經(jīng)胃蛋白酶酶解優(yōu)化后，所得富硒牡蠣肽的硒含量明顯增加，達(dá)到(1.62±0.20) mg/kg，為其原料蛋白的1.24倍，這一結(jié)果表明酶解優(yōu)化工藝使硒得到一定程度的富集，說(shuō)明硒元素在酶解物活性方面發(fā)揮作用，特別對(duì)抗氧化活性起到關(guān)鍵作用。

由表4可知，富硒牡蠣肽中富含谷氨酸(15.51%)，天冬氨酸(9.66%)、組氨酸(8.52%)、亮氨酸(7.57%)、甘氨酸(7.44%)和精氨酸(7.44%)。研究報(bào)道，疏水性氨基酸殘基如亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸及苯丙氨酸能夠提高抗氧化肽抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的能力[17]，富硒牡蠣肽中疏水性氨基酸含量豐富(34.45%)，對(duì)肽的抗氧化活性有重要貢獻(xiàn)。酸性氨基酸和堿性氨基酸具有螯合促氧化的金屬離子的作用，能增強(qiáng)肽的抗氧化能力[17]，富硒牡蠣肽中酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占總氨基酸含量的25.17%、18.85%，其中，谷氨酸含量最高，使富硒牡蠣肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。此外，有研究報(bào)道，富含谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸和較多的疏水性氨基酸殘基的肽通常具有很強(qiáng)的ACE抑制作用[18]。富硒牡蠣肽富含這些與抗氧化和ACE抑制活性相關(guān)的氨基酸，因此，富硒牡蠣肽在抗氧化和降血壓方面有極大的潛力。

表4 氨基酸分析Table 4 Amino acid analysis

2.3 富硒牡蠣肽的抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除活性

如圖2所示，在0.10～8.00 mg/mL質(zhì)量濃度下，富硒牡蠣肽對(duì)DPPH自由基的清除能力為3.98%～96.64%，且具有顯著的劑量效應(yīng)。EC50值被廣泛應(yīng)用于對(duì)比目標(biāo)活性物的活性強(qiáng)弱，EC50值越低，表明清除自由基的能力越強(qiáng)。富硒牡蠣肽清除DPPH自由基的EC50值為1.365 mg/mL，與堇葉碎米薺硒蛋白酶解物[10][EC50:(1.14±0.11) mg/mL]接近，非常明顯低于尖吻鱸魚(yú)皮明膠水解物[19](EC50:60～87 mg/mL)和牛乳奶酪抗氧化肽[20](EC50:7.02～7.60 mg/mL)，表明富硒牡蠣肽具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除活性，有機(jī)硒能增強(qiáng)活性肽的抗氧化效力。

圖2 富硒牡蠣肽對(duì)DPPH自由基清除活性的影響Fig.2 Effect of selenium-enriched oyster peptides on DPPH radical scavenging activity 注：不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)，相同代表差異不顯著(下同)

2.3.2 ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性

如圖3所示，富硒牡蠣肽表現(xiàn)出良好的ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性(EC50:1.074 mg/mL)，且在極低質(zhì)量濃度(0.1 mg/mL)時(shí)也顯示出ABTS陽(yáng)離子自由基清除作用，具有顯著的劑量效應(yīng)。富硒牡蠣肽清除ABTS陽(yáng)離子自由基的能力優(yōu)于近江牡蠣多肽OP[21](EC50:6.77 mg/mL)。此外，富硒牡蠣肽清除ABTS陽(yáng)離子自由基的EC50值低于清除DPPH自由基的EC50值，說(shuō)明富硒牡蠣肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基更敏感，能夠通過(guò)斷鏈反應(yīng)防止脂質(zhì)氧化[13]。

圖3 富硒牡蠣肽對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性的影響Fig.3 Effect of selenium-enriched oyster peptides on ABTS cation radical scavenging activity

2.3.3 細(xì)胞抗氧化能力測(cè)定

富硒牡蠣肽對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖4-a，在0.5～500 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)富硒牡蠣肽對(duì)HepG2細(xì)胞無(wú)毒性作用。因此，選擇質(zhì)量濃度小于500 μg/mL的富硒牡蠣肽進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。由圖4-b可知，即使在極低的質(zhì)量濃度(0.5 μg/mL)下，富硒牡蠣肽也能發(fā)揮細(xì)胞抗氧化作用，并且隨著濃度的增加，CAA值不斷增加，呈現(xiàn)出極低的EC50值(1.114 μg/mL)，顯著低于兜唇石斛多肽DA-P[EC50=(2.88±0.14) mg/mL][22]，這進(jìn)一步表明富硒牡蠣肽是極好的天然抗氧化劑來(lái)源。此外，細(xì)胞抗氧化結(jié)果與DPPH自由基、ABTS陽(yáng)離子自由基清除活性結(jié)果高度一致，均表現(xiàn)出抗氧化劑濃度依賴性，證明了富硒牡蠣肽是一種穩(wěn)定高效的抗氧化劑。

a-不同濃度富硒牡蠣肽作用;b-細(xì)胞抗氧化活性圖4 富硒牡蠣肽對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響及其 細(xì)胞抗氧化活性Fig.4 Effects of selenium-enriched oyster peptides on the viability of HepG2 cells and its cellular antioxidant activity

2.3.4 對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用

如圖5-a所示，隨著AAPH作用濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低，當(dāng)用0.5 mmol/L濃度的AAPH處理細(xì)胞24 h，細(xì)胞增殖活力降至(75.72±1.12)%，與空白對(duì)照組相比具有顯著差異(P<0.05)，細(xì)胞處于適度損傷狀態(tài)(部分損傷，但未被完全殺死，有損傷修復(fù)的可能性)。因此，選擇0.5 mmol/L濃度的AAPH作用HepG2細(xì)胞24 h，建立AAPH誘導(dǎo)損傷HepG2細(xì)胞模型。

不同濃度的富硒牡蠣肽對(duì)HepG2細(xì)胞損傷保護(hù)的結(jié)果如圖5-b所示，當(dāng)用不同濃度的富硒牡蠣肽預(yù)處理細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞存活率隨富硒牡蠣肽的質(zhì)量濃度增加逐漸增加，表明其對(duì)氧化損傷細(xì)胞的保護(hù)作用也越強(qiáng)。當(dāng)富硒牡蠣肽的濃度≥25 μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率顯著高于損傷組(P<0.05)，在100 μg/mL時(shí)細(xì)胞存活率達(dá)到(94.81±1.15)%，幾乎可以恢復(fù)到空白對(duì)照組正常細(xì)胞的水平。結(jié)果表明富硒牡蠣肽對(duì)HepG2細(xì)胞的氧化損傷具有很好的保護(hù)作用，再次證明牡蠣富硒肽具有優(yōu)異的抗氧化活性。

a-不同濃度AAPH處理;b-不同濃度富硒牡蠣肽預(yù)處理圖5 AAPH對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響和富硒牡蠣肽對(duì) HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用Fig.5 Effect of AAPH on the viability of HepG2 cells and protective effects of selenium-enriched oyster peptides on oxidative damage of HepG2 cells

2.4 ACE抑制活性

已有研究表明，天然活性物的抗氧化活性與降血壓活性密切相關(guān)，通?？寡趸钚詮?qiáng)的活性物多數(shù)也具有良好的ACE抑制活性[4-5]。在上述體外化學(xué)抗氧化實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，富硒牡蠣肽表現(xiàn)出非常顯著的抗氧化活性，因此猜測(cè)富硒牡蠣肽具有潛在的ACE抑制活性。由圖6可知，樣品質(zhì)量濃度從0.10 mg/mL增加到8.00 mg/mL，富硒牡蠣肽的ACE抑制活性顯著升高(P<0.05)，其IC50值為2.162 mg/mL。富硒牡蠣肽的ACE抑制活性顯著高于富硒堿溶性茶蛋白酶解肽(IC50=17.07 mg/mL)[23]和蛋黃蛋白酶解物超濾組分EYUF-2[24](≤2 kDa, IC50=5.44 mg/mL)，這進(jìn)一步確認(rèn)了本研究的猜測(cè)，也與文獻(xiàn)已報(bào)道的情況相符。本研究表明，富硒牡蠣肽具有良好的ACE抑制活性，具有開(kāi)發(fā)作為降血壓類藥物的潛力。

本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明相比于普通蛋白肽，富硒牡蠣肽具有更好的自由基清除能力和細(xì)胞抗氧化活性，并對(duì)氧化損傷細(xì)胞具有較強(qiáng)的保護(hù)作用，可作為一種穩(wěn)定有效的抗氧化劑使用。此外，富硒牡蠣肽表現(xiàn)出良好的ACE抑制活性。分析原因可能是：一方面，海洋來(lái)源的牡蠣生物活性肽本身具有優(yōu)異的抗氧化和降血壓效果；另一方面，富硒肽的活性優(yōu)于普通蛋白肽，有機(jī)硒對(duì)多肽的生物活性具有協(xié)同作用[9]。

圖6 富硒牡蠣肽對(duì)ACE抑制活性的影響Fig.6 Effect of selenium-enriched oyster peptides on ACE inhibitory activity

3 結(jié)論

本研究通過(guò)響應(yīng)面方法優(yōu)化了富硒牡蠣肽的酶解制備工藝，得到最佳酶解條件為時(shí)間4 h、溫度37 ℃、酶底比0.5%、pH 1.0、底物質(zhì)量濃度7 g/100mL。氨基酸組成分析表明富硒牡蠣肽富含與抗氧化和ACE抑制活性相關(guān)的氨基酸。此外，酶解工藝優(yōu)化過(guò)程中硒的富集也可能是富硒牡蠣肽具有較好的抗氧化和ACE抑制活性的原因。從DPPH自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力，細(xì)胞抗氧化活性和細(xì)胞損傷保護(hù)方面對(duì)富硒牡蠣肽的抗氧化能力進(jìn)行較全面的評(píng)價(jià)，并對(duì)富硒牡蠣肽的ACE抑制活性進(jìn)行了探究，結(jié)果揭示了富硒牡蠣肽的抗氧化和ACE抑制效果與其濃度呈正相關(guān)，明確了富硒牡蠣肽具有較好的抗氧化和ACE抑制活性。本研究首次利用富硒牡蠣開(kāi)發(fā)同時(shí)具有抗氧化和ACE抑制活性的富硒肽，后續(xù)將對(duì)富硒牡蠣肽進(jìn)行純化鑒定、體內(nèi)外活性評(píng)價(jià)、構(gòu)效關(guān)系研究等，以明確其確切作用機(jī)制。