高山被孢霉NADP+依賴型異檸檬酸脫氫酶的異源表達與活性分析

王旭旭，孫曉琪，陳海琴，趙建新，陳衛(wèi)，唐鑫

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

脂質(zhì)積累量超過其生物量20%的一類微生物被稱為產(chǎn)油微生物[1]。其中的產(chǎn)油絲狀真菌高山被孢霉具有生產(chǎn)高附加值脂肪酸的能力，可積累大量的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFAs)，尤其是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，其AA含量可達總脂肪酸的40%。作為商業(yè)化生產(chǎn)AA的最主要來源，高山被孢霉現(xiàn)已被認定為是PUFAs生產(chǎn)中的重要工業(yè)化菌株[2]，因而受到業(yè)界的廣泛關注。PUFAs合成的兩大關鍵因素是乙酰輔酶A和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)[3]。NADPH的供應在產(chǎn)油微生物中引起了極大的研究興趣。特別是RATLEDGE[4]通過化學計量學評價了產(chǎn)油微生物中蘋果酸酶(malic enzyme, ME)和磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway, PPP)對NADPH的貢獻，結果得出在某些產(chǎn)油微生物中以上2種途徑產(chǎn)生的NADPH不能夠滿足產(chǎn)脂所需，并認為NADP+依賴型異檸檬酸脫氫酶(NADP-isocitrate dehydrogenase, NADP-IDH)可能是潛在的NADPH供應者。

IDH負責催化異檸檬酸氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-ketoglutaric acid, α-KG)和CO2，還原NAD(P)+為NAD(P)H[5]。根據(jù)輔酶依賴性不同可以將IDHs分為NAD-IDHs(EC 1.1.1.41)和NADP-IDHs(EC1.1.1.42)兩種類型，前者在三羧酸循環(huán)中催化第1個氧化脫羧反應，因此在控制糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝中發(fā)揮重要的作用，后者通過合成NADPH以及α-KG，參與抗氧化反應，維持胞內(nèi)異檸檬酸和α-KG平衡[6-7]。二者在自然界生物中廣泛分布，但不同來源的IDH在功能方面存在一定的差異。

產(chǎn)油微生物中的IDH在脂肪酸合成中扮演著重要的角色。WYNN等[8]在探究芝麻酚抑制卷枝毛霉脂肪酸合成機制時，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)NADP-IDH活性在芝麻酚作用后下降57%，NADPH的合成減少影響脂質(zhì)的積累。產(chǎn)油微生物中主要的NADPH供應者PPP和ME的功能已得到充分的研究，本課題組研究發(fā)現(xiàn)高山被孢霉胞質(zhì)中NADP+依頓型的IDH4(Mortierellaalpinaisocitrate dehydrogenase4, MaIDH4)的過量表達可以促進脂質(zhì)的積累[9-12]。但MaIDH4的性質(zhì)還未得到充分的研究，因此獲得高活性高產(chǎn)量的純酶具有重要的意義。

大腸桿菌(Escherichiacoli)和畢赤酵母都是優(yōu)良的表達宿主，前者具有培養(yǎng)簡單、生長快速、遺傳背景清晰等特點[13-14]，后者具備真核生物共有的胞內(nèi)環(huán)境和亞細胞結構，利于真核來源蛋白活性結構的組裝[15]?；趯嶒炇仪捌诘难芯拷Y果，本文選擇對高山被孢霉脂質(zhì)積累影響較為明顯的MaIDH4進行異源表達，并利用鎳柱分離純化目的蛋白，比較大腸桿菌和畢赤酵母兩個宿主中純酶比活力和酶產(chǎn)量的差異，為深入研究MaIDH4的酶學性質(zhì)及生產(chǎn)應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主E.coliTop10、E.coliBL21(DE3)和PichiaPinkTMStrain 2菌株以及表達載體pET28a(+)和pPink-HC均購自Invitrogen公司，攜帶10×His標簽的pPink-HC-3CZHEK是基于pPink-HC改造獲得，現(xiàn)保存于江南大學食品生物技術中心。

KOD酶，東洋紡(上海)生物科技有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶，Thermo Fisher公司；DNA-T4連接酶，日本TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒，天根生化科技有限公司；DL-異檸檬酸三鈉鹽水合物，麥克林(中國上海)；NADP氧化型輔酶Ⅱ，上海生工(中國上海)；咪唑，國藥滬式(中國上海)；用于大腸桿菌和畢赤酵母培養(yǎng)的LB培養(yǎng)基、畢赤酵母腺嘌呤缺陷培養(yǎng)基(pichia adenine dropout, PAD)、緩沖甘油復合培養(yǎng)基(buffered glycerol-complex medium, BMGY)、緩沖甲醇復合培養(yǎng)基(buffered methanol-complex medium, BMMY)、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose medium, YPD)的配方，Thermo Fisher Scientific；引物的合成和基因測序由華大基因完成。

1.2 儀器與設備

HR30-IIA2生物安全柜，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；UV-2450島津分光光度計，日本島津公司；GRP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；ZQZY-VAF振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；Tanon化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司；DYY-7C電泳儀電源，北京六一生物科技有限公司；SX-300高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tomy Seiko有限公司；電轉化儀，Eppendorf公司；17524701 HisTrapTMHP Ni柱，思拓凡公司；Sorvall ST40R臺式冷凍離心機，美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 重組菌的構建及誘導表達

1.3.1 重組大腸桿菌的構建及誘導表達

使用MaIDH4特異性引物(表1)和KOD高保真酶擴增高山被孢霉ATCC32222[12]中的目的片段，PCR產(chǎn)物通過核酸電泳進行驗證。采用限制性核酸內(nèi)切酶(NdeⅠ和EcoR Ⅰ)對目的基因和載體pET28a(+)進行雙酶切處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA-T4連接酶處理構建重組質(zhì)粒。通過化學轉化法將重組質(zhì)粒[pET28a(+)-MaIDH4]和空載質(zhì)粒轉化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，使用pET28a(+)通用引物(T7引物)對轉化子進行PCR驗證，并送至公司測序，測序正確的轉化子用于后續(xù)試驗。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

將重組菌E.coliBL21(DE3)-pET28a(+)-MaIDH4接種于含有Kana的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h。隨后按1%(體積分數(shù))接種量接種于相同的新鮮LB培養(yǎng)基，使用以上培養(yǎng)條件進行擴大培養(yǎng)，當菌體密度OD600值達到0.6時向培養(yǎng)基中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)(終濃度為0.4 mmol/L)，于20 ℃，200 r/min培養(yǎng)16 h以誘導目的蛋白表達，之后于3 000×g離心5 min收集菌體，并保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實驗。

使用細胞破碎緩沖液[50 mmol/L磷酸二氫鈉，pH 7.4；1 mmol/L苯甲基磺酰氟；5%(體積分數(shù))甘油]回溶菌體，充分混勻后加入玻璃珠，漩渦振蕩30 s，冰上靜置30 s，重復此破碎步驟8～10次獲得全細胞破碎液。將全細胞破碎液于4 ℃，8 000×g條件下離心10 min收集上清液，上清液即為粗酶液。向樣品中加入Loading buffer，95 ℃金屬浴變性10 min，進行SDS-PAGE和Western-Blot分析。

1.3.2 重組畢赤酵母的構建及誘導表達

采用StuⅠ和EcoR Ⅰ依次消化目的基因和表達載體pPink-HC-3CZHEK，對消化產(chǎn)物進行核酸電泳驗證，通過DNA-T4連接酶將二者連接構建重組質(zhì)粒，采用化學轉化法將重組質(zhì)粒轉化到E.coliTop10感受態(tài)細胞，挑取轉化子進行PCR驗證，并送至公司測序。提取空載質(zhì)粒和陽性轉化子中的重組質(zhì)粒，使用XagⅠ限制性核酸內(nèi)切酶將其進行線性化，對線性化前后的產(chǎn)物進行核酸電泳驗證。將線性化的重組載體和空載質(zhì)粒電擊轉化入PichiaPinkTMStrain 2感受態(tài)細胞，提取白色轉化子的基因組，使用pPink-HC-3CZHEK通用引物(AOX、CYC)進行PCR驗證，驗證正確的轉化子用于后續(xù)試驗。

挑取陽性轉化子接入PAD液體培養(yǎng)基，在28 ℃，200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。隨后以1%的接種量接種于BMGY培養(yǎng)基，于28 ℃，200 r/min條件下擴大培養(yǎng)36 h。將菌液在4 ℃，1 500×g下離心5 min以去除BMGY培養(yǎng)基，使用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體，在28 ℃，200 r/min條件下誘導培養(yǎng)24 h。之后于3 000×g離心5 min收集菌體，并保存于-80 ℃冰箱用于后續(xù)實驗。重組畢赤酵母細胞破碎方法以及SDS-PAGE和Western-Blot樣品制備方法同1.3.1中所述。

1.4 重組蛋白的純化

1.4.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)中目的蛋白的純化

使用HisTrapTMHP Ni柱純化目的蛋白，所有純化操作均在4 ℃下完成。粗酶液經(jīng)0.22 μm的水系濾膜過濾后用于后續(xù)親和純化。首先使用結合緩沖液(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl，pH 7.4)進行柱平衡，然后將過濾后的粗酶液加載到Ni柱中，結合緩沖液過柱去除非特異性結合的雜蛋白，后面依次通過含有100、200、350 mmol/L咪唑的洗脫液(20 mmol/L磷酸鈉緩沖液，500 mmol/L NaCl,不同濃度的咪唑，5%甘油，pH 7.4)，收集所有的過柱流出組分。通過透析去除純化產(chǎn)物中的高濃度鹽離子并置換緩沖體系，透析液(50 mmol/L Tris-HCl，5%甘油)更換3次依次透析2、4、12 h。對純化過程中的每個流出組分進行SDS-PAGE分析，確定產(chǎn)物的純度，并對分子質(zhì)量進行驗證。制備丙烯酰胺質(zhì)量濃度分別為50 g/L和100 g/L的濃縮膠和分離膠用于電泳分析。使用BCA試劑盒對蛋白濃度進行定量。

1.4.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)中目的蛋白的純化

畢赤酵母的純化方法同大腸桿菌，純化過程所使用的細胞破碎液和結合緩沖液中需添加100 mmol/L咪唑。

1.5 酶活性分析

酶活力測定方法參考文獻[16]，并略有改動。反應體系包含Tris-HCl(82.2 mmol/L，pH 8.0)、MnCl2/MgCl2(3 mmol/L)、NADP氧化型輔酶Ⅱ(0.6 mmol/L)、DL-異檸檬酸三鈉鹽水合物(5 mmol/L)，混合以上物質(zhì)于30 ℃孵育2 min，添加酶液啟動反應，然后在島津UV-2450 UV-VIS分光光度計340 nm處監(jiān)測NADPH的生成。酶活力單位定義為每分鐘生成1 μmol的NADPH所需要的酶量。所有數(shù)據(jù)來自3個平行處理。

2 結果與分析

2.1 重組大腸桿菌的構建和目的蛋白的鑒定

以高山被孢霉cDNA為模板使用特異性引物擴增目的片段，PCR產(chǎn)物的核酸電泳結果如圖1-a所示，泳道1的1 000～1 200 bp附近處出現(xiàn)明顯的條帶，這與MaIDH4基因的理論大小(1 233 bp)一致，表明成功擴增目的基因片段。重組質(zhì)粒轉化E.coliBL21感受態(tài)細胞獲得轉化子，利用載體的通用引物對轉化子進行PCR驗證，結果如圖1-b所示，條帶出現(xiàn)在1 500 bp附近，這與理論值(1 510 bp)接近(PCR結果等于目的基因減去終止密碼子后的1 230 bp 加上含有6×His標簽的載體片段280 bp，因此PCR的條帶大小與目的基因的條帶大小一致)，轉化子經(jīng)測序驗證正確，表明重組菌株E.coliBL21-pET28a(+)-MaIDH4構建成功。

M-Marker a-MaIDH4 PCR擴增產(chǎn)物(1-目的基因PCR擴增產(chǎn)物)； b-重組菌轉化子PCR驗證結果[1-重組菌BL21-pET28a(+)- MaIDH4轉化子；2-陰性對照菌BL21-pET28a(+)轉化子]圖1 目的基因擴增及重組大腸桿菌轉化子鑒定結果Fig.1 Amplification of target gene and identification of recombinant E.coli transformants

重組菌在IPTG誘導下表達目的蛋白。SDS-PAGE和Western-Blot結果如圖2所示，條帶出現(xiàn)在40～55 kDa附近，這與理論值46 kDa相一致，表明MaIDH4在E.coliBL21(DE3)中成功表達。

M-Marker；1-陰性對照菌E.coli BL21-pET28a(+) 細胞破碎液；2-重組菌E.coli BL21-pET28a(+)-MaIDH4 細胞破碎液 a-SDS-PAGE結果；b-Western-Blot結果圖2 目的蛋白誘導表達結果Fig.2 The results of target protein induction expression

2.2 重組畢赤酵母的構建和目的蛋白的鑒定

將擴增獲得的目的基因和載體pPink-HC-3CZHEK進行雙酶切處理，酶切結果如圖3-a和圖3-b所示，酶切產(chǎn)物條帶大小與預期值相符(1 233、8 156 bp)表明雙酶切成功。重組質(zhì)粒轉化E.coliTop 10獲得轉化子，利用載體的通用引物對轉化子進行PCR驗證，結果如圖3-c所示，條帶位于2 000 bp左右這與理論值1 929 bp相接近(PCR結果等于目的基因減去終止密碼子后的1 230 bp加上含有10×His標簽和HRV 3C蛋白酶A的載體片段699 bp，因此PCR的條帶大小與目的基因的條帶大小一致)，轉化子經(jīng)測序驗證正確，表明重組菌株E.coliTop10-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4構建成功。

M-Marker a-Stu Ⅰ酶切結果(1-目的基因經(jīng)Stu Ⅰ酶切前;2-目的基因經(jīng)Stu Ⅰ酶切后;3-載體經(jīng)Stu Ⅰ酶切前;4-載體經(jīng)Stu Ⅰ酶切后)；b-EcoR Ⅰ 酶切結果(1-目的基因經(jīng)EcoR Ⅰ酶切前;2-目的基因經(jīng)EcoRⅠ酶切后;3-載體經(jīng)EcoR Ⅰ酶切前;4-載體經(jīng)EcoR Ⅰ酶切后)；c-轉化子PCR 驗證結果(1-空白反應體系;2-E.coli Top10-pPink-HC-3CZHEK轉化子;3～5-E. coli Top10-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4轉化子)圖3 酶切及轉化子鑒定結果Fig.3 The results of enzyme digestion and transformants identification

空載質(zhì)粒和重組質(zhì)粒經(jīng)XagⅠ線性化的核酸電泳結果如圖4-a所示，條帶在8 000～10 000 bp時與理論值(8 179、9 394 bp)相符合。線性化產(chǎn)物分別轉化PichiaPinkTMStrain 2感受態(tài)細胞獲得轉化子，利用載體的通用引物對轉化子的基因組進行PCR，其結果如圖4-b所示，條帶在2 000 bp附近時與理論值(1 929 bp)一致，表明重組菌PichiaPinkTM-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4構建成功。

M-Marker a-重組質(zhì)粒線性化結果(1-pPink-HC-3CZHEK經(jīng)Xag Ⅰ酶切前; 2-pPink-HC-3CZHEK經(jīng)Xag Ⅰ酶切后;3-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4 經(jīng)Xag Ⅰ酶切前;4-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4經(jīng)Xag Ⅰ酶切后；b-重組 菌轉化子基因組PCR驗證結果(1-空白反應體系;2-PichiaPinkTM- pPink-HC-3CZHEK轉化子;3～4-PichiaPinkTM-pPink-HC-3CZHEK- MaIDH4轉化子)圖4 線性化及轉化子鑒定結果Fig.4 The results of linearization and transformants identification

重組菌誘導培養(yǎng)結束，通過SDS-PAGE和Western-Blot對菌體樣本進行分析，結果如圖5所示。Western-Blot結果顯示重組蛋白的條帶出現(xiàn)在55～72 kDa附近，這與理論分子質(zhì)量67 kDa接近，表明外源蛋白MaIDH4在PichiaPinkTMStrain 2中成功表達。由于二者使用的載體不同，大腸桿菌使用pET28a(+)，畢赤酵母使用pPink-HC-3CZHEK，除了目的基因外，大腸桿菌表達載體中包括6×His標簽表達元件，畢赤酵母表達載體包括10×His標簽和HRV 3C蛋白酶A表達元件，導致翻譯出來的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量存在差異。pPink-HC-3CZHEK是在高拷貝質(zhì)粒pPink-HC基礎上加入10×His標簽，相比于pET28a(+)中的6×His標簽更利于目的蛋白與Ni柱結合。另外，宿主細胞PichiaPinkTMStrain 2是在腺嘌呤缺陷型基礎上敲除了pep4基因，pep4的敲除可減少目的蛋白的水解，利用回補ADE2的pPink-HC質(zhì)粒和營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基來篩選轉化子，相對于抗生素篩選更加方便，另外在蛋白表達放大試驗中能夠保持轉化子的穩(wěn)定性[17-18]。MaIDH4來源于真核生物高山被孢霉，這也是選擇真核表達系統(tǒng)畢赤酵母的一個重要原因。

2.3 不同表達系統(tǒng)對MaIDH4表達效果的影響

為探究MaIDH4在大腸桿菌和畢赤酵母兩個表達系統(tǒng)中的蛋白表達情況，采用SDS-PAGE檢測等質(zhì)量蛋白(15 μg)上樣的情況下，2個表達系統(tǒng)中目的蛋白的表達水平差異。由圖6可知，在總蛋白質(zhì)量一致的情況下，目的蛋白在大腸桿菌總蛋白中占比相對較高，主要因為大腸桿菌表達系統(tǒng)的總蛋白量較少，而畢赤酵母表達系統(tǒng)中總蛋白量較多，因此，目的蛋白在畢赤酵母總蛋白中占比相對較小。

2.4 重組蛋白的純化與鑒定

2.4.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)目的蛋白的純化與鑒定

重組菌E.coliBL21-pET28a(+)-MaIDH4中目的蛋白的純化結果如圖7所示，在泳道7出現(xiàn)單一條帶證明了產(chǎn)物的純度，其大小在40～50 kDa,這與理論值(46 kDa)相一致。

M-Marker；1-全細胞破碎液；2-粗酶液；3-粗酶過濾液 (0.22 μm)；4-過柱流出液；5-含100 mmol/L咪唑的洗脫液； 6-含200 mmol/L咪唑的洗脫液；7～8-含350 mmol/L咪唑的洗脫液圖7 大腸桿菌重組菌目的蛋白的純化Fig.7 Purification of target proteins from E.coli BL21(DE3) recombinant strains

2.4.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)目的蛋白的純化與鑒定

重組菌PichiaPinkTM-pPink-HC-3CZHEK-MaIDH4中目的蛋白的純化結果如圖8所示。目的蛋白主要出現(xiàn)在含有350 mmol/L咪唑的洗脫液中，泳道13中出現(xiàn)單一條帶證明了產(chǎn)物的純度，條帶大小位于60～70 kDa，這與理論分子質(zhì)量(67 kDa)基本一致。相比于大腸桿菌重組酶，畢赤酵母重組酶的純化相對復雜，畢赤酵母總蛋白量高于大腸桿菌，因此在酶純化過程中需要提前加入100 mmol/L的咪唑以減少雜蛋白與Ni柱的結合。

M-Marker；1-全細胞破碎液；2-粗酶液；3-粗酶過濾液 (0.22 μm)；4-過柱流出液；5～7-含100 mmol/L咪唑的洗脫液； 8～10-含200 mmol/L咪唑的洗脫液；11～15-含350 mmol/L 咪唑的洗脫液圖8 畢赤酵母重組菌目的蛋白的純化Fig.8 Purification of target proteins from PichiaPink recombinant strains

2.5 不同表達系統(tǒng)對純酶活性的影響

對不同表達系統(tǒng)的純酶比活力和酶產(chǎn)量進行測定，結果如表2所示，畢赤酵母表達系統(tǒng)中的純酶比活力和酶產(chǎn)量分別是大腸桿菌的1.3倍和15.5倍，畢赤酵母表達系統(tǒng)在這2個方面均優(yōu)于大腸桿菌。因此畢赤酵母為MaIDH4的最佳表達宿主。真核表達體系畢赤酵母具有嚴格接受甲醇誘導而進行轉錄的醇氧化酶I啟動子利于外源基因的控制表達，強有力呼吸系統(tǒng)可促進細胞的高密度生長[19]，并且具備很多高級真核生物翻譯后的修飾，利于外源蛋白活性結構的形成[20]。而大腸桿菌缺乏一些高級真核生物所具備的翻譯后修飾功能，進而影響重組蛋白的穩(wěn)定性和活性。另外，大腸桿菌缺乏真核生物中的一些稀有密碼子，導致相關蛋白的表達提前終止[21]。MaIDH4更適合在畢赤酵母中表達，這一點與抗病毒蛋白RC28、黃曲霉毒素B1單鏈抗體以及木聚糖酶相一致[22-24]。這些可能是因為真核表達系統(tǒng)的翻譯后修飾機制利于蛋白活性形式的組裝。

表2 不同表達體系的MaIDH4活性和產(chǎn)量差異Table 2 Differences in MaIDH4 activity and yield of different expression systems

3 結論

絲狀真菌高山被孢霉具有較強的脂肪酸合成能力，現(xiàn)已成為一個重要的脂質(zhì)合成模式生物。作為還原力供應者之一的胞質(zhì)NADP-IDH在PUFAs生產(chǎn)中發(fā)揮著一定的作用。目前關于高山被孢霉來源的MaIDH4還未得到表征，本研究在大腸桿菌表達系統(tǒng)和畢赤酵母表達系統(tǒng)中分別表達和純化了MaIDH4，比較了2個系統(tǒng)的純酶活性及酶產(chǎn)量的差異，確定了畢赤酵母為MaIDH4的優(yōu)良表達宿主，該宿主更具大規(guī)模發(fā)酵的優(yōu)勢，這為MaIDH4的酶學性質(zhì)研究奠定了堅實的基礎。