糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)研究

方紅輝，倪曄，周婕妤，董晉軍，許國(guó)超，張兆俊，韓瑞枝*

1(江南大學(xué),工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(丹陽(yáng)市金丹陽(yáng)酒業(yè)有限公司，江蘇 丹陽(yáng)，212300)

尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶(uridine diphosphate glycosyltransferase，UGT)能夠催化糖基配體從活化的核苷酸糖基供體轉(zhuǎn)移到特定的受體分子上，從而調(diào)節(jié)受體的特性(如生物活性/溶解度和轉(zhuǎn)運(yùn)等)[1-2]。大部分UGT來(lái)源于植物或者動(dòng)物，野生株產(chǎn)量不能滿足工業(yè)化要求，因此需要通過微生物異源表達(dá)提高UGT的產(chǎn)量。目前限制UGT工業(yè)生產(chǎn)的主要因素為異源表達(dá)可溶性差，表達(dá)量低以及需要昂貴的尿苷二磷酸葡萄糖(uridine diphosphate glucose，UDPG)作為供體[3]。通過與蔗糖合酶(sucrose synthase，SUSy)的偶聯(lián)可實(shí)現(xiàn)UDPG的循環(huán)再生[4-5]，但是可溶性表達(dá)差的問題至今仍未有效解決。擬南芥來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5可以催化肉桂醇，油菜素類固醇，人參二醇和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇等的糖基化，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和保健食品中[6-9]。但是UGT73C5在大腸桿菌中異源表達(dá)大多以無(wú)活性的包涵體形式存在，嚴(yán)重限制了其工業(yè)應(yīng)用。

一般來(lái)說(shuō)，包涵體形成一般是由于蛋白翻譯過程中表達(dá)過快或者缺失一定的后修飾從而導(dǎo)致不正確或不充分的折疊[10]。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件[如初始細(xì)胞密度、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度]可在一定程度上改善蛋白可溶性表達(dá)，但通常效果甚微。分子伴侶共表達(dá)與助溶蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)是目前研究最多的蛋白可溶性改善方法[11-12]。LASKEY等[13]在非洲爪蟾卵的浸出液中發(fā)現(xiàn)了分子伴侶蛋白，如GroES、GroEL、DnaK、DnaJ、GrpE和觸發(fā)因子(trigger factor，TF)等，可參與協(xié)助生物大分子的折疊、組裝、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解等過程，從而極大程度提高目的蛋白的可溶性表達(dá)。這些分子伴侶對(duì)體外模型蛋白的正確折疊、聚集和組裝具有顯著影響[14-16]。例如，伴侶質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2可以顯著提高TtSPase的可溶性表達(dá)[17]，通過與pGro7共表達(dá)，4-α-葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)量提高了24.6倍[18]。另外，一些高度可溶的蛋白與目的蛋白融合表達(dá)時(shí)對(duì)目的蛋白具有助溶效果，這些蛋白往往被設(shè)計(jì)為助溶標(biāo)簽[19]。硫氧還蛋白Trx-tag，是一種分子質(zhì)量為12 kDa的氧化還原蛋白，可催化還原蛋白質(zhì)二硫鍵，促進(jìn)目的蛋白二硫鍵的形成[20]；谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽蛋白GST-tag是一個(gè)大小為26 kDa左右的轉(zhuǎn)移酶，本身在大腸桿菌中可大量可溶性表達(dá)，同時(shí)也可以提高共表達(dá)的蛋白可溶性。在大多數(shù)情況下，該標(biāo)簽的存在還有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩(wěn)定性[21]。研究發(fā)現(xiàn)融合Trx標(biāo)簽的人胰島素可溶性表達(dá)明顯提高[22]，融合GST后人干擾素蛋白可實(shí)現(xiàn)70%的可溶表達(dá)[23]。

本研究將UGT73C5在EscherichiacoliBL21(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)，通過與分子伴侶共表達(dá)以及與助溶蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)等方法提高其可溶性表達(dá)，并對(duì)不同方法表達(dá)效果進(jìn)行了比較。最后，對(duì)融合酶GST-UGT73C5催化2 mmol/L肉桂醇糖基化合成絡(luò)塞的反應(yīng)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中用到的質(zhì)粒和菌株如表1所示。來(lái)自擬南芥的UDP糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5 (GenBank:NP_181218.1)基因，上海亦欣生物技術(shù)有限公司優(yōu)化合成。載體質(zhì)粒pET-28a(+)、pET-32b(+)和pET-42b(+)，本實(shí)驗(yàn)室收藏，E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)菌株分別用作質(zhì)粒構(gòu)建和目的基因表達(dá)的宿主。4種含有分子伴侶基因的質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2，寶生物工程(大連)有限公司。肉桂醇及絡(luò)塞，上海源葉生物有限公司。UDPG，廣東昂飛生物有限公司。

表1 本研究中使用的質(zhì)粒和菌株Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組UGT73C5菌株的構(gòu)建

將合成的UGT73C5基因克隆至載體pET-28a(+)中的限制性位點(diǎn)BamH I和XhoI之間構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-UGT73C5，并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)中構(gòu)建UGT73C5重組表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-UGT73C5)。

1.2.2 UGT73C5與分子伴侶共表達(dá)菌株的構(gòu)建

將pET28a-UGT73C5質(zhì)粒分別和pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2這4種伴侶質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞并涂布至含有50 μg/mL卡那霉素和20 μg/mL氯霉素雙抗生素的平板中構(gòu)建分子伴侶共表達(dá)菌株，分別命名為E.coliBL21(DE3)/pG-KJE8/pET28a-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-KJE8/UGT73C5)、E.coliBL21(DE3)/pGro7/pET28a-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-RO7/UGT73C5)、E.coliBL21(DE3)/pKJE7/pET28a-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-KJE7/UGT73C5)和E.coliBL21(DE3)/pG-TF2/pET28a-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-TF2/UGT73C5)。

1.2.3 Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5融合表達(dá)菌株的構(gòu)建

本研究中所用到的引物見表2。質(zhì)粒載體pET-32b(+)、pET-42b(+)分別帶有助溶蛋白標(biāo)簽：硫氧還蛋白標(biāo)簽(thioredoxin tag， Trx-tag)和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移蛋白標(biāo)簽(glutathione mercapto transfer protein tag，GST-tag)。通過PCR擴(kuò)增pET28a-UGT73C5中的目的基因(UGT73C5)，并通過ClonExpress Ⅱ一步克隆試劑盒克隆至載體pET-32b(+)與pET-42b(+)的雙酶切位點(diǎn)BamH I和XhoI之間，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32b-UGT73C5和pET42b-UGT73C5。將這些重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，并分別涂布至帶有100 μg/mL氨芐青霉素和50 μg/mL卡那霉素的LB平板中以構(gòu)建Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5融合酶表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3)/pET32b-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-Trx-UGT73C5)和E.coliBL21(DE3)/pET42b-UGT73C5(簡(jiǎn)稱BL21-GST-UGT73C5)。

表2 本研究中使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.2.4 重組酶的表達(dá)與純化

將不同的重組大腸桿菌表達(dá)菌株在含有相應(yīng)抗生素的40 mL LB培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600=0.8～0.9時(shí)，加入0.2 mmol/L IPTG(分子伴侶共表達(dá)菌株需加入0.5～4 mg/mLL-阿拉伯糖和/或1～10 ng/mL四環(huán)素)，于16 ℃、200 r/min搖床中誘導(dǎo)20 h。通過離心(8 000 r/min、5 min)收集細(xì)胞，將細(xì)胞重懸于8 mL PBS緩沖液(pH 7.5)中，并在冰水浴中超聲處理10 min。離心分離上清液與沉淀，并經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)一步分析。重組酶UGT73C5、Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5通過Ni-NTA親和層析純化。

1.2.5 大腸桿菌細(xì)胞光密度與細(xì)胞濕重、干重的關(guān)系

細(xì)胞濕重：收集不同體積的大腸桿菌培養(yǎng)液(10、20、30、40、50、60、70 mL)，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，將離心管倒置于清潔的吸水紙上約數(shù)分鐘，擦凈管壁上水漬，隨即稱量，細(xì)胞濕重等于稱量的質(zhì)量減去已預(yù)先稱重的離心管質(zhì)量。將已稱量的濕細(xì)胞重懸于20 mL PBS緩沖液中以配制不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞溶液，充分混勻，吸取1 mL重懸的溶液稀釋10倍后測(cè)定其在600 nm下的吸光度，并繪制細(xì)胞濕重與細(xì)胞光密度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

細(xì)胞干重：收集不同體積的大腸桿菌培養(yǎng)液(10、20、30、40、50、60、70 mL)，12 000 r/min離心10 min，棄上清液，用去離子水洗滌沉淀兩次，凍干備用。稱取不同質(zhì)量的凍干細(xì)胞重懸于20 mL PBS緩沖液中，以配制不同質(zhì)量濃度的細(xì)胞溶液并測(cè)定600 nm下的吸光度，并繪制細(xì)胞干重與細(xì)胞光密度之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

細(xì)胞光密度(OD600)與細(xì)胞干重、濕重呈良好線性關(guān)系，如圖1所示。

圖1 大腸桿菌細(xì)胞光密度(OD600)與細(xì)胞干重、 濕重的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve between E.coli cell optical density (OD600) and dry/wet weight cells

1.2.6 酶活力分析

高速離心收集40 mL LB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)后的菌體細(xì)胞并棄盡上清液，重懸于8 mL PBS (100 mmol/L，pH 7.5)緩沖液中，稀釋25倍測(cè)定其在600 nm下的吸光度并換算成其細(xì)胞干重。超聲破碎后離心獲取上清液，將含有100 mmol/L PBS (pH 7.5)、10 mmol/L肉桂醇、5 mmol/L UDPG和30 μL上清酶液的反應(yīng)混合液(總體系300 μL)于40 ℃反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后加入600 μL甲醇以淬滅反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)12 000 r/min離心5 min并通過0.22 μm濾膜過濾后，通過HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。酶活力單位(U)定義為每分鐘產(chǎn)生1 μmol絡(luò)塞所需的酶量，酶活力(U/g細(xì)胞)定義為單位質(zhì)量細(xì)胞干重所具有的酶活力。

酶的比活力通過含有100 mmol/L PBS (pH 7.5)、10 mmol/L肉桂醇、5 mmol/L UDPG和0.02 mg/mL純酶的反應(yīng)混合液(總體系300 μL)在40 ℃反應(yīng)10 min測(cè)定。蛋白濃度采用Bradford法測(cè)定，比活力(U/mg 蛋白)指的是單位質(zhì)量的酶所對(duì)應(yīng)的活力。

1.2.7 融合酶在絡(luò)塞合成中的應(yīng)用

取相同質(zhì)量的BL21-UGT73C5和BL21-GST-UGT73C5細(xì)胞，分別重懸于8 mL PBS (100 mmol/L，pH 7.5)緩沖液中，配制成細(xì)胞濃度為15 g/L的懸浮液，破碎離心后獲取上清液。將含有100 mmol/L PBS (pH 7.5)、2 mmol/L肉桂醇、10 mmol/L UDPG和2.5 mL上清液酶液(總體系為5 mL)的混合液于40 ℃反應(yīng)，在0.5、1、2、4、6、8、10、12 h分別取樣并加入甲醇以淬滅反應(yīng)。反應(yīng)液經(jīng)12 000 r/min離心5 min，并通過0.22 μm濾膜過濾后，通過HPLC分析反應(yīng)產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：Mp表示生成絡(luò)塞的物質(zhì)的量濃度，mmol/L；Ms表示剩余底物肉桂醇的物質(zhì)的量濃度，mmol/L。

1.2.8 HPLC檢測(cè)方法

使用HPLC 1260系統(tǒng)(Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA)和Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)對(duì)底物肉桂醇和糖基化產(chǎn)物絡(luò)塞進(jìn)行定量測(cè)定。肉桂醇和絡(luò)塞的洗脫條件如下：50%溶劑A(H2O)；50%溶劑B(乙腈)；流速1 mL/min；吸光度254 nm；柱溫30 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 UGT73C5在大腸桿菌中的表達(dá)及活力表征

BL21-UGT73C5菌株的表達(dá)情況如圖2所示，在破碎沉淀中，大約在56 kDa有一條明顯條帶，與理論UGT73C5的分子質(zhì)量相近，而上清液中在該位置無(wú)明顯條帶。這說(shuō)明大多數(shù)UGT73C5蛋白以不溶性包涵體形式存在。因此，增加UGT73C5可溶性表達(dá)是非常必要的。本研究中，通過HPLC檢測(cè)UGT73C5對(duì)肉桂醇的糖基化活力，并以上清液酶活力表征可溶性蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明，反應(yīng)產(chǎn)物與絡(luò)塞標(biāo)準(zhǔn)品具有相同的保留時(shí)間(大約2.5 min)，而在對(duì)照樣品中[E.coliBL21(DE3)/pET-28a (+)空載誘導(dǎo)表達(dá)]未檢測(cè)到新產(chǎn)物的生成(圖3)。通過產(chǎn)物絡(luò)塞的標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析，UGT73C5在大腸桿菌中表達(dá)的酶活力為18.56 U/g細(xì)胞。

圖2 UGT73C5在E.coli BL21(DE3)中異源表達(dá)的 SDS-PAGEFig.2 Analysis of SDS-PAGE of UGT73C5 in E.coli BL21(DE3)

圖3 UGT73C5催化肉桂醇糖基化反應(yīng)的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of cinnamyl alcohol glycosylation by UGT73C5

2.2 分子伴侶共表達(dá)提高UGT73C5可溶性表達(dá)

為了改善UGT73C5的可溶性表達(dá)，研究了UGT73C5與4個(gè)伴侶蛋白質(zhì)粒(pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2)的共表達(dá)情況。如圖4-a所示，SDS-PAGE結(jié)果表明4種分子伴侶質(zhì)粒與UGT73C5共表達(dá)成功。如圖4-b所示，UGT73C5的原始酶活力為18.56 U/g細(xì)胞，添加分子伴侶蛋白質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7和pG-TF2后的酶活力分別為原始酶活力的1.27、1.18、0.91、1.37倍。其中質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2中均含有分子伴侶GroES-GroEL、GroEL的內(nèi)腔可以與變性多肽結(jié)合，在輔因子GroES調(diào)節(jié)的ATP依賴性反應(yīng)中釋放。GroES和GroEL作為折疊酶與多肽相互作用并幫助正確重新折疊[24]，GroES-GroEL可以作為mRNA穩(wěn)定劑來(lái)增加蛋白質(zhì)的產(chǎn)生[25]。與pGro7相比，pG-KJE8與UGT73C5共表達(dá)后可溶性提高更為明顯(圖4-b)。原因可能是在GroES-GroEL和DnaK-DnaJ-GrpE伴侶蛋白共同輔助下，UGT73C5折疊方面表現(xiàn)更為良好。DnaK還可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，以供GroEL進(jìn)行后續(xù)折疊[26]。GroES-GroEL和DnaK-DnaJ-GrpE在大多數(shù)蛋白質(zhì)的折疊和組裝中具有互補(bǔ)功能[27]。與pG-TF2共表達(dá)導(dǎo)致更高的可溶性UGT73C5表達(dá)，可能是因?yàn)橛|發(fā)因子TF可以識(shí)別肽底物中的芳香族和堿性氨基酸殘基，然后與肽結(jié)合[28]，進(jìn)一步避免錯(cuò)誤折疊，保護(hù)新生鏈不被蛋白酶消化，并與其他伴侶合作協(xié)助折疊。因此，伴隨TF (pG-TF2)的GroES-GroEL在體內(nèi)對(duì)UGT73C5產(chǎn)生積極影響。

2.3 重組Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5融合蛋白的表達(dá)

雖然與分子伴侶共表達(dá)后的UGT73C5的可溶性表達(dá)有一定程度的改善，但效果并不明顯。本研究進(jìn)一步通過UGT73C5與Trx-tag (12 kDa)和GST-tag (26 kDa)分別融合表達(dá)，結(jié)果如圖5-a所示。融合酶Trx-UGT73C5的包涵體含量仍然較高，但上清液中表達(dá)量較原始UGT73C5表達(dá)情況有明顯提高。融合酶GST-UGT73C5在16 ℃下表達(dá)，幾乎沒有包涵體存在，而在上清液中觀察到更多的蛋白表達(dá)。為了進(jìn)一步提高其表達(dá)效果，提高誘導(dǎo)表達(dá)的溫度至25 ℃，GST-UGT73C5蛋白含量顯著提高，雖然有少部分包涵體出現(xiàn)，但大部分仍以可溶形式存在。如圖5-b所示，融合酶Trx-UGT73C5酶活力為26.95 U/g細(xì)胞，是原始酶活力的1.45倍；在25 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的GST-UGT73C5酶活力達(dá)到47.17 U/g細(xì)胞，是原始酶活力的2.54倍。為了研究融合標(biāo)簽蛋白對(duì)UGT73C5比酶活力的影響，測(cè)定了純化后的GST-UGT73C5和Trx-UGT73C5以及原始酶UGT73C5的比活力。結(jié)果如表3所示，Trx-UGT73C5和GST-UGT73C5比活力分別為0.68、 0.72 U/mg蛋白，是原始酶比活力(0.79 U/mg蛋白)的0.86、0.91倍。以上結(jié)果表明助溶蛋白標(biāo)簽對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5的N端修飾能夠明顯提高其可溶性表達(dá)，并且助溶蛋白(尤其是GST)對(duì)UGT73C5自身的催化活力沒有顯著影響，無(wú)需切割分離。

a-分子伴侶共表達(dá)SDS-PAGE分析；b-分子伴侶共表達(dá)酶活力分析 [1-BL21-UGT73C5 (16 ℃);2-BL21-KJE8/UGT73C5 (16 ℃)； 3-BL21-RO7/UGT73C5 (16 ℃)；4-BL21-KJE7/UGT73C5 (16 ℃)； 5-BL21-TF2/UGT73C5 (16 ℃)]圖4 UGT73C5與不同分子伴侶共表達(dá)后蛋白表達(dá)及酶活力分析Fig.4 Analysis of protein expression and activities of UGT73C5 co-expressed with different molecular chaperones

a-融合酶SDS-PAGE；b-融合酶活力分析 [1-BL21-UGT73C5 (16 ℃);2-BL21-Trx-UGT73C5 (16 ℃); 3-BL21-GST-UGT73C5 (16 ℃);4-BL21-GST-UGT73C5 (25 ℃)]圖5 UGT73C5與Trx和GST融合后蛋白表達(dá)及酶活力分析Fig.5 Analysis of protein expression and activities of UGT73C5 fused with Trx and GST

表3 融合酶的純酶比活力Table 3 Specific activities of purified fusion enzymes

2.4 融合酶GST-UGT73C5在絡(luò)塞合成中的應(yīng)用

分別將融合酶GST-UGT73C5和原始酶應(yīng)用于2 mmol/L肉桂醇糖基化合成絡(luò)塞的反應(yīng)。如圖6-a所示，純化后GST-UGT73C5(0.2 mg/mL)在6 h后能夠轉(zhuǎn)化96.3%的肉桂醇為絡(luò)塞，與純化后原始酶(0.2 mg/mL)轉(zhuǎn)化率一致，說(shuō)明增加融合標(biāo)簽GST后，對(duì)催化肉桂醇糖基化沒有影響。對(duì)相同濃度細(xì)胞破碎后的GST-UGT73C5和原始酶粗酶催化反應(yīng)比較(圖6-b)發(fā)現(xiàn)，GST-UGT73C5在4 h內(nèi)轉(zhuǎn)化率就達(dá)到90.7%，6～12 h維持在93.6%，而原始酶在12 h轉(zhuǎn)化率才達(dá)到88.5%。結(jié)果表明單位質(zhì)量菌體融合酶GST-UGT73C5較原始酶具有更高的表達(dá)量，從而導(dǎo)致更高的轉(zhuǎn)化率。因此，融合酶GST-UGT73C5在酶法合成絡(luò)塞的應(yīng)用中具有更大的潛力。

a-GST-UGT73C5與UGT73C5的純酶反應(yīng)比較；b-同等濃度 BL21-GST-UGT73C5與BL21-UGT73C5細(xì)胞破碎上清液反應(yīng)比較圖6 GST-UGT73C5與UGT73C5催化肉桂醇糖基化的反應(yīng)分析Fig.6 Analysis of cinnamyl alcohol glycosylation reaction catalyzed by GST-UGT73C5 and UGT73C5

3 結(jié)論

糖基轉(zhuǎn)移酶UGT73C5可以催化肉桂醇的糖基化合成絡(luò)塞，然而異源表達(dá)可溶性差限制了其工業(yè)應(yīng)用價(jià)值，為提高UGT73C5在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，本研究通過分子伴侶共表達(dá)和助溶蛋白標(biāo)簽融合表達(dá)的方式改善了UGT73C5可溶性差的問題。3種商業(yè)化的分子伴侶蛋白質(zhì)粒pG-KJE8、pGro7和pG-TF2對(duì)UGT73C5的可溶性表達(dá)均有一定程度促進(jìn)作用，其中pG-TF2表達(dá)的伴侶蛋白組合GroES-GroEL-Tig效果最好，表達(dá)量為原始酶可溶性表達(dá)量的1.37倍；融合表達(dá)了兩種助溶蛋白標(biāo)簽硫氧還蛋白Trx-tag和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移蛋白GST-Tag，其中融合蛋白GST-UGT73C5可溶性表達(dá)量最高，在25 ℃誘導(dǎo)條件下，為原酶初始表達(dá)量的2.54倍。純化后GST-UGT73C5比活力與原酶相比沒有明顯下降，表明該N端修飾對(duì)其自身的催化活力沒有顯著影響，無(wú)需切割分離。在2 mmol/L肉桂醇催化反應(yīng)中，同等細(xì)胞濃度的GST-UGT73C5粗酶液比原始酶UGT73C5粗酶液具有更高的轉(zhuǎn)化效率。GST-UGT73C5粗酶催化反應(yīng)在4 h內(nèi)催化肉桂醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%以上，最高可達(dá)93.6%，而原始酶在12 h才達(dá)到88.5%。因此，融合酶GST-UGT73C5可能成為絡(luò)塞酶法合成中更具有應(yīng)用潛力的酶。