七烯甲萘醌合成過程中關(guān)鍵蛋白的定位分析

陳奇，張智航，夏洪志，孫怡，金柯，呂雪芹，崔世修，劉龍*

1(江南大學(xué),糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué),未來食品中心，江蘇 無錫，214122) 3(南通勵(lì)成生物工程有限公司，江蘇 南通，226010)

維生素K2是一類重要的脂溶性維生素，根據(jù)側(cè)鏈異戊二烯基數(shù)目的不同，可以分為多種亞型，如四烯甲萘醌(menaquinone-4, MK-4)、七烯甲萘醌(menaquinone-7, MK-7)、八稀甲萘醌(menaquinone-8,MK-8)等[1]。維生素K2在治療骨質(zhì)疏松和心血管硬化等疾病中發(fā)揮重要作用[2]。目前，維生素K2主要通過微生物發(fā)酵的方法獲取。菌種之間生理特性存在差異，導(dǎo)致不同的菌種合成的維生素K2類型不同，比如大腸桿菌(Escherichiacoli)主要合成MK-4和MK-8[3]，芽孢類細(xì)菌主要合成MK-7[4]。在維生素K2的眾多亞型中，MK-7在人體內(nèi)的半衰期更長(zhǎng)，具有良好的親和性[1]，且近期有研究表明MK-7能夠降低發(fā)生線粒體功能障礙與帕金森疾病的風(fēng)險(xiǎn)[5]。這些重要的功能使MK-7受到了越來越多的重視，但其生產(chǎn)效率的低下限制了其產(chǎn)業(yè)化的進(jìn)程。

MK-7的結(jié)構(gòu)由2-甲基-(1,4)-萘醌核(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid,DHNA)及C-3位的脂肪側(cè)鏈(C35)組成。在原核生物中，DHNA是由分支酸經(jīng)過7步催化獲得，側(cè)鏈由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸經(jīng)過甲基赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(methylerythritol-4-phosphate pathway, MEP pathway)獲得[6]。在1,4-二羥基-2-萘甲酸異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(1,4-dihydroxy-2-naphthoic acid prenyltransferase, MenA)的作用下將側(cè)鏈轉(zhuǎn)移到DHNA的C2的位置上，形成2-脫甲基甲萘醌[7]。然后，在甲基轉(zhuǎn)移酶(methyltransferase，MenH)的作用下在C3的位置上增加一個(gè)甲基，最終生成MK-7[8](圖1)。很多研究通過增加menA的表達(dá)量實(shí)現(xiàn)維生素K2的高效合成，比如在E.coli中組成型過表達(dá)menA和menD，相比于野生型菌株，八烯甲萘醌的產(chǎn)量提高了5倍[3]。在納豆芽孢桿菌(Bacillussubtilisnatto)中，HU等[9]確定了D78、D84、D208和D212位天冬氨酸在保持MenA活性發(fā)揮重要作用，并通過定點(diǎn)突變技術(shù)獲得Q67R突變體，提高M(jìn)enA活力，促進(jìn)了MK-7的合成。在枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中，通過在不同位點(diǎn)增加menA開放閱讀框的拷貝數(shù)，MK-7的產(chǎn)量達(dá)到75 mg/L，相比于出發(fā)菌株提高了約2.3倍[10]。盡管MenA在MK-7的合成過程中起到重要作用，但是對(duì)MK-7合成途徑中關(guān)鍵基因性質(zhì)的研究還較少，限制了MK-7產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。

研究表明MK-7是細(xì)胞膜的組成成分[11]，在電子傳遞的過程中起到電子載體的作用[12]，但是關(guān)于MK-7進(jìn)出細(xì)胞膜的過程機(jī)制卻缺少相關(guān)報(bào)告[13]。針對(duì)此問題，結(jié)合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)MenA和MenH是MK-7合成途徑過程中的關(guān)鍵酶，并且通過(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)MenA和MenH的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)MenA具有8個(gè)明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域。為了確認(rèn)MenA和MenH在細(xì)胞中的定位，我們將MenA、MenH與eGFP進(jìn)行融合，通過綠色熒光蛋白分布確定MenA和MenH位于細(xì)胞膜中，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)MenA和MenH在細(xì)胞膜上出現(xiàn)隨機(jī)聚集的現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MenA與MenH位于細(xì)胞膜，并且MenH在細(xì)胞膜中呈現(xiàn)點(diǎn)狀分布。然后，利用表面活性劑Triton-100能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的特性，驗(yàn)證細(xì)胞膜的完整性對(duì)MK-7合成的影響。在發(fā)酵培養(yǎng)基中的Triton-100體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，MK-7的合成受到明顯的抑制。綜上所述，細(xì)胞膜的完整性是合成MK-7的前提，位于細(xì)胞膜上的MenA和MenH對(duì)MK-7在細(xì)胞膜中的合成發(fā)揮重要作用。

圖1 枯草芽孢桿菌中MK-7的合成途徑Fig.1 Synthetic pathway of MK-7 in B.subtilis

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

本實(shí)驗(yàn)所用出發(fā)菌株為B.subtilis168，克隆菌株為E.coliJM109，穿梭質(zhì)粒為pHT01。實(shí)驗(yàn)所用菌株、質(zhì)粒全部保藏于本實(shí)驗(yàn)室。

1.2 重組菌株構(gòu)建

以B.subtilis168的基因組為模板，擴(kuò)增menA的開放閱讀框(open reading frame, ORF)，使用linker“GSGGGGS”將獲得的ORF與egfp進(jìn)行融合，然后構(gòu)建在質(zhì)粒pHT01上。利用同樣的方式，分別構(gòu)建其他蛋白與eGFP的重組表達(dá)質(zhì)粒，使用天然啟動(dòng)子對(duì)menA基因進(jìn)行表達(dá)，使用Pveg啟動(dòng)子對(duì)menH基因進(jìn)行表達(dá)，用上述構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B.subtilis168，得到重組菌株。

1.3 熒光蛋白的檢測(cè)

將重組菌株接種到LB培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min培養(yǎng)12 h，然后8 000×g離心2 min收集菌體。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察熒光的分布，其中eGFP的激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，接收波長(zhǎng)507 nm。將獲得的綠色熒光圖片使用軟件ImageJ 1.52進(jìn)行處理。

1.4 MK-7的發(fā)酵

首先在14 mL圓底試管中加入3 mL LB培養(yǎng)基，接入獲得的重組菌株置于37 ℃搖床，220 r/min過夜培養(yǎng)。按照3%的接種量，把過夜培養(yǎng)的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，放入避光的搖床，220 r/min，40 ℃培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)量生長(zhǎng)情況與MK-7的產(chǎn)量。發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為(質(zhì)量分?jǐn)?shù))：5%葡萄糖，5%蔗糖，5%大豆蛋白胨，0.06% KH2PO4。為檢測(cè)細(xì)胞膜對(duì)MK-7產(chǎn)量的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的表面活性劑Triton-100，體積分?jǐn)?shù)分別是0.05%，0.1%，0.2%，0.5%，1%。

1.5 MK-7的提取與檢測(cè)

吸取發(fā)酵液到棕色離心管中，使用異丙醇和正己烷的混合物(體積比1∶2)以體積比4∶1的比例(有機(jī)物∶發(fā)酵液)萃取細(xì)胞中MK-7。將混合物用渦旋振蕩器劇烈振蕩10 min，然后以5 000×g離心5 min以分離有機(jī)相和水相，收集有機(jī)上清液用來檢測(cè)MK-7含量。檢測(cè)MK-7含量的儀器是配備有光子二極管陣列紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀(Agilent 1260，Santa Clara，CA，USA)，色譜柱為C18 ODS色譜柱(5 μm，250 mm×4.6 mm，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為40 ℃。甲醇∶二氯甲烷(體積比9∶1)用作流動(dòng)相，流速為1 mL/min。MK-7校準(zhǔn)曲線在1～100 mg/L呈線性關(guān)系(R2=0.998)。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于生物信息學(xué)分析MenA和MenH

課題組前期在強(qiáng)化MK-7合成實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)通過強(qiáng)化menA和menH的表達(dá)，能夠明顯促進(jìn)MK-7的合成，從而確定menA是MK-7合成過程中的關(guān)鍵基因[10]?；贐.subtilis168的基因組數(shù)據(jù)，MenA的性質(zhì)如下：MenA酶蛋白由311個(gè)氨基酸組成，其中帶有負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)的總共有14個(gè)，帶有正電荷的氨基酸(Arg+Lys)總共有20個(gè)。MenA的分子質(zhì)量為33.838 kDa，等電點(diǎn)為9.18，蛋白親水性平均值(grand average of hydropathicity, GRAVY)為0.718。對(duì)MenA的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)(http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，結(jié)果如圖2所示。MenA酶蛋白共具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，跨膜區(qū)集中在蛋白中部。

A-TMHMM預(yù)測(cè)MenA潛在的跨膜區(qū)域； B-TMHMM預(yù)測(cè)MenH潛在的跨膜區(qū)域圖2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)MenA和MenH的跨膜結(jié)構(gòu)域Fig.2 Prediction of transmembrane domains of MenA and MenH by bioinformatics

使用同樣的方法預(yù)測(cè)了MenH的性質(zhì)，結(jié)果如下：MenH酶蛋白由233個(gè)氨基酸組成，其中帶有負(fù)電荷氨基酸(Asp+Glu)的總共有29個(gè)，帶有正電荷的氨基酸(Arg+Lys)總共有31個(gè)。MenH的分子質(zhì)量為26.576 kDa，等電點(diǎn)為8.27，GRAVY為-0.367。對(duì)MenH的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖2-B所示，MenH酶蛋白沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)。

2.2 MenA和MenH的定位

為了驗(yàn)證MenA在細(xì)胞中的定位，首先在質(zhì)粒pHT01上使用天然啟動(dòng)子表達(dá)menA，獲得重組質(zhì)粒pHT01-Pnative-menA-eGFP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入B.subtilis168中，然后將重組菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min培養(yǎng)12 h。發(fā)酵結(jié)果顯示，強(qiáng)化表達(dá)menA之后，細(xì)胞的生長(zhǎng)并未受到影響(圖3-A)。利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光的分布，發(fā)現(xiàn)熒光信號(hào)出現(xiàn)在細(xì)胞膜上，而且是均勻的分布在細(xì)胞膜上(分別利用CtaD和YuxO作為陽性和陰性對(duì)照)(圖3-C)，說明MK-7支鏈結(jié)構(gòu)和骨架結(jié)構(gòu)的結(jié)合是發(fā)生在細(xì)胞膜上的。

MenH在MK-7合成的過程中起到提供甲基的作用，催化整個(gè)過程中的最后一步。根據(jù)生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，MenH并沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，應(yīng)該游離于整個(gè)細(xì)胞中。為了驗(yàn)證MenH在細(xì)胞中的定位，使用同樣的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒pHT01-Pveg-menH-eGFP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入B.subtilis168中，然后將重組菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下220 r/min培養(yǎng)。結(jié)果顯示過表達(dá)menH對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)沒有明顯的影響(圖3-B)。培養(yǎng)12 h之后，在激光共聚焦熒光顯微鏡的下觀察熒光的分布，根據(jù)熒光定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果，MenH同樣位于細(xì)胞膜上，但是有些熒光在細(xì)胞中呈現(xiàn)聚集分布。這一分布特點(diǎn)與MenA不同，MenA均勻的分布在細(xì)胞膜上，而MenH則是隨機(jī)地在細(xì)胞中出現(xiàn)聚集(圖3-C)。

2.3 不同濃度表面活性劑對(duì)MK-7合成的影響

表面活性劑Triton-100是一類非離子型表面活性劑，能夠促進(jìn)脂類物質(zhì)的溶解，從而破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)。為了檢測(cè)不同狀態(tài)的細(xì)胞膜對(duì)MK-7合成的影響，我們?cè)贛K-7發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的表面活性劑Triton-100。由于加入不同濃度的表面活性劑之后，細(xì)胞的生長(zhǎng)的受到不同程度的抑制，導(dǎo)致細(xì)胞的生長(zhǎng)很難統(tǒng)一，所以只對(duì)最大生長(zhǎng)OD600值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如圖4-A所示，當(dāng)加入表面活性劑時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)和MK-7的合成均受到不同程度的抑制。當(dāng)Triton-100體積分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)，MK-7的產(chǎn)量受到明顯的抑制，僅為野生型的36.9%。特別是當(dāng)Triton-100的體積分?jǐn)?shù)達(dá)到0.5%時(shí)，細(xì)胞的OD600值最高僅為5.6，且?guī)缀鯔z測(cè)不到MK-7的合成(圖4-B)。當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)受到破壞時(shí)，對(duì)MenA和MenH的定位產(chǎn)生影響，從而影響到MK-7的合成。這些結(jié)果表明，完整的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)是高效合成MK-7的前提條件。

A-不同濃度Triton-100對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響； B-不同濃度Triton-100對(duì)菌株合成MK-7的影響圖4 不同濃度表面活性劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和MK-7合成的影響Fig.4 Effects of different concentrations of surfactants on cell growth and synthesis of MK-7

3 結(jié)論

MK-7作為脂溶性維生素K2的重要亞型，主要分布于細(xì)胞的細(xì)胞膜中，起到電子傳遞的作用[14]。然而，對(duì)于MK-7如何進(jìn)入到細(xì)胞膜中并沒有明確的報(bào)道。MenA可能在MK-7進(jìn)入細(xì)胞膜的過程中起著關(guān)鍵作用，其作用是使胞內(nèi)游離的DHNA與不同長(zhǎng)度異戊二烯組成的側(cè)鏈進(jìn)行融合，形成2-脫甲基萘醌。MenA屬于異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的UbiA家族(IPR000537)，包括了來源于細(xì)菌中的4-羥基苯甲酸酯八烯基轉(zhuǎn)移酶(UbiA)[15]，酵母中的對(duì)羥基苯甲酸酯聚異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶(COQ2)[16]。根據(jù)已知晶體結(jié)構(gòu)的UbiA家族的，通過同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)包含兩個(gè)富含天冬氨酸的保守催化位點(diǎn)，能夠催化反式異戊二烯基轉(zhuǎn)移酶的活性，分別是NDXXDXXXD和DXXXD。

生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MenA具有8個(gè)跨膜區(qū)，分布在細(xì)胞膜上。本研究將MenA與eGFP進(jìn)行融合，通過熒光的位置確定MenA的分布。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MenA位于細(xì)胞膜上，與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。在E.coli中通過敲除回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)，并通過收集細(xì)胞膜碎片，在細(xì)胞膜碎片中發(fā)現(xiàn)了MenA的活性，證實(shí)了MenA位于細(xì)胞膜內(nèi)，并證明含有MenA的細(xì)胞能夠在厭氧的環(huán)境中生長(zhǎng)[17]。在結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)中，使用同位素1-3H標(biāo)記的法尼基焦磷酸(farnesylpyrophosphate, FPP)或者香葉基焦磷酸(geranylgeranylpyrophosphate, GGPP)作為底物時(shí)，發(fā)現(xiàn)90%的MenA活力存在于富含細(xì)胞碎片的組分中，同樣也證實(shí)了MenA位于細(xì)胞膜中[18]。在本研究中，通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入表面活性劑破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MK-7的合成受到明顯的抑制，說明細(xì)胞膜的存在對(duì)MK-7的合成具有重要作用。

MenH作為催化MK-7合成過程最后一步的關(guān)鍵酶，起到轉(zhuǎn)移甲基的作用。在恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)中，與甲萘醌合成相關(guān)的酶位于細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)域上，包括甲基轉(zhuǎn)移酶MenG和甲萘醌還原酶MenJ[19]。其中MenG的分布與MenA并不相同，MenA分布在常規(guī)質(zhì)膜(包含膜磷脂與細(xì)胞壁)上。研究證明僅當(dāng)存在額外拷貝的menG時(shí)，才能夠在基因組上敲除menG，說明menG是恥垢分歧桿菌的必需基因[19]。在本研究中，我們依據(jù)生物信息學(xué)對(duì)MenH的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MenH不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，但是熒光定位實(shí)驗(yàn)顯示MenH同樣位于細(xì)胞膜上。推測(cè)MenH可能是與枯草芽孢桿菌的膜蛋白互作，然后錨定在細(xì)胞膜上。本研究證明MenA 和MenH均位于細(xì)胞膜上，對(duì)MK-7在細(xì)胞膜中合成的過程中發(fā)揮作用，而且細(xì)胞膜的完整性對(duì)MK-7的合成具有重要作用。由于MenA和MenH在定位在細(xì)胞膜中方式不相同，MenH是如何與膜蛋白進(jìn)行互作，以及哪種因素影響MenA和MenH在細(xì)胞膜中的定位是下一步的研究重點(diǎn)。