畢赤酵母多基因組裝系統(tǒng)的構(gòu)建及其在2-苯乙醇合成中的應(yīng)用

陳曉瑞，戰(zhàn)春君，白仲虎，楊艷坤*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué),糧食發(fā)酵與食品生物制造國(guó)家工程研究中心，江蘇 無錫，214122)

巴斯德畢赤酵母(Komagataellaphaffii)是一種甲基營(yíng)養(yǎng)酵母，具有高密度發(fā)酵、副產(chǎn)物少、甲醇利用等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的生產(chǎn)[1]。隨著基因操作工具的不斷發(fā)展，畢赤酵母也開始被用于代謝產(chǎn)物的合成[2]，如脂肪醇的生產(chǎn)[2-3]。構(gòu)建細(xì)胞工廠常需要同時(shí)過表達(dá)多個(gè)不同基因，Gibson組裝[4]、golden gate克隆[5]、Gateway等克隆技術(shù)是構(gòu)建多基因表達(dá)載體的有效方法。其中g(shù)olden gate克隆技術(shù)主要利用二型內(nèi)切酶切割位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)之外的特點(diǎn)，只需在片段兩側(cè)引入很短的序列即可實(shí)現(xiàn)無痕連接[6]?；谶@種方法，PRIELHOFER等[7]建立了GoldenPics克隆方法，實(shí)現(xiàn)了8個(gè)表達(dá)盒的組裝。通過設(shè)計(jì)不同的接頭序列，這種方法可以實(shí)現(xiàn)多元件的順序組裝。GoldenPics是專用于畢赤酵母基因改造的試劑盒，相比于另一種酵母多元件質(zhì)粒構(gòu)建試劑盒Yeast Toolkit(YTK)[8]，其連接各元件的接頭序列被直接設(shè)計(jì)在骨架質(zhì)粒上，而不是作為一個(gè)獨(dú)立元件，避免了YTK中易產(chǎn)生錯(cuò)誤連接的問題。但GoldenPics所構(gòu)建的質(zhì)粒需要經(jīng)過菌落PCR驗(yàn)證，不如YTK中替換熒光蛋白的篩選方式直觀。另外GoldenPics無法回收篩選標(biāo)記，構(gòu)建產(chǎn)生的菌株具有抗性，不夠安全，不適合發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)需要,且無法實(shí)現(xiàn)游離表達(dá)，目的基因只能整合到基因組中。

針對(duì)以上問題，本研究設(shè)計(jì)了用于抗性回收及游離表達(dá)的元件，構(gòu)建了一種高效的畢赤酵母多基因組裝系統(tǒng)(multigene assembly system，MGAS)，可靈活替換目的基因的啟動(dòng)子、終止子、整合位點(diǎn)及表達(dá)方式。2-苯乙醇(2-phenylethanol，2-PE)是一種具有玫瑰香氣的高級(jí)芳香醇，具有很高的商業(yè)價(jià)值[9]。其生物合成途徑較長(zhǎng)(圖1)，調(diào)控機(jī)制復(fù)雜[10-12]。本研究利用MGAS，游離表達(dá)篩選了不同來源的關(guān)鍵酶并整合表達(dá)5個(gè)基因，最終重組菌株P(guān)E-3的2-PE產(chǎn)量達(dá)到了408.4 mg/L，相比出發(fā)菌株提高了10倍以上。該研究為畢赤酵母代謝改造提供了一種高效的分子工具，也為畢赤酵母合成高價(jià)值化學(xué)品提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用菌株及質(zhì)粒見附表1(https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.ts.20220512.1050.004.html，下同)。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉20。YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，葡萄糖20，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉20。YPM(yeast extract peptone methanol medium)培養(yǎng)基：0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L。MD(minimal dextrose medium)培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20，YNB 13.4，配制固體培養(yǎng)基時(shí)加入瓊脂粉20。BMGY(buffered glycerol-complex medium)培養(yǎng)基：酵母提取物10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，甘油2.5 g/L，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)。BMM(buffered methanol medium)培養(yǎng)基：0.5%(體積分?jǐn)?shù))甲醇，YNB 13.4 g/L，100 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.0)。

圖1 畢赤酵母從頭合成2-PE途徑示意圖Fig.1 De novo synthesis of 2-PE in Komagataella phaffii

1.2.2 試劑

所有內(nèi)切酶均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；MultiF Seamless Assembly Mix購(gòu)自ABclonal；Ligation mix購(gòu)自Takara；PCR Mix及回收膠、純化、質(zhì)粒提取所用試劑盒均購(gòu)自康為世紀(jì)；2-PE標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma；其余試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。本文所用引物如附表2所示均合成自蘇州金唯智生物科技有限公司。

1.3 搖瓶培養(yǎng)條件及抗性消除方法

1.3.1 搖瓶培養(yǎng)

將50 μL 菌液接種5 mL YPD培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min下過夜培養(yǎng)。之后按終濃度OD600=0.1接種至50 mL BMGY培養(yǎng)基，待OD600值達(dá)到4～6后收集菌液，5 000 r/min離心5 min，棄上清液保留菌體，轉(zhuǎn)接至50 mL BMM培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。每隔24 h補(bǔ)加終體積分?jǐn)?shù)為0.5%的甲醇并取樣測(cè)定生物量和2-PE濃度。

1.3.2 抗性消除方法

將50 μL菌液接種5 mL YPM培養(yǎng)基，30 ℃，200 r/min下培養(yǎng)24 h，劃線至YPD平板。30 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落分別接種至YPD及含0.1 mg/L博來霉素的YPD(YPDZ)培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min下培養(yǎng)36 h，只能在YPD中生長(zhǎng)的菌落即為抗性消除菌。

1.4 測(cè)定方法

樣品處理方法：取發(fā)酵液1 mL，12 000 r/min離心5 min后取上清液，加入等量無水乙醇，混勻后12 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行HPLC測(cè)定。

2-PE使用HPLC C18色譜柱(Shim-pack GIST，5 μm，150 mm×4.6 mm，日本島津)進(jìn)行檢測(cè)，HPLC程序?yàn)椋褐鶞?0 ℃，流速1 mL/ min，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，A相為含有1%(體積分?jǐn)?shù))乙腈的20 mmol/L KH2PO4溶液，B相為乙腈，0～6 min B相濃度由0%升至10%，6～25 min B相濃度由10%升至60%，25～26 min B相濃度由60%降至0%，保持至28 min。2-PE出峰時(shí)間為16.4 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 畢赤酵母多基因表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

為構(gòu)建畢赤酵母多基因表達(dá)系統(tǒng)，首先構(gòu)建了一系列帶有接頭序列的骨架質(zhì)粒，之后在此基礎(chǔ)上插入了啟動(dòng)子、終止子、整合位點(diǎn)、CEN/ARS序列、Cre-lox序列等一系列元件。

2.1.1 骨架質(zhì)粒的構(gòu)建

通過將pYTK001的BsmB I酶切位點(diǎn)替換為BsaI/BbsI酶切位點(diǎn)并引入GoldenPics中的接頭序列構(gòu)建了Bb1系列的骨架質(zhì)粒，接頭序列及質(zhì)粒圖譜如圖2所示。以pYTK001為模板，利用引物對(duì)Bb1-12-Fs1-F、Bb1-12-Fs2-R和Bb1-12-Fs2-F、Bb1-12-Fs1-R進(jìn)行PCR，得到片段Bb1-12-F1和Bb1-12-F2。通過同源重組連接兩片段，得到質(zhì)粒Bb1-12。質(zhì)粒Bb1-23、Bb1-34使用了相同的構(gòu)建方法。Bb3系列的骨架質(zhì)粒構(gòu)建方法與Bb1相同，區(qū)別為構(gòu)建Bb3-AD使用的引物對(duì)為Bb3-FsD-F、Bb3-AD-FsD-R和Bb3-FsA-R、Bb3-AD-FsD-R，Bb3-AH使用的引物對(duì)為Bb3-FsA-F、Bb3-AH-FsH-R和Bb3-FsA-R、Bb3-AH-FsH-R。

通過將pYTK095的BsaI酶切位點(diǎn)替換為BbsI/BsaI酶切位點(diǎn)并引入GoldenPics中的接頭序列構(gòu)建了Bb2系列的骨架質(zhì)粒。以pYTK095為模板，利用引物對(duì)Bb2-AB-FsA-F、Bb2-AB-FsB-R和Bb2-AB-FsB-F、Bb2-AB-FsA-R進(jìn)行PCR，得到片段Bb2-AB-F1和Bb2-AB-F2，通過同源重組連接兩片段，得到質(zhì)粒Bb2-AB。質(zhì)粒Bb2-BC、Bb2-CD、Bb2-DE、Bb2-EF、Bb2-FG、Bb2-GH使用了相同的構(gòu)建方法。

2.1.2 元件插入

以畢赤酵母GS115基因組為模板，利用引物對(duì)Fs1-pAOX1、pAOX1-Fs2進(jìn)行PCR，得到兩端帶有BsaI酶切位點(diǎn)和接頭序列1、2的片段pAOX1。之后配制以下體系：片段100 ng，Bb1-12 40 ng，Ligation mix 5 μL，BsaI 1 μL，加水補(bǔ)齊至10 μL。按照以下程序進(jìn)行反應(yīng)：37 ℃，3 h；50 ℃，5 min；80 ℃，10 min。之后轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布氯霉素抗性平板篩選，挑取白色菌落并測(cè)序。之后用相同的方法構(gòu)建了Bb1-pFLD1。Bb1-RPS25tt的構(gòu)建方法相同，但使用的骨架質(zhì)粒為Bb1-34。

代謝工程改造常需要篩選不同的外源基因。游離表達(dá)轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)單、對(duì)宿主影響小，先通過游離表達(dá)篩選出最適的外源基因再整合至基因組可以簡(jiǎn)化基因操作。因此構(gòu)建了質(zhì)粒Bb2-AB-CEN/ARS-BleoR以實(shí)現(xiàn)外源基因的游離表達(dá)。以質(zhì)粒pYTK081為模板，利用引物對(duì)Fs1-CENARS-BleoR-F、CENARS-BleoR-R進(jìn)行PCR。以pMCO為模板，利用引物對(duì)CENARS-BleoR-F、CENARS-BleoR-Fs4進(jìn)行PCR。將以上獲得的兩個(gè)PCR產(chǎn)物進(jìn)行融合PCR，得到片段CEN/ARS-BleoR，兩端帶有BbsI酶切位點(diǎn)和1、4接頭序列。使用內(nèi)切酶BbsI將其與Bb2-AB進(jìn)行g(shù)olden gate克隆，挑取白色菌落并測(cè)序。

畢赤酵母中抗性標(biāo)記有限，對(duì)其進(jìn)行多輪基因操作需要回收篩選標(biāo)記。另一方面，出于安全性的考慮，生產(chǎn)所用的菌株不應(yīng)帶有抗性。LI等[11]構(gòu)建了質(zhì)粒pMCO，用于畢赤酵母中抗性標(biāo)記的回收。以質(zhì)粒pMCO為模板，利用引物對(duì)Fs1-Cre-F、BleoR-Fs 4進(jìn)行PCR，得到片段的Cre-BleoR兩端帶有BbsI酶切位點(diǎn)和1、4接頭序列,如圖3所示。使用內(nèi)切酶BbsI將其與Bb2-AB進(jìn)行g(shù)olden gate克隆，挑取白色菌落并測(cè)序，得到質(zhì)粒Bb2-AB-Cre-BleoR。甲醇誘導(dǎo)Cre重組酶的表達(dá)后，loxP位點(diǎn)間的Cre和BleoR表達(dá)框被切除，即可消除抗性。

為實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)，在Bb2-BC中插入了用于整合的元件AOX1TT，構(gòu)建質(zhì)粒Bb2-BC-AOX1TT。以畢赤酵母GS115基因組為模板，利用引物對(duì)Fs1-AOX1TT、AOX1TT-Fs4進(jìn)行PCR，得到699的片段兩端帶有BbsI酶切位點(diǎn)和1、4接頭序列。使用內(nèi)切酶BbsI將其與Bb2-BC進(jìn)行g(shù)olden gate克隆，挑取白色菌落并測(cè)序。

圖3 片段Cre-BleoR示意圖Fig.3 Map of fragment Cre-BleoR

2.2 畢赤酵母多基因表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用

2.2.1 解除關(guān)鍵酶的負(fù)反饋抑制

芳香族氨基酸生物合成途徑存在嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制，其中磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvic acid，PEP)和4-磷酸赤蘚糖(erythritose 4-phosphate，E4P)縮合生成2-酮-3-脫氧-D-阿拉伯庚酮-7-磷酸(2-ketone-3-deoxy-D-arabheptanone-7-phosphate，DAHP)及分支酸轉(zhuǎn)變?yōu)轭A(yù)苯酸是2個(gè)關(guān)鍵的限速步驟，受到芳香族氨基酸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)[13]，通過定點(diǎn)突變或刪除調(diào)節(jié)區(qū)域是解決這一問題的關(guān)鍵手段[14]。

2.2.1.1 游離型多基因表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

選擇了大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的DHAP合酶AroGD146Np(GenBank：WP_001109196.1)和分支酸變位酶PheAfbrp(GenBank：NP_311489.1)[15]及釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)來源的DHAP合酶Aro4K229Lp(Gene ID：852551)和分支酸變位酶Aro7G141Sp(Gene ID：856173)在畢赤酵母中進(jìn)行游離表達(dá)。質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖4所示，以質(zhì)粒Bb3-CEN/ARS-Aro4K229L-Aro7G141S的構(gòu)建為例，以釀酒酵母BY4741基因組為模板，利用3對(duì)引物：Fs2-Aro4和Aro4-BsaI-R；Aro4-BsaI-F和Aro4K229L-rv；Aro4K229L-fw和Aro4-Fs3得到3段PCR產(chǎn)物，之后利用引物對(duì)Fs2-Aro4和Aro4-Fs3進(jìn)行融合PCR。將所得PCR產(chǎn)物連接到質(zhì)粒Bb1-23得到質(zhì)粒Bb1-Aro4K229L，將其與Bb1-pAOX1、Bb1-RPS25Att、Bb2-BC進(jìn)行g(shù)olden gate組裝，得到質(zhì)粒Bb2-BC-Aro4K229L。用相同的方法得到質(zhì)粒Bb2-CD-Aro7G141S，將其與Bb2-AB-CEN/ARS、Bb2-BC-Aro4K229L進(jìn)行g(shù)olden gate組裝，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取白色菌落，得到質(zhì)粒Bb3-CEN/ARS-Aro4K229L-Aro7G141S，質(zhì)粒圖譜如圖4所示。用相同的方法得到Bb3-CEN/ARS-AroGD146 N-PheAfbr。

圖4 游離型多基因表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.4 Construction of episomal multigene constructs

2.2.1.2 解除負(fù)反饋抑制對(duì)畢赤酵母合成2-PE的影響

分別將質(zhì)粒Bb3-CEN/ARS-Aro4K229L-Aro7G141S和Bb3-CEN/ARS-AroGD146 N-PheAfbr電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115，得到菌株P(guān)E-1和PE-2。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵和產(chǎn)物測(cè)定，結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)兩種來源的酶都能有效解除畢赤酵母中的負(fù)反饋抑制，重組菌株產(chǎn)量都在150 mg/L以上，且釀酒酵母來源的ARO4K229L和ARO7G141S兩基因效果更加顯著。而出發(fā)菌株的產(chǎn)量始終在40 mg/L以下，低于線性范圍(結(jié)果未展示)。以上結(jié)果證明過表達(dá)解除反饋抑制的關(guān)鍵酶可以有效解除終產(chǎn)物產(chǎn)生的反饋抑制。

2.2.2 過表達(dá)莽草酸途徑

為了實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，將釀酒酵母來源的基因ARO4K229L和ARO7G141S整合到畢赤酵母基因組中。為進(jìn)一步促進(jìn)畢赤酵母合成2-PE，同時(shí)將莽草酸途徑中的DHAP合酶ARO3(Gene ID：8200288)、ARO5(Gene ID：8198396)和莽草酸途徑下游的預(yù)苯酸脫水酶PHA2(Gene ID：8200719)基因整合到基因組中進(jìn)行了過表達(dá)。

圖5 菌株P(guān)E-1和PE-2的發(fā)酵結(jié)果Fig.5 Fermentation performance of strains PE-1 and PE-2

2.2.2.1 整合型多基因表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

使用2.2.1.1中描述的方法構(gòu)建了質(zhì)粒Bb2-CD-Aro4K229L、Bb2-DE-Aro7G141S、Bb2-EF-Pha2、Bb2-FG-Aro3、Bb2-GH-Aro5。將以上質(zhì)粒與Bb3-AH、Bb2-AB-Cre和Bb2-BC-AOX1TT進(jìn)行g(shù)olden gate組裝，將轉(zhuǎn)化大腸桿菌后統(tǒng)計(jì)平板上綠色和白色菌落的個(gè)數(shù)。結(jié)果如圖6-a所示，平板白色菌落占90%以上。菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果如圖，利用4對(duì)引物：(1)Fs2-Aro4、Aro7-Fs3；(2)Fs2-Aro7、Pha2-Fs3；(3)Fs2-Pha2、Aro3-Fs3；(4)Fs2-Aro3、Aro5-Fs3分別得到大小為2 756、2 543、2 876、3 374 bp的條帶，如圖6-b所示，證明質(zhì)粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5構(gòu)建成功，質(zhì)粒圖譜如圖6-c所示，證明本研究所構(gòu)建系統(tǒng)可完成多達(dá)7個(gè)元件的組裝。

a-平板白色與綠色菌落分布；b-質(zhì)粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5驗(yàn)證圖(M-DL 10000 Marker;1-基因ARO4與ARO7連接驗(yàn)證; 2-基因ARO7與PHA2連接驗(yàn)證;3-基因PHA2與ARO3連接驗(yàn)證;4-基因ARO3與ARO5連接驗(yàn)證)；c-質(zhì)粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5圖譜圖6 游離型多基因表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.6 Construction of episomal multigene constructs

2.2.2.2 過表達(dá)莽草酸途徑對(duì)畢赤酵母合成2-PE的影響

用XhoI對(duì)質(zhì)粒Bb3-Aro4K229L-Aro7G141S-Pha2-Aro3-Aro5進(jìn)行線性化，之后電轉(zhuǎn)至畢赤酵母GS115，得到菌株P(guān)E-3。經(jīng)過搖瓶發(fā)酵和產(chǎn)物測(cè)定，結(jié)果如圖7所示，PE-3合成了408.4 mg/L的2-PE，是出發(fā)菌株的10倍以上。以上結(jié)果證明，引入Aro4K229Lp和Aro7G141Sp并高表達(dá)Pha2p、Aro3p、Aro5p是提高畢赤酵母2-PE合成能力的有效策略。

3 結(jié)論與討論

基于golden gate組裝的基因操作工具已在多種酵母中得到應(yīng)用[16-18]，本研究以此為基礎(chǔ)，建立了一種畢赤酵母多基因組裝系統(tǒng)，進(jìn)行了7個(gè)原件的連接，轉(zhuǎn)化后平板白色菌落在90%以上，說明該系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)多片段的高效組裝。使用該方法構(gòu)建質(zhì)粒可通過直觀的熒光變化篩選到陽性克隆，菌株抗性可消除，目的基因的表達(dá)方式、啟動(dòng)子、終止子、整合位點(diǎn)均可靈活調(diào)整。利用MGAS，對(duì)畢赤酵母2-PE合成途徑進(jìn)行了一系列改造：通過游離表達(dá)不同來源的關(guān)鍵酶，解除負(fù)反饋抑制；整合表達(dá)ARO4K229L、ARO7G141S、PHA2、ARO3、ARO5，增加了莽草酸途徑通量，最終構(gòu)建的重組菌株2-PE產(chǎn)量達(dá)到了408.4 mg/L。本研究可為畢赤酵母代謝工程提供一種高效的多基因組裝方法，也為畢赤酵母合成高附加值代謝物提供了參考。

a-PE-3發(fā)酵液中2-PE濃度；b-PE-3生長(zhǎng)曲線圖7 菌株P(guān)E-3的發(fā)酵結(jié)果Fig.7 Fermentation performance of strains PE-3