Caldisericum exile來源新嗜熱脂肪酶的發(fā)現(xiàn)及酶學(xué)特征的研究

劉捷婧，王敏婷，周于婷，陳萍，歐陽永長

(廣州醫(yī)科大學(xué) 生物技術(shù)系，廣東 廣州，511436)

脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)，是一類在親水親脂界面分解和合成甘油三酯的酶，底物一般為長碳鏈(C8以上)的?；视?。這些酶在結(jié)構(gòu)上都有α/β水解酶的折疊形式和保守的GXSXG五肽模體，屬于絲氨酸水解酶類[1]。但在脂肪酶的應(yīng)用中，尤其是工業(yè)生產(chǎn)中，對(duì)酶熱穩(wěn)定性的要求比較高，而天然脂肪酶的熱穩(wěn)定性常常難以滿足生產(chǎn)要求。因此，對(duì)嗜熱脂肪酶新酶的開發(fā)和研究一直是脂肪酶研究的重要方向之一。

嗜熱微生物能夠適應(yīng)極端的生存環(huán)境是其不斷進(jìn)化的結(jié)果，其體內(nèi)有較大可能會(huì)存在與高溫環(huán)境相適應(yīng)的各種酶類[2]。目前已從多種嗜熱環(huán)境微生物的發(fā)酵產(chǎn)物中獲得了不同的嗜熱脂肪酶如Amycolatopsismediterranei[3]、Aneurinibacillusthermoaerophilus[4]、Geobacillusthermoleovorans[5-6]、Bjerkanderaadusta[7]、Lactobacillusplantarum[8]、Staphylococcusaureus[9]、Streptomycesthermocarboxydus[10]、Thermoanaerobacterthermohydrosulfuricus[11]、Thermosyntrophalipolytica[12]。此外，利用宏基因組技術(shù)繞過微生物培養(yǎng)環(huán)節(jié)，直接將環(huán)境樣品中的DNA異源表達(dá)后再篩選產(chǎn)物的方法，同樣從熱泉環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)嗜熱的新脂肪酶[13-14]。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，微生物基因組數(shù)據(jù)和各種環(huán)境的宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)獲得急速增長。這些海量數(shù)據(jù)的絕大部分只有簡(jiǎn)單的注釋，其具體功能特征并不清楚。這意味著上述測(cè)序數(shù)據(jù)里，尤其是來源于新微生物或極端環(huán)境的數(shù)據(jù)中蘊(yùn)含著大量的等待挖掘的新基因和新酶。周艷杰等[15]從嗜熱玫瑰紅球菌ThermomicrobiumroseumDSM 5159的基因組數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)了新嗜熱脂肪酶。有研究從基因數(shù)據(jù)庫中篩選到來源于超嗜熱菌AquiexaeolicusVF5的兩種嗜熱新酯酶Aaeo1和Aaeo2[16]。同時(shí)，ABDELMONAEM等[17]、YADAVA等[18]研究表明脂肪酶在進(jìn)化過程中具有菌屬特征。因此，本文考慮從特殊的嗜熱菌群中通過生物信息學(xué)手段結(jié)合異源表達(dá)技術(shù)來發(fā)現(xiàn)新嗜熱脂肪酶。

CaldisericumexileAZM16c01是熱泉新菌[19]，為厭氧、嗜熱、革蘭氏陰性纖細(xì)熱絲菌。最適生長溫度為65 ℃，最適pH為6.5，對(duì)NaCl非常敏感。其基因組測(cè)序已完成，該文對(duì)其進(jìn)行基因資源篩選分析，發(fā)現(xiàn) BAL81435.1(GenBank ID)為酯酶，經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)，該酯酶具有脂肪酶的特性。據(jù)我們所知，這是首次對(duì)來源于Caldiserica新門的嗜熱脂肪酶特征的描述。該研究為新酶的快速開發(fā)提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

基因序列BAL81435.1由上海生物工程有限公司合成并克隆到pET28(a)載體上(在載體BamHI/XhoI之間插入該基因編碼框，使其表達(dá)的重組蛋白N末端帶有6×His 標(biāo)簽)，獲得pET28a-lipase-BAL質(zhì)粒。DH5α, Rosetta 感受態(tài)細(xì)胞，上海唯地生物有限公司。

1.2 主要試劑

Ni-NTA Sefinose Resin試劑盒、Tube-O-DIALYZER透析柱、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、His單克隆抗體和二抗，上海生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和鑒定

將質(zhì)粒pET28a-lipase-BAL轉(zhuǎn)化入Rosetta細(xì)胞中。向100 mL新鮮LB培養(yǎng)基中加入2 mL過夜培養(yǎng)的陽性克隆菌液，于37 ℃培養(yǎng)2～4 h至OD600值約為0.4～0.6，然后向培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)，繼續(xù)在25 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)12～16 h。離心回收菌體，棄上清液，加入8 mL破碎緩沖液(含有PBS、300 mmol/L NaCl、3% Triton X-100)重懸菌體，超聲破碎，4 ℃12 000 r/min離心15 min保留上清液。上清液經(jīng)Ni-NTA Sefinose離子親和層析純化重組蛋白，操作步驟參照說明書進(jìn)行。250 mmol/L咪唑洗脫得到的重組蛋白經(jīng)Tube-O-DIALYZER透析柱除去咪唑后，用于鑒定和后續(xù)試驗(yàn)。蛋白表達(dá)樣品和純化后蛋白樣品利用SDS-PAGE電泳和Western Blot(一抗為His單抗)進(jìn)行鑒定。

1.3.2 脂肪酶活力測(cè)定

脂肪酶活性測(cè)定采用參考文獻(xiàn)[20]對(duì)硝基苯酚(para-nitrophenol，p-NP)比色法進(jìn)行。其過程簡(jiǎn)述如下：溶液A：稱取適量的底物對(duì)硝基苯磷酸酯(para-nitrophenyl phosphate，p-NPP)溶于30 mL異丙醇中；溶液B：配制適量濃度為100 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH為8.8)。將A和B溶液混勻置于適當(dāng)溫度下反應(yīng)一定時(shí)間，通過測(cè)定OD405值，由p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算p-NP的量，換算成酶活性單位。1U表示在上述條件下，每分鐘催化p-NPP釋放1 μmol/Lp-NP所需的酶量。

1.3.3 溫度對(duì)酶活性的影響

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B充分混勻后，加入0.2 mL酶液，以等體積的滅活的酶液為對(duì)照，在不同溫度下(4、18、25、37、42、50、60、70、75 ℃)反應(yīng)30 min后，測(cè)定OD405值，計(jì)算酶活性。

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B充分混勻后，加入0.2 mL酶液，在不同溫度下(37、42、60、70 ℃)反應(yīng)90 min，并分別在不同時(shí)間段(15、30、45、60、90 min)取樣測(cè)定OD405值，計(jì)算酶活性，以檢測(cè)脂肪酶的溫度耐受性。

1.3.4 pH對(duì)酶活性的影響

取0.1 mL溶液A至3.7 mL pH不同(6.8、8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10.4、10.6)的溶液B中，加入0.2 mL酶液，在最適溫度下反應(yīng)30 min后，測(cè)定OD405值，計(jì)算酶活性。

1.3.5 有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B充分混勻后，分別加入不同濃度(5%、10%)，不同種類(甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙氰、二甲基亞砜)的有機(jī)溶劑，充分混勻，加入0.2 mL酶液，在最適溫度下反應(yīng)30 min測(cè)定其OD405值，計(jì)算酶活性。

1.3.6 表面活性劑、變性劑及金屬離子對(duì)酶活性的影響

將0.1 mL溶液A和3.7 mL溶液B混勻后，加入適量表面活性劑、變性劑或金屬離子，加入0.2 mL酶液，在最適溫度下反應(yīng)30 min測(cè)定其OD405值，計(jì)算酶活性。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

參照J(rèn)O等[5]、ABDELMONAEM等[17]、YADAVA等[18]的研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中，提取代表性lipase脂肪酶序列。首先，利用clustal W程序?qū)Φ玫矫傅鞍仔蛄羞M(jìn)行多序列比對(duì)[21]。然后，利用Mega X程序基于連接法(bootstrap 自檢1 000次)構(gòu)建進(jìn)化樹[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 BAL81435.1序列分析

CaldisericumexileAZM16c01是海洋熱泉來源的厭氧、嗜熱、革蘭氏陰性纖細(xì)熱絲菌，最適生長溫度為65 ℃，其基因組測(cè)序已經(jīng)完成，目前未見與該菌有關(guān)的脂肪酶研究報(bào)道。對(duì)該菌的基因組數(shù)據(jù)(AP012051.1)篩選發(fā)現(xiàn)序列BAL81677和BAL81435.1的功能注釋為酯酶。對(duì)BAL81435.1的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量大小為28 kDa，等電點(diǎn)為6.6，無信號(hào)肽(http://smart.embl.de/)。利用blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，與BAL81435.1序列相似性高的序列分布于多個(gè)種屬，大部分都來源于熱泉環(huán)境。進(jìn)一步選擇與BAL81435.1編碼蛋白Identity>40%的代表性序列進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果如圖1所示。這些酶存在多個(gè)保守區(qū)域，其中催化區(qū)域[Gly-X(1)-Ser-X(2)-Gly-]中絕大多數(shù)的X(1)為Lys，X(2)為Met，并且該模體后都緊鄰接Gly，催化區(qū)域呈現(xiàn)GLSMGG模式。在DEMIRJIAN等[1]、ATALAH等[2]的研究中，分子進(jìn)化分析顯示脂肪酶可以分為六大類。為進(jìn)一步分析BAL81435.1與其他脂肪酶的進(jìn)化關(guān)系，該文選擇了脂肪酶各類代表性序列和酯酶序列，以鄰居連接(neighbor-joining, N-J)方法構(gòu)建了進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示，BAL81435.1及其他Caldiserica來源的序列與其他脂肪酶和酯酶有著不同的進(jìn)化分支。這可能表明BAL81435.1編碼新的嗜熱脂肪酶。為驗(yàn)證這個(gè)猜想，該研究對(duì)該序列的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了研究。

圖1 BAL81435.1編碼蛋白與其同源性較高的蛋白多序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 BAL81435.1encoding protein and its high homology protein multiple sequencecomparison results

圖2 脂肪酶的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of lipase 注：BAL81435.1及其相關(guān)蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析;系統(tǒng)進(jìn)化樹 采用鄰居連接法(MEGAX.0軟件)生成;從GenBank中提取 原細(xì)菌脂解酶的蛋白序列;節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示1 000個(gè)重復(fù)的 bootstrap百分比;■表示該研究選擇的研究對(duì)象

2.2 BAL81435.1基因的表達(dá)純化

將含有BAL81435.1基因序列的pET28a-lipase-BAL質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入Rosetta感受態(tài)細(xì)胞中并利用IPTG誘導(dǎo)其蛋白表達(dá)。在37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)下，重組蛋白絕大部分以包涵體形式存在(結(jié)果未展示)，但降低宿主表達(dá)溫度，在25 ℃誘導(dǎo)下，重組蛋白能以可溶形式存在，結(jié)果如圖3所示。通過菌體破碎，低溫離心，上清液組分經(jīng)過Ni-NTA 柱純化，獲得脂肪酶。由SDS-PAGE結(jié)果可見，純化后的蛋白在25～35 kDa有唯一條帶(圖3)，符合預(yù)期大小。利用His單抗(上海生物工程有限公司)的Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明該重組蛋白帶有His標(biāo)簽(結(jié)果未展示)。以上結(jié)果顯示成功得到了純化的重組蛋白。

2.3 BAL81435.1基因編碼脂肪酶的特征

2.3.1 脂肪酶的催化活性

利用p-NP比色法檢測(cè)pET28a-lipase-BAL表達(dá)并純化的重組蛋白的酯酶活性。該重組蛋白催化p-NPP長鏈底物的活性較高，尤其是C12以上的底物，而對(duì)短鏈底物的催化活性較弱，最適底物為C16的p-NPP，結(jié)果如圖4-a所示。結(jié)果表明該重組脂肪酶為“真正”脂肪酶，而非數(shù)據(jù)庫中注釋的酯酶。

1-pET28a-lipase-BAL經(jīng)IPTG誘導(dǎo)(1 mmol/L IPTG，25 ℃ 誘導(dǎo)12～16 h)后的總蛋白；2-破碎離心后得到的沉淀；3-破碎 離心后得到的上清液可溶蛋白；4-Ni-NTA 純化后的蛋白圖3 pET28a-lipase-BAL在Rosetta中的表達(dá)純化Fig.3 Expression and purification of pET28a-lipase-BAL in Rosetta

2.3.2 溫度對(duì)酶活性的影響

不同溫度下(4、18、25、37、42、50、60、70、75 ℃)檢測(cè)重組蛋白脂肪酶的活性，結(jié)果如圖4-b所示，結(jié)果表明該酶的最適溫度為60 ℃。

該脂肪酶的耐溫試驗(yàn)表明，該重組蛋白在60 ℃及以下時(shí)，可在90 min內(nèi)保持穩(wěn)定，但在70 ℃蛋白的穩(wěn)定性較差，酶活性明顯下降(圖4-c)。進(jìn)一步試驗(yàn)表明該脂肪酶在4 ℃保存5 d，酶活性影響較少(結(jié)果未展示)。

2.3.3 pH對(duì)酶活性的影響

在不同pH值下(6.8、8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10.4、10.6)測(cè)定酶的活性，結(jié)果表明該脂肪酶最適pH為8.8，且pH的變化對(duì)酶的活性影響較為明顯(圖4-d)。

2.3.4 金屬離子對(duì)酶活性的影響

金屬離子常常作為酶的輔基或激活劑，通過自身化合價(jià)的變化來傳遞電子，完成生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)。常見的金屬離子中，一價(jià)或者二價(jià)的金屬離子對(duì)酶活性影響較大[22]。該研究挑選了幾種較為常見的金屬離子，檢測(cè)它們對(duì)該重組脂肪酶活性的影響。通過在酶反應(yīng)體系中加入終濃度為10 mmol/L的不同金屬離子如Ni2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、K+、Na+，結(jié)果表明除Ni2+、Ca2+和Na+外，其他離子都能促進(jìn)酶的反應(yīng)(圖4-e、表1)，且Na+離子濃度超過0.2 mol/L時(shí)，其抑制作用趨于穩(wěn)定(圖4-e)。

2.3.5 不同有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響

極性有機(jī)溶劑會(huì)通過改變脂肪酶分子的構(gòu)象，促進(jìn)酶與底物的結(jié)合，從而提高酶的催化性能[23]。為研究有機(jī)溶劑對(duì)重組脂肪酶活性的影響，該研究選擇了幾種極性不同的有機(jī)溶劑：甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙氰、二甲基亞砜，分別加至酶反應(yīng)體系的5%或10%后測(cè)定酶活性。結(jié)果表明重組脂肪酶對(duì)低濃度有機(jī)溶劑比較耐受，甚至5%二甲基亞砜濃度對(duì)重組脂肪酶活性還有10%作用的增強(qiáng)作用。但是高濃度(10%)的氯仿和乙氰則明顯抑制重組脂肪酶的活性，使酶活性分別降低65%和45%(表2)。

a-脂肪酶催化不同長度p-NPP底物(C2、C4、C6、C8、C12、C14、C16、C18)的活性；b-不同溫度下(4、18、25、37、42、50、60、70、75 ℃)脂肪酶 的活性；c-脂肪酶對(duì)不同溫度(37、42、60、70 ℃)的耐受試驗(yàn)；d-不同pH值下(6.8、8.0、8.4、8.8、9.2、9.6、10.4、10.6)脂肪酶的活性； e-脂肪酶對(duì)不同濃度Na+(0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L)的耐受試驗(yàn)圖4 BAL81435.1基因編碼脂肪酶的特征Fig.4 Characteristics of lipase encoded by BAL81435.1 gene

表1 金屬離子對(duì)酶活性的影響Table 1 Effects of metal ions on enzyme activity

表2 有機(jī)溶劑對(duì)酶活性的影響 單位：%

2.3.6 表面活性劑對(duì)酶活性的影響

表面活性劑Triton X-100、Tween 80、Tween 20等都對(duì)重組脂肪酶的活性影響較大，上述試劑的1% 可使重組酶喪失絕大部分活性或完全失去活性(表3)。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、EDTA和Urea同樣對(duì)酶活性影響較大，5 mmol/L的濃度可使酶活性降低近一半或喪失大部分活性(表3)。

表3 表面活性劑、變性劑對(duì)酶活性的影響Table 3 Effects of surfactants and denaturing agents on enzyme activity

3 結(jié)論

CaldisericumexileAZM16c01是來源于日本熱泉的嗜熱性微生物，是Caldiserica新門的代表性菌株。該文以CaldisericumexileAZM16c01為研究對(duì)象，對(duì)其基因組信息進(jìn)行篩選和分析，發(fā)現(xiàn)BAL81435.1預(yù)測(cè)為酯酶，但脂肪酶的進(jìn)化樹顯示BAL81435.1不同于脂肪酶已有的6個(gè)進(jìn)化分支，也不同于酯酶。對(duì)其重組表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行功能研究，確定BAL81435.1的功能，試驗(yàn)結(jié)果表明BAL81435.1編碼的嗜熱脂肪酶，其底物為長碳鏈(C12以上)的p-NPP，目前最適底物為C16的長碳鏈，最適pH值為8.8，最適溫度在60 ℃，在4～60 ℃具有較好的溫度耐受性。該脂肪酶對(duì)大部分有機(jī)溶劑、金屬離子、變性劑及高濃度的NaCl有較好的耐受性，但對(duì)表面活性劑敏感。

近年來微生物資源，尤其是生存環(huán)境比較特殊的極端微生物和海洋微生物，成為潛在的特性基因資源挖掘的主要對(duì)象。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法、定向進(jìn)化和功能驅(qū)動(dòng)的宏基因組方法盡管可以有目的的篩選出特性基因資源，但受培養(yǎng)條件、篩選模式、操作繁瑣等影響導(dǎo)致開發(fā)效率較低。該文基于已有序列的進(jìn)化分析，結(jié)合異源表達(dá)等證實(shí)BAL81435.1為新嗜熱脂肪酶，過程相對(duì)簡(jiǎn)潔，為快速發(fā)現(xiàn)特異的基因資源提供可選途徑。