組蛋白修飾調控53BP1與染色質結合功能的研究進展

陳思龍，黃溥婉，李莉萍

1廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院廣東省醫(yī)學分子診斷重點實驗室，廣東 東莞 523808；2珠海中西醫(yī)結合醫(yī)院檢驗科，廣東 珠海 519000；3廣東醫(yī)科大學醫(yī)學技術學院，廣東 東莞 523808

DNA 是細胞生命周期中最重要的生物大分子。在真核細胞中，DNA 濃縮成染色質［1］。染色質的核心單位是核小體，它由146 bp的DNA纏繞組蛋白八聚體1.75圈而形成［2］。組蛋白八聚體由組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個分子構成，它是真核細胞染色體中核小體的核心顆粒［3］。DNA在代謝的過程中，會受到外源性損傷因子和內源性DNA損傷的影響，如電離輻射、紫外線輻射、化學試劑、DNA 去嘌呤化等。一旦DNA發(fā)生損傷而不能被及時修復時，細胞將發(fā)生衰老、自噬和凋亡［4］。

DSB 是引發(fā)基因組不穩(wěn)定的最主要因素，而DSB 修復途徑對基因組完整性的維持至關重要［5］。真核生物修復DSB 主要有兩種途徑：同源重組（homologous recombination，HR）修復和非同源末端連接（non-homologous end-joining，NHEJ）修復。NHEJ 修復在G1 期占主導地位，而HR 修復在S、G2期更具優(yōu)勢［6］。在細胞周期的不同時期，DNA損傷信號引起的組蛋白修飾不同。而不同的組蛋白修飾將決定p53結合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）或乳腺癌1易感蛋白（breast cancer type 1 susceptibility protein，BRCA1）是否結合到受損的染色質中。在G1期，53BP1結合到DNA末端，保護DNA末端免受核酸酶切割處理，這有利于NHEJ修復途徑的順利進行。而在S、G2期，BRCA1結合到DSB位點并啟動末端切除，從而推動HR 修復的進行［7］。確定組蛋白修飾如何調節(jié)這兩個過程，對于理解DSB修復過程和尋找新的癌癥治療方法至關重要。

53BP1 在DSB 位點的募集主要受幾種修復調節(jié)因子的影響，如共濟失調毛細血管擴張突變（ataxia-telangiectasia mutated，ATM）和RAP1 相互作用因子1（RAP1-interacting factor 1，RIF1）［8］。53BP1與染色質的結合被認為主要受幾個組蛋白修飾的調節(jié)。例如，53BP1 的Tudor 結構域識別H4K20me2過程，是53BP1結合染色質最關鍵的步驟［8］。H2AK15ub 增強了53BP1 與受損染色質的結合，其泛素化過程是由E3 連接酶RNF8 和RNF168 催化的［9］。然而，參與53BP1 與染色質結合的組蛋白修飾遠不止這兩種。通過單獨或者聯(lián)合抑制組蛋白的修飾，人們發(fā)現(xiàn)H3K18、H3K56、H4K16 乙酰化以及H4K16 甲基化也參與調節(jié)53BP1 與染色質的結合［8，10-11］。因此，本文將重點闡述53BP1募集分子機制和組蛋白修飾對53BP1結合染色質的影響。

1 53BP1的結構

53BP1 由1 972 個氨基酸組成，其N 端富含絲/蘇氨酸-谷氨酰胺，具有ATM、RIF1、Pax反活化域相互作用蛋白（pax transactivation-domain interacting protein，PTIP）以及細胞周期依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDK）等重要激酶的磷酸化調控位點［12］。foci 形成區(qū)（foci-forming region，F(xiàn)FR）是53BP1 募集的重要結構域。FFR 包括寡聚域（oligomerization domain，OD）、串聯(lián)的Tudor 結構域以及泛素化依賴的基序（ubiquitination dependent recruitment，UDR）［13-15］。C 端由兩個串聯(lián)的BRCA1羧基末端（BRCA1 carboxyl-terminal，BRCT）結構域組成，是53BP1和其他蛋白質相互作用的區(qū)域［16］。

2 53BP1募集的分子機制

2.1 53BP1乙?；土姿峄?/h3>

53BP1的翻譯后修飾可決定其能否募集到DSB位點，而乙?；瘎t是最常見的修飾之一。經過質譜分析，CREB結合蛋白（CREB binding protein，CBP）可以促使53BP1 的重要結構域Tudor 和UDR 的賴氨酸1626/1628殘基發(fā)生乙?；?3BP1賴氨酸1626/1628殘基乙?；?，53BP1與核小體之間的相互作用被阻礙。當發(fā)生DSB時，53BP1的乙酰化過程受到調控。組蛋白去乙?；?（histone deacetylase，HDAC2）是使53BP1 去乙?；年P鍵因子［15］。在HDAC2 的作用下，53BP1才被允許募集到受損的染色質中。

53BP1 在不同細胞周期進程中發(fā)生不同的修飾。在有絲分裂過程中，53BP1的UDR 基序磷酸化后，可避免53BP1 過早地募集到染色質中。在有絲分裂早期和中期，53BP1的UDR基序的蘇氨酸1609和絲氨酸1618 殘基處于磷酸化狀態(tài)［17］。已有相關文獻表明，UDR 基序磷酸化是由CDK1 和polo 樣激酶1（polo like kinase 1，PLK1）聯(lián)合介導的［18-19］。在有絲分裂后期和末期，蛋白磷酸酶4 的催化亞基（protein phosphatase 4 catalytic subunit，PP4C）發(fā)生磷酸化。隨后，PP4C 使UDR 基序絲氨酸1618 殘基去磷酸化［17，20］。當細胞進入G1 期，53BP1 去磷酸化徹底完成，并恢復其在DNA 損傷反應（DNA damage response，DDR）中的功能。

2.2 53BP1募集過程

在DNA 發(fā)生損傷前，53BP1 的Tudor 結構域被Tudor 相互作用修復調節(jié)因子（Tudor-interacting repair regulator，TIRR）掩蓋［21］。TIRR 是53BP1 募集的抑制劑，它調控53BP1 在DNA 損傷前后的募集［21-22］。由于Tudor 結構域與TIRR 相結合，這阻礙了53BP1 與H4K20me2 的結合［23-27］。此外，組蛋白H3K18、H3K56 和H4K16 均處于乙?；癄顟B(tài)，共同阻止53BP1 與染色質的結合［8，10，28］。組蛋白H4K20me2與53BP1的結合位點被甲基賴氨酸結合蛋白1（methyl-Lysine binding protein 1，L3MBTL1）和賴氨酸去甲基酶4A（lysine demethylase 4a，KDM4A）掩蓋［29-30］。當DNA發(fā)生損傷時，由減數分裂重組蛋白11（meiotic recombination 11，MRE11）、DNA 損傷修復蛋白50（DNA repair protein 50，RAD50）、尼梅亨斷裂綜合征基因1（Nijmegen breakage syndrome 1，NBS1）組成的MRN 復合體和DNA 依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）共同識別DSB 末端，并激活ATM［31］。ATM 介導53BP1 的磷酸化，并與RIF1 共同促進53BP1-TIRR 復合體的解離［22-23］。同時，ATM迅速磷酸化組蛋白H2A的絲氨酸139殘基，使之轉變?yōu)棣肏2AX。γH2AX 持續(xù)放大損傷信號，并通過蛋白質相互作用網絡招募DNA 損傷檢查點蛋白調節(jié)子1（mediator of DNA damage checkpoint protein 1，MDC1）［32］。此外，ATM 還激活了檢查點激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）。CHK1 使抗沉默因子1A（anti-silencing function 1a，ASF1A）發(fā)生磷酸化［33］。磷酸化的ASF1A 與MDC1的相互作用增強了MDC1與ATM的相互作用，繼而使MDC1-RNF8-RNF168-組蛋白泛素化-53BP1軸的信號級聯(lián)反應激活［34］（圖1）。MDC1 促使泛素連接酶RNF8 和RNF168 募集到受損染色質［35］。SIRT3以RNF8 依賴的方式被募集到染色質中［10］。SIRT7以聚（ADP-核糖）聚合酶1［poly（ADP-ribose）polymerase 1，PARP1］依賴的方式被募集到受損染色質中［36］。SIRT3和SIRT7分別介導H3K56和H3K18去乙?；?。HDAC 介導H4K16ac 去乙酰化。隨后，GLP以ATM依賴的方式募集到受損染色質中，介導H4K16甲基化［37］。H4K16me1提高了53BP1的Tudor結構域對H4K20me2的親和力［8］。同時，H4K20me2以依賴RNF8 的方式與L3MBTL1 和KDM4A 解離，并暴露其識別53BP1 的結合位點［38-39］。RNF8 和RNF168 共同促使H2AK15 泛素化為H2AK15ub［40］。53BP1 通過其UDR 基序和Tudor 結構域分別與H2AK15ub和H4K20me2結合［41-42］（圖2）。53BP1從核質轉移到受損染色質中，并與下游因子相互作用。RIF1被募集到DSB 位點，與53BP1的N端相互作用［43］。REV7（DNA 聚合酶ζ的小亞基，又稱為MAD2L2）則以53BP1、RIF1和ATM依賴的方式募集到染色質中［44］。53BP1-RIF1-REV7 共同保護DSB末端免受羧基末端結合蛋白相互作用蛋白（CtBP interacting protein，CtIP）的切割處理［45］。

圖1 53BP1募集的基本分子機制Figure 1 The basic molecular mechanism of 53BP1 recruitment

圖2 組蛋白在DSB前后的修飾Figure 2 Modification of histone before and after DSB

3 參與53BP1募集的組蛋白及其作用機制

3.1 H2AK15

組蛋白H2AK15ub是由53BP1選擇性識別的［46］。H2AK15泛素化是決定53BP1的UDR基序能否識別H2AK15ub最重要的步驟。當53BP1結合H2AK15ub后，53BP1 才能及時有效地募集到DSB 位點［47］。H2AK15 的泛素化依賴于泛素連接酶RNF8 和RNF168［40］。然而，最新研究表明，H2AK15ub 不完全在53BP1 募集中發(fā)揮作用。在發(fā)生DSB 時，細胞中發(fā)生一系列蛋白質磷酸化事件，其中包括部分泛素的蘇氨酸12 殘基磷酸化（pUbT12）事件。泛素蘇氨酸12 殘基發(fā)生磷酸化在H2AK15 泛素化和DDR調節(jié)中有著意想不到的作用。在RNF168 的催化下，磷酸化的泛素蘇氨酸12殘基促使H2AK15發(fā)生泛素化產生H2AKpubT12。而蘇氨酸12 殘基位于53BP1 和H2AK15ub 復合體相互識別的界面，蘇氨酸12 磷酸化極大地破壞了53BP1 和H2AK15ub 相互作用的穩(wěn)定性［41］。H2AKpubT12對53BP1的最直接影響是53BP1不能識別含有H2AKpubT12的染色質區(qū)域，取而代之的是該染色質區(qū)域被RNF169、DNA 損傷修復蛋白51（DNA repair protein 51，RAD51）以及BRCA1 識別。過多的泛素蘇氨酸12殘基發(fā)生磷酸化還可能不受控制地刺激RNF169的激活［41］。RNF169 是RNF168 的同源物［48］，RNF169通過對泛素結構的競爭來限制RNF168介導的信號轉導，最終也會抑制53BP1 募集到DSB 中［40］。由此可見，H2AK15ub 可能通過泛素蘇氨酸12 殘基的磷酸化和去磷酸化來調節(jié)53BP1募集。

3.2 H4K20

作為在53BP1 募集中最關鍵的組蛋白之一，H4K20 是否甲基化可以決定G1、G2 和S 期修復途徑的選擇［49］。H4K20me2 確保53BP1-RIF1-REV7復合物被募集到染色質中［50］。另外，組蛋白H4K20在未甲基化時促進53BP1移除和BRCA1募集［51］。在G1期，H4K20me2在53BP1結合位點處于飽和水平，這促使53BP1-RIF1-REV7 復合物募集到DSB，并促使BRCA1從DSB移除。在S、G2期，H4K20me2的濃度下降使得53BP1-RIF1-REV7復合物移除。隨后，未甲基化狀態(tài)的組蛋白H4K20濃度相對增加，并促使BRCA1 募集到DSB［52］。組蛋白H4K20 代表修復途徑的開關，它確保NHEJ修復在G1期占主導地位，而HR 修復在S、G2 期更具優(yōu)勢［6］。總而言之，H4K20me2 對于53BP1在染色質的募集是非常重要的［47］。

正常情況下，即使H4K20me2 的濃度處于飽和狀態(tài)也無法識別53BP1，其原因可從H4K20me2 和53BP1 這兩個角度進行闡釋。首先，53BP1 無法識別H4K20me2 是因為正常狀態(tài)下，H4K20me2 被埋藏于染色質中。H4K20me2是由賴氨酸甲基轉移酶5A（lysine methyltransferase 5A，KMT5A）和組蛋白甲基轉移酶（suppressor of variegation 4-20 homolog，Suv4-20H）協(xié)同作用而產生。由KMT5A催化的第一次甲基化產生的H4K20me1促進了Suv4-20H 募集，而Suv4-20H 的募集又催化H4K20me1 發(fā)生第二次甲基化［53］。經過兩次甲基化的組蛋白H4K20將一直埋藏于染色質中，直到發(fā)生DSB 時才暴露出來［54］。H4K20me2 一直埋藏在染色質中無法被53BP1 識別，是因為其結合位點被各種結合蛋白覆蓋，其中最關鍵的結合蛋白是L3MBTL1［29］和KDM4A［30］，KDM4A、L3MBTL1 共同競爭53BP1 和H4K20me2 的結合位點，阻礙了53BP1 識別H4K20me2。其次，53BP1 無法識別H4K20me2 的另一個原因是53BP1 被TIRR 掩蓋。TIRR 抑制53BP1與H4K20me2 之間的相互作用，它掩蓋了53BP1 的Tudor結構域［24］。總而言之，L3MBTL1和TIRR 通過阻止H4K20me2 與53BP1 的Tudor 結構域之間的相互作用來抑制53BP1 對DSB 的募集。在發(fā)生DSB時，ATM 促進53BP1-TIRR 復合物解離，使得53BP1能夠識別H4K20me2［23，27］。ATM 與MDC1 的結合使MDC1-RNF8-RNF168-組蛋白泛素化-53BP1 軸的信號級聯(lián)反應激活。含纈氨酸蛋白（valosin-containing protein，VCP）以RNF8 和泛素依賴的方式募集到DSB 中，并介導L3MBTL1 與H4K20me2 分離［38］。同時，KDM4A 被蛋白酶體以RNF8 依賴的方式降解，這些都是53BP1與H4K20me2結合的前提［39］。這些研究共同證明了H4K20me2 如何以RNF8/RNF168依賴的方式與53BP1結合。

組蛋白H2AK15的泛素化和H4K20的甲基化過程在DDR 中聯(lián)系緊密。相關文獻表明，RNF8 和RNF168介導的H2AK15泛素化和KMT5A的募集存在一定關聯(lián)。KMT5A在DDR中的活性是H4K20甲基化所必需的［38］。因此，RNF8、RNF168 和KMT5A在53BP1 募集中的作用可以從兩個方面解釋。首先，作為組蛋白甲基轉移酶，在特定的DSB 位點KMT5A可以誘導H4K20發(fā)生甲基化；其次，KMT5A還是一種泛素化調節(jié)因子，可以增強RNF168 介導的H2AK15泛素化［39］。

3.3 H3K18

組蛋白H3K18 以SIRT7 介導的H3K18ac 去乙?；绞絹碚{控53BP1 募集［28］。SIRT7 屬于sirtuin家族成員，這個家族的一個關鍵功能是調節(jié)和維持基因組的穩(wěn)定性［55］。SIRT7以PARP1依賴的方式被招募到DSB 位點，并作用于組蛋白［28］。SIRT7 可使組蛋白的啟動子區(qū)域脫乙酰化，并選擇性地去乙?；疕3K18ac的啟動子區(qū)域［56］。SIRT7在表觀遺傳學上控制與線粒體生物發(fā)生、核糖體生物合成和DNA損傷反應相關基因的轉錄［57］。SIRT7可以被DNA［58］和RNA［59］激活，以水解組蛋白H3K18 賴氨酸殘基的乙?；?0］。SIRT7 缺失使細胞對多種遺傳毒物敏感［61-63］。SIRT7缺失還導致早衰以及胚胎存活率降低，這與基因修復缺陷有關［11］。在色氨酸2，3-雙加氧酶（tryptophan 2，3-dioxygenase，TDO）活性被抑制的情況下，使用雙氯乙基亞硝脲（bis-chloroethylnitrosourea，BCNU）誘導膠質母細胞瘤細胞發(fā)生DSB后，細胞表現(xiàn)出γH2AX信號增強和53BP1向染色質募集缺陷。TDO抑制減少了SIRT7脫乙酰酶在染色質中的募集，從而增加了組蛋白H3K18乙?；@是阻止53BP1募集到DSB位點的關鍵標志［64］。但是這個新的調節(jié)途徑還沒確定53BP1 是如何與H3K18相互作用的。目前，已有研究表明，H3K18ac并沒有通過影響H4K20me2、H2AK15ub與53BP1的結合來阻礙53BP1募集［28］。

3.4 H3K56

組蛋白H3K56位于核小體的DNA進出位點，其乙?；cDNA 損傷后的轉錄和細胞存活等重要細胞功能相關［65-66］。在發(fā)生DSB 時，RNF8 介導SIRT3定位于受損染色質中，并與53BP1 共同定位［10］。隨后，SIRT3介導H3K56ac去乙?；⒋偈?3BP1募集到受損染色質中［10］。由于SIRT3和組蛋白H3K56在53BP1 募集中的穩(wěn)定作用，細胞在遺傳毒性應激下依然能夠穩(wěn)定地存活［67-68］。目前，尚未闡明53BP1是否通過特定的結構域特異性識別H3K56。

3.5 H4K16

H4K16ac 是由Tat 相互作用蛋白60（Tat interactive protein 60，Tip60）乙?；D移酶復合物催化產生的［69-70］，它通過破壞H4K16 和Tudor 結構域之間的鹽橋來減弱53BP1 與H4K20me2 的結合［54，71］。相反，H4K16ac 去乙?；瘎t增強53BP1 與H4K20me2結合以及53BP1 foci 形成［54］。相關文獻解釋了Tip60 如何調節(jié)組蛋白的修飾和53BP1 募集。在S、G2期中，HR修復途徑的激活依賴于BRCA1、53BP1與關鍵相互作用伙伴的結合［72］。在G1期，H4K16的乙?；诫SDNA損傷程度變化。當發(fā)生DSB時，HDAC催化H4K16ac加速去乙?；?1］。在S、G2期，Tip60 促使H4K16 發(fā)生乙?；?，使得53BP1 在DSB中的積累減少［73］。另外，Tip60在調節(jié)53BP1募集中除了調節(jié)H4K16 乙酰化，還能通過乙酰化H2AK15來阻止H2AK15泛素化［74］。相反，由RNF168介導的H2AK15 泛素化過程則抑制Tip60 對H4K16 乙?；饔茫?4］?？傊?，H2AK15 的泛素化或乙?；约癟ip60 介導的組蛋白H4K16 乙?；^程相互影響，共同確保53BP1在正確的時期募集到染色質中。

最近一項研究表明組蛋白H4K16me1 也參與53BP1的募集。H4K16甲基化主要受GLP調控。抑制GLP可阻止DNA修復進程，這可能是由于GLP可以抑制相關修復因子的募集。例如，通過抑制GLP可減弱BRCA1 募集從而抑制HR 修復［75-76］。然而，也有人報道，抑制GLP使NHEJ修復效率降低，而并不影響HR修復［77］。這是因為GLP被抑制后，53BP1募集也受影響［8］。GLP調控的53BP1募集可能主要來自于H4K16me1 和53BP1 之間的相互作用。在DDR 中，H4K16me1 水平與H4K16ac 水平表現(xiàn)出相反的變化［8］。H4K16的賴氨酸殘基甲基化與乙?；嗷ジ偁?，H4K16甲基化水平增加可以抑制H4K16乙酰化，從而確保53BP1 募集。GLP 除了可以調節(jié)H4K16 的甲基化，還可以通過介導MDC1 甲基化來促進53BP1 募集［37，78］。MDC1 是53BP1 在DSB 位點積累所必需的。當發(fā)生DSB時，GLP以ATM依賴的方式被招募到受損染色質中［78］。隨后，GLP 介導的MDC1 甲基化可增強ATM 的活性，從而擴大受損染色質周圍的損傷信號。

在發(fā)生DSB 時，相對于H4K16me1 水平的大幅增加，H4K20me2 水平的增加卻相當有限［8］。這或許是因為H4K20me2 在DSB 發(fā)生前就已經大量積累在染色質中［54］，所以H4K20me2在DNA發(fā)生損傷時不會增加太明顯［8，79］。目前，已有相關研究介紹了H4K16me1 和H4K20me2 的抑制對53BP1 foci 形成的影響。共同抑制H4K16me1［80］和H4K20me2［81］比單獨抑制能更有效地抑制53BP1 募集［8］。究其原因是H4K16me1 提高了53BP1 的Tudor 結構域對H4K20me2的親和力。因此，H4K16me1與H4K20me2可能聯(lián)合調控53BP1募集［8］。

4 總結與展望

在DSB 修復相關研究領域中，53BP1 作為細胞對NHEJ 修復途徑的重要調節(jié)因子，其在染色質中的募集成為當前的研究熱點。多項研究證實53BP1與染色質的結合主要受組蛋白修飾的調節(jié)，凸顯了進一步研究組蛋白與53BP1作用機制的重要性?，F(xiàn)有的研究大多關注修復調節(jié)因子對53BP1募集的影響。然而，組蛋白修飾在53BP1 募集中發(fā)揮的作用也同樣值得關注與進一步探索。本文綜述了53BP1結構、53BP1 募集分子機制以及組蛋白修飾在53BP1 募集中的作用機制，但仍有許多問題和重要的研究方向需要繼續(xù)探索。組蛋白H3K18、H3K56如何與53BP1相互作用以及它們是否影響53BP1識別K2AK15ub、H4K20me2，尚有待深入研究。隨著組蛋白修飾與53BP1 募集的深度開發(fā)，可為癌癥治療提供更多選擇。