駝乳源乳鐵蛋白嵌合肽對(duì)口腔致齲菌抗菌作用的初步探究

李夢(mèng)雨，伊麗，吉日木圖

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010000)

齲齒是世界上最常見(jiàn)的慢性口腔疾病之一?？谇患?xì)菌可附著于牙齒表面形成牙菌斑生物膜，同時(shí)其產(chǎn)生的酸性物質(zhì)能夠腐蝕牙齒礦物質(zhì)，最終形成齲齒[1]。齲齒常發(fā)病于兒童期，由此引發(fā)牙疼影響進(jìn)食，出現(xiàn)機(jī)體營(yíng)養(yǎng)不良的現(xiàn)象，阻礙兒童的正常發(fā)育。所以控制細(xì)菌生物膜保護(hù)口腔牙齒礦物質(zhì)對(duì)于預(yù)防口腔齲齒至關(guān)重要。然而近些年在臨床治療過(guò)程中傳統(tǒng)抗生素的過(guò)度使用和濫用，不僅改變口腔和腸道菌群，口腔環(huán)境也極易發(fā)生波動(dòng)，使抗生素的抑菌作用顯著降低。因此尋找一種對(duì)齲齒起預(yù)防及治療作用且安全持續(xù)有效的新型抗菌劑，是保護(hù)口腔健康的關(guān)鍵之一。

抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)，因具有天然來(lái)源、快速殺菌、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)受到了廣泛關(guān)注。大部分抗菌肽是陽(yáng)離子抗菌肽，具有兩親性，一般由12～50個(gè)氨基酸短鏈構(gòu)成。常見(jiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括α-螺旋、β-折疊、環(huán)(β-發(fā)夾)和延伸結(jié)構(gòu)。通?？咕脑谒芤褐谐尸F(xiàn)非結(jié)構(gòu)狀態(tài)，在與膜脂雙層相互作用時(shí)表現(xiàn)出最終構(gòu)型?？咕目梢云茐募?xì)胞膜、穿過(guò)細(xì)胞與核酸結(jié)合、抑制蛋白質(zhì)合成并阻止細(xì)胞壁的合成發(fā)揮殺菌作用[2]。已有研究表明抗菌肽可以靶向殺死病原細(xì)菌，保護(hù)口腔健康微生物群落[3]。TAO等[4]發(fā)現(xiàn)口腔中的天然抗菌肽如防御素、導(dǎo)管素、組蛋白等，具有保護(hù)牙齒和口腔黏膜的作用。MAI等[5]報(bào)道抗菌肽對(duì)變異鏈球菌等口腔病原體和生物膜具有抗菌活性。然而，由于抗菌肽的半衰期較短且在體內(nèi)的穩(wěn)定性較低，大大限制了抗菌肽的應(yīng)用。研究人員正在開(kāi)發(fā)具有良好穩(wěn)定性和低細(xì)胞毒性的抗菌肽。合成抗菌肽可以安全有效地維持口腔穩(wěn)態(tài)保護(hù)機(jī)體健康，因此合成抗菌肽作為一種新型抗菌療法具有極大的潛力。

乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)，作為一種轉(zhuǎn)鐵蛋白，具有抗菌、抗病毒等特性，不僅構(gòu)成宿主非特異性免疫系統(tǒng)，也是口腔唾液防御體系中的重要組成部分。LF在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶消化得到lactoferricin(LFcin)，在蛋白水解條件下得到lactoferrampin(LFampin)。LFcin具有以β-折疊為主的兩親性結(jié)構(gòu)，更易黏附于帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜，且LFampin的氨基端存在螺旋帽結(jié)構(gòu)，能夠增加α-螺旋穩(wěn)定性。因此與LF相比，LFcin和LFampin抗菌效果更強(qiáng)[6]。研究表明，在牙科領(lǐng)域，帶正電的乳鐵蛋白與革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂多糖結(jié)合導(dǎo)致變異鏈球菌等口腔細(xì)菌在牙齒表面的黏附功能障礙[7]。駝乳作為一種功能性乳品，具有低膽固醇、低糖，礦物質(zhì)和脂肪酸種類及含量豐富且維生素C含量高等特點(diǎn)。駝乳中LF的含量為200～1 000 mg/L。與除人乳以外的其他動(dòng)物乳相比，駝乳中乳鐵蛋白的含量明顯偏高，是牛乳的2.4倍、山羊乳的2.2倍[8]。

目前，國(guó)內(nèi)主要通過(guò)提取純化獲取駝乳源生物活性肽并分析其營(yíng)養(yǎng)特性和功能特性，在人工合成駝乳生物活性肽方面尚處于空白階段。此外，天然駝乳源乳鐵蛋白活性肽來(lái)源困難，成本昂貴，而LFcin和LFampin抗菌效果更強(qiáng)。因此，本研究通過(guò)化學(xué)合成駝乳源LFA-LFC嵌合肽，并探究其對(duì)3種主要致齲菌[變異鏈球菌(Streptococcusmutans)、唾液鏈球菌(Streptococcussalivarius)、遠(yuǎn)緣鏈球菌(Streptococcussobrinus)]的抗菌能力及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳源LFA-LFC嵌合肽(純度≥98%)，上海楚肽生物科技有限公司采用化學(xué)固相合成法合成；S.mutansATCC 2517、S.salivariusATCC 13419、S.sobrinusATCC 33478，廣東省科學(xué)院微生物研究所；胰蛋白胨大豆肉湯(瓊脂)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(瓊脂)、腦心浸液肉湯(瓊脂)，青島海博生物有限公司；PBS緩沖溶液、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)，北京索萊寶科技有限公司；氯己定，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)，北京天根生化科技有限公司；所有無(wú)機(jī)溶劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

博迅凈化工作臺(tái)，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SQ810C蒸汽滅菌器，日本YAMATO公司；恒溫振蕩器、隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FE28臺(tái)式酸度計(jì)，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易有限公司；Synergy H1酶標(biāo)儀、Gel-Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Biotek公司；5810 R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；小型水平電泳槽，美國(guó)BIO-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 駝乳源LFA-LFC嵌合肽的合成及理化性質(zhì)

本研究委托上海楚肽生物科技有限公司采用化學(xué)固相合成法，通過(guò)嵌入一個(gè)帶正電荷的賴氨酸連接乳鐵蛋白第265～284位氨基酸(LFampin)和17～30位氨基酸(LFcin)合成駝乳源LFA-LFC嵌合肽，純度≥98%。通過(guò)PreCHemPeptide軟件對(duì)駝乳源LFA-LFC嵌合肽進(jìn)行分子特性的預(yù)測(cè)。使用質(zhì)譜儀、高效液相色譜以及圓二色譜(circular dichroism, CD)法進(jìn)行鑒定分析。

1.3.2 駝乳源LFA-LFC嵌合肽抗菌特性的測(cè)定

1.3.2.1 駝乳源LFA-LFC嵌合肽最低抑菌濃度、最低殺菌濃度的測(cè)定

按照美國(guó)試驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)微量肉湯稀釋法測(cè)定駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivarius和S.sobrinus3株菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)。最低抑菌濃度是指肉眼觀察沒(méi)有細(xì)菌生長(zhǎng)和OD600值無(wú)變化狀態(tài)時(shí)嵌合肽的濃度，最低殺菌濃度是指99.9%的細(xì)菌被抑制時(shí)的嵌合肽濃度。

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。將嵌合肽濃度進(jìn)行二倍梯度稀釋為2、4、8、16、32、64、128、256、512 μmol/L。試驗(yàn)組每孔加入嵌合肽100 μL和菌懸液10 μL混合；陰性組為培養(yǎng)基100 μL和菌懸液10 μL混合；陽(yáng)性組為0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯己定100 μL和菌懸液10 μL混合；空白對(duì)照組為培養(yǎng)基100 μL和無(wú)菌水10 μL混合。將96孔板置于振蕩培養(yǎng)箱，37 ℃，50 r/min，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后使用酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)定混合液光密度值(OD600)。

以嵌合肽最低抑菌濃度為依據(jù)，配制1～8倍的MIC嵌合肽濃度，與稀釋至2×106CFU/mL的細(xì)菌菌懸液在37 ℃，50 r/min條件下共培養(yǎng)24 h。每孔取10 μL混合液涂布于瓊脂平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，培養(yǎng)24 h。

1.3.2.2 不同pH培養(yǎng)基對(duì)駝乳源LFA-LFC嵌合肽抗菌效果的影響

參考杜鵑[9]的研究方法，使用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH值分別為6.3、6.6、6.8、7.0、7.3、8.3 6個(gè)梯度。參照1.3.2.1測(cè)定MIC。

1.3.2.3 菌體時(shí)間-致死曲線的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。根據(jù)1.3.2.1試驗(yàn)結(jié)果，選擇嵌合肽濃度為MIC、2×MIC。試驗(yàn)組加入菌懸液與嵌合肽1∶1比例混合，陰性對(duì)照組加入菌懸液與無(wú)菌水混合。分別在0、1、2、5、15、30、60、120、240 min時(shí)移取菌懸液于0.85%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))無(wú)菌生理鹽水中，稀釋104倍，振蕩混勻后立即置于冰面，使菌體停止生長(zhǎng)。之后取100 μL細(xì)菌稀釋液涂布平板，并標(biāo)注日期、菌種，放進(jìn)恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)算菌落數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌落數(shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制時(shí)間-致死曲線。

1.3.3 駝乳源LFA-LFC嵌合肽殺菌作用機(jī)制的研究

1.3.3.1 預(yù)防菌體生物膜生成試驗(yàn)

采用結(jié)晶紫染色法測(cè)定生物膜。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。二倍梯度稀釋嵌合肽濃度為2、4、8、16、32、64、128 μmol/L。將菌懸液與不同濃度嵌合肽按照10∶1的比例混合于96孔板中，陰性對(duì)照組加入培養(yǎng)基與菌懸液混合，空白對(duì)照組加入無(wú)菌水和培養(yǎng)基混合。吹打混勻后，標(biāo)注日期、菌種，置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束，輕輕吸去培養(yǎng)基上清液，每孔加入200 μL無(wú)菌0.85%生理鹽水，溫和沖洗3次，室溫晾干后加入200 μL 10%(體積分?jǐn)?shù))甲醇固定10 min，使附著的生物膜更牢固。吸去甲醇，加入100 μL 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))結(jié)晶紫，進(jìn)行30 min染色，然后吸去結(jié)晶紫染色液，使用0.85%無(wú)菌生理鹽水溫和沖洗3次，室溫晾干。最后每孔加入150 μL 33%(體積分?jǐn)?shù))乙酸，反應(yīng)10 min以溶解生物膜。將孔內(nèi)溶液移至新的96孔酶標(biāo)板中測(cè)定OD600值。生物膜形成量的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.3.2 消除菌體生物膜生成試驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。二倍梯度稀釋嵌合肽濃度至8、16、32、64、128、256、512 μmol/L。使用96孔酶標(biāo)板，試驗(yàn)組、陰性組每孔加入200 μL菌懸液，空白組加入200 μL培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃，培養(yǎng)24 h，使菌體形成生物膜。培養(yǎng)結(jié)束后，輕輕吸去96孔板中的懸濁液，加入不同濃度嵌合肽100 μL，陰性組和空白對(duì)照組分別加入培養(yǎng)基和無(wú)菌水代替嵌合肽。37 ℃，過(guò)夜培養(yǎng)。參照1.3.3.1測(cè)定生物膜剩余量。

1.3.3.3 透射電子顯微鏡觀察

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。加入128 μmol/L駝乳源LFA-LFC嵌合肽和菌懸液以1∶1的比例混勻，陰性對(duì)照組加入無(wú)菌水和菌懸液混合。37 ℃，過(guò)夜培養(yǎng)。然后在4 500 r/min的條件下，離心5 min。棄掉上清液，加入PBS溶液清洗沉淀物，再次離心。重復(fù)沖洗過(guò)程2次后，加入2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛固定液后，至4 ℃冰箱固定12 h以上。將樣品送至邁斯普生物科技有限公司使用JEM1230型透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

1.3.3.4 激光共聚焦電子顯微鏡觀察

使用異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer, FITC)作為熒光探針標(biāo)記駝乳源LFA-LFC嵌合肽(FITC-嵌合肽)委托上海楚肽生物科技有限公司合成。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。將無(wú)菌PBS溶液與菌懸液以1∶1的比例混勻，在1 000 r/min，4 ℃條件下，離心30 s，棄掉上清液后，重懸于無(wú)菌PBS溶液中。使用Hoechst 33258(10 μg/mL，30 min)和尼羅紅(1 μmol/L，30 min)染料連續(xù)染色細(xì)菌細(xì)胞。沖洗后加入128 μmol/L FITC-嵌合肽作用30 min。然后加入100 μL 2.5%戊二醛，固定20 min。再次輕輕沖洗樣品，并將細(xì)菌沉淀物重懸于無(wú)菌PBS溶液中。取樣品置于蓋玻片，通過(guò)激光共聚焦電子顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)觀察。

1.3.3.5 菌體DNA電泳遷移率的測(cè)定

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌懸液用培養(yǎng)基稀釋至2×106CFU/mL。使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌體DNA，通過(guò)微量分光光度計(jì)測(cè)定DNA純度和濃度，凍存于-20 ℃冰箱備用。二倍梯度稀釋嵌合肽濃度為2、4、8、16、32、64、128 μmol/L。將不同濃度的嵌合肽和菌體DNA以1∶4的比例混勻，陰性對(duì)照組加入無(wú)菌水和菌體DNA。37 ℃，孵育5 min后，加入2 μL 6×loading buffer染料，然后在120 V，30 min條件下，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束后，利用UV凝膠成像系統(tǒng)觀察菌體DNA遷移率，分析其在凝膠中的阻滯情況。

1.3.4 駝乳源LFA-LFC嵌合肽溶血性的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]對(duì)駝乳源LFA-LFC嵌合肽溶血性進(jìn)行測(cè)定。取適量無(wú)菌綿羊血于無(wú)菌離心管中，在4 ℃、4 000 r/min的條件下，離心10 min。棄掉上清液，將綿羊血紅細(xì)胞沉淀與無(wú)菌PBS溶液以1∶1比例混勻，在4 ℃、4 000 r/min條件下，離心10 min。重復(fù)沖洗過(guò)程4次后，紅細(xì)胞于4 ℃冰箱低溫貯存?zhèn)溆谩?/p>

將嵌合肽與綿羊血紅細(xì)胞以9∶1的比例混勻，陽(yáng)性組加入SDS溶液和綿羊血紅細(xì)胞混勻，空白組加入PBS溶液和綿羊血紅細(xì)胞混勻。分別置于恒溫培養(yǎng)箱，在37 ℃條件下，反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，在4 ℃、4 000 r/min條件下，離心10 min。取上清液100 μL加入96孔酶標(biāo)板中，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定OD540值。溶血率的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究中所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistic 26軟件和Microsoft Office Excel 2020軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行表示，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 駝乳源LFA-LFC嵌合肽的合成及理化性質(zhì)

本研究采用高效液相色譜鑒定嵌合肽純度達(dá)到98%以上。通過(guò)質(zhì)譜儀和軟件分析對(duì)嵌合肽的分子特性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，駝乳源LFA-LFC嵌合肽分子質(zhì)量為4 357.26 g/mol，等電點(diǎn)為11.60，凈電荷值為10.9，親水殘基比達(dá)到25%。研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽主要通過(guò)自身所帶正電荷與細(xì)菌細(xì)胞膜所帶負(fù)電荷區(qū)域發(fā)生靜電作用，進(jìn)而發(fā)揮抑菌效果[11]。由此可以看出抗菌肽的凈電荷值與疏水性影響其抗菌特性。嵌合肽的凈電荷值與親水殘基比越高，其抗菌性能越強(qiáng)。天然陽(yáng)離子抗菌肽所帶正電荷數(shù)一般為2～9個(gè)[1]。梁東升等[12]設(shè)計(jì)篩選得到的抗變異鏈球菌多肽AT-7凈電荷值為5，已經(jīng)具有良好的抗菌效果。與之相比，駝乳源LFA-LFC嵌合肽所帶正電荷更多。

抗菌肽中存在不同的二級(jí)構(gòu)象，影響抗菌肽的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響其功能穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步探究駝乳源LFA-LFC嵌合肽的功能特性，本研究通過(guò)CD測(cè)定其二級(jí)結(jié)構(gòu)，分別包含：12.38%的α-螺旋結(jié)構(gòu)、40.66%的β-折疊結(jié)構(gòu)、15.24%的β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和31.65%的無(wú)規(guī)則卷曲。其中α-螺旋和β-折疊占比達(dá)到50%以上。與TU等[13]對(duì)合成肽GH12進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)的鑒定結(jié)果相似。鑒于上述研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)駝乳源LFA-LFC嵌合肽具有一定的抗菌特性潛能，具備進(jìn)一步探究的價(jià)值。

2.2 駝乳源LFA-LFC嵌合肽的合成及理化性質(zhì)

2.2.1 駝乳源LFA-LFC嵌合肽MIC、MBC的測(cè)定

MIC試驗(yàn)結(jié)果顯示嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivariu的抑菌效果更強(qiáng)，MIC值達(dá)到32 μmol/L，比S.sobrinus的MIC值低2倍。MBC試驗(yàn)結(jié)果與上述結(jié)果一致，S.mutans、S.salivariu的MBC值較小，均為128 μmol/L，而S.sobrinus的MBC值達(dá)到256 μmol/L(表1)。由此可知，該嵌合肽對(duì)3株致病菌均表現(xiàn)出抑菌活性。

鐘亨任[14]研究表明抗菌肽GHc和GHd對(duì)變異鏈球菌的MIC值分別為12.6、13.1 μmol/L。其MIC值較低可能與抗菌肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)，α-螺旋含量較高，可以更有效地發(fā)揮抗菌作用。而何佳寧等[15]合成得到的短鏈抗菌肽KR-1對(duì)S.sobrinus菌的MIC值為51.2 μmol/L，與本研究中嵌合肽的抗菌效果相似。

表1 駝乳源LFA-LFC嵌合肽MIC、MBC的測(cè)定Table 1 Determination of the LFA-LFC chimeric peptide MIC、MBC

2.2.2 不同pH培養(yǎng)基對(duì)駝乳源LFA-LFC嵌合肽抗菌效果的影響

口腔是復(fù)雜的動(dòng)態(tài)環(huán)境，正常生理?xiàng)l件下口腔唾液的pH值維持在6.6～7.1[16]。因此本研究以口腔環(huán)境酸堿度為依據(jù)，測(cè)定不同pH培養(yǎng)環(huán)境下嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivariu、S.sobrinusMIC值的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同pH值對(duì)嵌合肽的MIC值有較為顯著的影響(表2)。pH值為6.3～7.1時(shí)，各細(xì)菌的MIC值沒(méi)有發(fā)生變化，均為64 μmol/L。隨著pH值增大，嵌合肽對(duì)3株菌均呈現(xiàn)出更強(qiáng)的抗菌效果。當(dāng)pH值降低為8.3時(shí)，3株菌的MIC值全部縮小4倍。這一結(jié)果符合鏈球菌產(chǎn)酸耐酸的生理特性。同時(shí)說(shuō)明堿性環(huán)境更有利于嵌合肽發(fā)揮對(duì)口腔致齲菌的抑制作用。杜鵑[9]研究結(jié)果表明，pH上升有利于抗菌肽抗菌活性的增強(qiáng)，與本研究結(jié)果一致。營(yíng)秀[17]研究唾液對(duì)抗菌肽pm11抗菌作用的影響，發(fā)現(xiàn)pm11溶解在唾液或超純水中抑菌效果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)差異。而駝乳源LFA-LFC嵌合肽在pH值6.3～7.1時(shí)，MIC值無(wú)變化。當(dāng)pH值達(dá)到7.3及以上，其抑菌效果增強(qiáng)。這可能是相較于培養(yǎng)基，口腔環(huán)境中唾液成分更復(fù)雜，對(duì)抗菌肽的抑菌效果產(chǎn)生干擾。

表2 不同pH值駝乳源LFA-LFC嵌合肽MIC的測(cè)定Table 2 Determination of the LFA-LFC chimeric peptide MIC at different pH

2.2.3 菌體時(shí)間-致死曲線的測(cè)定

駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivariu和S.sobrinus3株菌均表現(xiàn)出顯著的殺菌效果(圖1)。縱向比較嵌合肽濃度對(duì)3株菌的抑菌效果，可以發(fā)現(xiàn)1×MIC濃度嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivariu和S.sobrinus在30 min時(shí)，菌體全部到達(dá)致死狀態(tài)。而2×MIC濃度嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivariu和S.sobrinus分別為5、2、15 min時(shí)，菌體已經(jīng)到達(dá)完全致死狀態(tài)。嵌合肽濃度越高，其對(duì)細(xì)菌的抑制作用越明顯。橫向比較嵌合肽對(duì)3株菌的抑菌效果亦存在強(qiáng)弱差，其中嵌合肽對(duì)S.salivariu的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)S.sobrinus的抑制作用最弱。該結(jié)果與2.2.1對(duì)嵌合肽的MIC、MBC的測(cè)定結(jié)果一致。

魏詩(shī)[18]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽濃度對(duì)S.mutans殺菌時(shí)間及程度呈濃度依賴現(xiàn)象。同時(shí)TU等[13]研究結(jié)果表明2×MIC抗菌肽GH12在60 min內(nèi)將S.mutans全部殺死，4×MIC只需要20 min即可使S.mutans致死。這與本研究結(jié)果一致，高濃度駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)細(xì)菌的抑制效果更迅速。

a-S.mutans;b-S.salivariu;c-S.sobrinus圖1 時(shí)間-致死曲線Fig.1 Time-Killing curves

2.3 駝乳源LFA-LFC嵌合肽殺菌作用機(jī)制的研究

2.3.1 預(yù)防菌體生物膜生成試驗(yàn)

人體口腔內(nèi)的病原菌可在口腔內(nèi)形成生物膜使病原微生物在牙齒表面附著，且生物膜的酸化現(xiàn)象可導(dǎo)致牙齒脫礦，加速口腔疾病的發(fā)展。因此破壞口腔內(nèi)生物膜的生成是預(yù)防齲齒的重要環(huán)節(jié)。本研究將嵌合肽與口腔致齲菌共培養(yǎng)探究嵌合肽對(duì)口腔內(nèi)生物膜形成的影響。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)嵌合肽濃度達(dá)到16 μmol/L時(shí)，生物膜生成量開(kāi)始有所減少。在嵌合肽濃度達(dá)到128 μmol/L時(shí)，S.mutans、S.salivariu的生物膜生成量減少約80%，幾乎被完全抑制；雖然嵌合肽對(duì)預(yù)防S.sobrinus生物膜生成作用較弱，但減少量也較為顯著，達(dá)到70%以上(圖2)。由此可知，高濃度嵌合肽有效預(yù)防生物膜的生成。這是由于嵌合肽帶正電荷，與革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞表面帶負(fù)電荷的磷壁酸發(fā)生靜電作用，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。進(jìn)一步損害生物膜的完整性，破壞細(xì)菌的生存環(huán)境。

a-S.mutans;b-S.salivariu;c-S.sobrinus圖2 預(yù)防變異鏈球菌、唾液鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌生物膜的形成Fig.2 Inhibition of biofilm formation of S.mutans, S.salivariu, and S.sobrinus

ZHANG等[19]通過(guò)掃描電子顯微鏡觀察牙釉質(zhì)表面生物膜的生成發(fā)現(xiàn)，抗菌肽DPS-PI處理后的切片表面菌體稀疏分布，表明DPS-PI可以有效抑制牙釉質(zhì)生物膜的形成。李欣蔚等[20]研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽GH12對(duì)口腔致齲菌生物膜同樣表現(xiàn)出一定的損傷作用。這與本研究的試驗(yàn)結(jié)果一致，證明駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)預(yù)防生物膜生成發(fā)揮較為顯著的作用，具備維護(hù)口腔健康的潛能。

2.3.2 消除菌體生物膜試驗(yàn)

駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)口腔致齲菌已形成的生物膜表現(xiàn)出一定的消除作用(圖3)。隨著嵌合肽濃度增大，生物膜剩余量逐漸減少。當(dāng)嵌合肽濃度達(dá)到512 μmol/L時(shí)，嵌合肽對(duì)S.mutans、S.salivariu已形成的生物膜消除率可達(dá)到約50%，對(duì)S.sobrinus已形成的生物膜消除率可達(dá)到約40%。本研究結(jié)果雖然表明嵌合肽可以減緩已形成的生物膜發(fā)展，但是消除效果并不理想。

LEIVA-SABADINI等[21]研究發(fā)現(xiàn)從蜂蜜中獲得的抗菌肽Hec-Evs盡管對(duì)變異鏈球菌生物膜表現(xiàn)出一定程度的抑制，但仍然可以黏附在表面并建立暴露于較低濃度抗菌肽時(shí)的早期生物膜。而賈麗麗[22]的研究也表明抗菌肽對(duì)生物膜的消除作用較弱，需要機(jī)械作用輔助進(jìn)行清理。因此我們推測(cè)這可能與嵌合肽的抗菌機(jī)制有關(guān)。針對(duì)已形成的生物膜，需要尋找另外一種高效率的方法代替。

a-S.mutans;b-S.salivariu;c-S.sobrinus圖3 消除生物膜試驗(yàn)Fig.3 Eradication of preformed biofilm

2.3.3 TEM觀察

通過(guò)TEM觀察駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)不同菌體的作用效果(圖4)。未經(jīng)嵌合肽處理的細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞膜清晰可見(jiàn)，尤其是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的電子密度致密均勻。與之相比，經(jīng)128 μmol/L嵌合肽處理后，3株細(xì)菌的細(xì)胞均呈現(xiàn)不同程度的結(jié)構(gòu)變化。S.mutans細(xì)胞膜已經(jīng)完全溶解，細(xì)胞內(nèi)部開(kāi)始出現(xiàn)孔洞。S.salivariu細(xì)胞膜明顯出現(xiàn)泡沫狀裂解，細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的電子密度減小且不均勻。S.sobrinus細(xì)胞膜喪失完整性，出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物大量泄漏。TEM結(jié)果表明駝乳源LFA-LFC嵌合肽可能通過(guò)作用于細(xì)胞膜發(fā)揮抑菌或殺菌的作用。這與耿紅娟[23]探究雙功能嵌合肽(TBP-1-GGG-hBD3-3)對(duì)口腔鏈球菌抗菌機(jī)制的研究結(jié)果一致。

a-S.mutans;b-S.salivariu;c-S.sobrinus圖4 菌體TEM圖像Fig.4 TEM images of bacterial cells

2.3.4 CLSM觀察

Hoechst 33258和尼羅紅在熒光染色過(guò)程中，Hoechst 33258可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與DNA結(jié)合，在CLSM下觀察可看到藍(lán)色熒光；尼羅紅作為一種親脂性染料，可以與細(xì)胞膜中的脂質(zhì)成分結(jié)合，在CLSM下觀察可看到紅色熒光；FITC是生物學(xué)應(yīng)用廣泛的綠色熒光素衍生物，常用作蛋白標(biāo)記。FITC-嵌合肽在CLSM下觀察可看到綠色熒光。通過(guò)CLSM成像進(jìn)一步定位駝乳源LFA-LFC嵌合肽在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的位置(圖5)?？梢钥吹?，未經(jīng)處理的細(xì)菌細(xì)胞周圍被帶有紅色熒光的細(xì)胞膜完整環(huán)繞，細(xì)胞內(nèi)部存在大量帶有藍(lán)色熒光的核酸物質(zhì)。經(jīng)128 μmol/L FITC-嵌合肽處理后，細(xì)胞膜被破壞，紅色熒光逐漸消失，大部分綠色熒光在細(xì)胞質(zhì)中累積，而藍(lán)色熒光減少。CLSM結(jié)果表明駝乳源LFA-LFC嵌合肽可以穿過(guò)細(xì)胞膜障礙并滲透到細(xì)胞內(nèi)部。

WANG等[24]使用FITC作為熒光探針標(biāo)記抗菌肽F1(綠色)，F(xiàn)M-4-64(紅色)標(biāo)記細(xì)胞膜，并使用CLSM觀察FITC-F1在細(xì)胞中的位置變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FITC-F1滲入細(xì)胞，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)在細(xì)胞質(zhì)中累積，最終細(xì)胞膜消失，F(xiàn)ITC-F1覆蓋全部細(xì)胞質(zhì)。這與本研究結(jié)果一致。

a-S.mutans;b-S.salivariu;c-S.sobrinus圖5 菌體CLSM圖像Fig.5 CLSM images of bacterial cells

2.3.5 菌體DNA電泳遷移率的測(cè)定

由圖6可知，在嵌合肽的作用下DNA發(fā)生不同程度的遷移。當(dāng)嵌合肽濃度分別在0～8、0～8、0～16 μmol/L時(shí)，S.mutans、S.salivariu和S.sobrinus菌體DNA遷移幾乎沒(méi)有受到阻滯，在泳道中出現(xiàn)明亮條帶。S.mutans和S.salivariu菌體DNA在嵌合肽濃度達(dá)到16 μmol/L時(shí)，遷移逐漸受到阻滯；在32 μmol/L嵌合肽濃度時(shí)，S.sobrinus菌體DNA遷移開(kāi)始受到阻滯，部分DNA阻滯在凝膠孔中，泳道條帶亮度減弱。在64 μmol/L時(shí)，S.salivariu菌體DNA被全部阻滯在凝膠孔中，未在泳道中發(fā)現(xiàn)遷移條帶；而S.mutans和S.sobrinus菌體DNA在128 μmol/L嵌合肽濃度時(shí)被全部阻滯。已有文獻(xiàn)報(bào)道，菌體DNA是大多數(shù)陽(yáng)離子抗菌肽的理想結(jié)合位點(diǎn)[25]。這主要是由于DNA帶負(fù)電，陽(yáng)離子抗菌肽與DNA結(jié)合，使DNA受到損傷。DNA作為生命活動(dòng)重要的遺傳物質(zhì)，其完整性是生命發(fā)育和運(yùn)轉(zhuǎn)的必要條件。由此可知，駝乳源LFA-LFC嵌合肽作用于細(xì)菌DNA，使之在遷移過(guò)程中出現(xiàn)阻滯現(xiàn)象，抑制DNA遺傳復(fù)制，影響細(xì)菌正常的生長(zhǎng)繁殖。

杜鵑[9]研究表明高濃度抗菌肽P26才能與細(xì)菌DNA完全結(jié)合，發(fā)揮抑制生長(zhǎng)的作用。這也能證明駝乳源LFA-LFC嵌合肽可以通過(guò)進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部與DNA結(jié)合發(fā)揮良好的抑菌作用。

泳道1～8分別為嵌合肽濃度0、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L的試驗(yàn)組 a-S.mutans;b-S.salivariu;c-S.sobrinus圖6 菌體DNA電泳遷移率Fig.6 Electrophoretic mobility of bacterial DNA

2.4 駝乳源LFA-LFC嵌合肽溶血性的測(cè)定

本研究通過(guò)測(cè)定綿羊血紅細(xì)胞溶血率評(píng)估駝乳源LFA-LFC嵌合肽對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的損傷性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，嵌合肽濃度對(duì)溶血率存在一定影響(圖7)。當(dāng)嵌合肽濃度達(dá)到32 μmol/L時(shí)，作用3 h，嵌合肽的溶血率僅達(dá)到約20%，之后溶血率上升趨勢(shì)減緩。練家惠等[10]通過(guò)改造溶血率較高的天然抗菌肽Temporin-1Dra，得到新的合成肽溶血率在2～4×MIC下仍低于10%，明顯低于駝乳源LFA-LFC嵌合肽。有文獻(xiàn)表示，抗菌肽所帶電荷數(shù)對(duì)其溶血率產(chǎn)生影響，正電荷數(shù)越高，溶血現(xiàn)象越嚴(yán)重[10]。因此我們猜測(cè)駝乳源LFA-LFC嵌合肽溶血率相對(duì)較高可能是因?yàn)槠渌鶐д姾蓴?shù)過(guò)高?？谇粚儆趧?dòng)態(tài)環(huán)境，復(fù)雜多變，目前市面上漱口水作用時(shí)間一般為30 s，由此可以推測(cè)，當(dāng)嵌合肽被應(yīng)用于口腔產(chǎn)品時(shí)，作用時(shí)間減少，溶血率也會(huì)相應(yīng)降低。

圖7 駝乳源LFA-LFC嵌合肽溶血率Fig.7 Hemolysis rate of LFA-LFC chimeric peptide

3 結(jié)論

本研究通過(guò)增加陽(yáng)離子數(shù)，嵌入1個(gè)賴氨酸連接LFampin265-284和駝乳L(zhǎng)Fcin17-30獲得駝乳源LFA-LFC嵌合肽，對(duì)S.mutans、S.salivariu和S.sobrinus具有快速高效的抑制殺滅作用；可以穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與菌體DNA相互作用，破壞細(xì)胞的遺傳物質(zhì)，阻礙細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖。這為優(yōu)化抗菌肽結(jié)構(gòu)，深入探究抗菌肽的作用機(jī)制，維護(hù)人體口腔環(huán)境健康提供新思路。