濃香型白酒窖泥微生物群落及其風(fēng)味成分研究進(jìn)展

胡世偉，王超凡，王景春，王慧慧，趙 華，張朝正*

（天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室 天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457）

白酒作為世界六大蒸餾酒，因其獨特的口感和香味，深受世界各國人民喜愛。濃香型白酒的生產(chǎn)過程一般包括制曲、發(fā)酵、蒸餾、勾調(diào)等步驟[1]。發(fā)酵過程中的微生物代謝產(chǎn)生的香氣化合物，是決定濃香型白酒風(fēng)味的重要因素之一。窖泥是在窖池內(nèi)壁附著的一層黏土，參與白酒的發(fā)酵過程，是濃香型白酒特征風(fēng)味物質(zhì)己酸乙酯的來源地。老窖中的窖泥保障了傳統(tǒng)品牌白酒的風(fēng)味和品質(zhì)，窖泥中產(chǎn)生的乙酸、丁酸、己酸等物質(zhì)及其和乙醇形成的多種乙酯，通過物質(zhì)交換轉(zhuǎn)移到酒醅中，再通過蒸餾進(jìn)入白酒中，進(jìn)一步影響濃香型白酒的風(fēng)味和品質(zhì)[2]。在濃香型白酒的整個釀造過程中，窖泥是產(chǎn)生酒體風(fēng)味物質(zhì)的重要的場所，對濃香型白酒的特色和品質(zhì)具有決定性作用[3]。但由于窖泥的特殊性，限制了一些常規(guī)微生物分析技術(shù)的應(yīng)用，致使窖泥的研究處于瓶頸階段，但一些組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，如宏基因組學(xué)和元轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)等對窖泥的研究提供了新的檢測手段。

當(dāng)談?wù)摬煌貐^(qū)的白酒風(fēng)味特點時，可以歸結(jié)于多方面因素的綜合作用。其中，生產(chǎn)工藝、原材料的不同以及微生物群落的差異，是導(dǎo)致這種多樣性的關(guān)鍵因素。在這些因素中，窖泥和酒曲起著重要作用，特別是在影響濃香型白酒風(fēng)味方面，窖泥的影響尤為顯著。窖泥和酒曲不僅僅是白酒釀造過程中的材料，更代表著釀酒工匠多年的經(jīng)驗和技藝積累。尤其是歷經(jīng)歲月的窖泥，蘊含了豐富的釀酒智慧。這其中蘊含的微生物群落，也扮演著非常重要且獨特的角色[4]。窖泥中的微生物如己酸菌和乳酸菌產(chǎn)生的酶類在酒醅中參與白酒生產(chǎn)過程中的多種反應(yīng)，產(chǎn)生多種化合物。窖泥中微生物的代謝產(chǎn)物和分解產(chǎn)物中也包含多種揮發(fā)性化合物，這些化合物包括酸類、酯類、酮類、醇類等，貢獻(xiàn)了白酒特有的香氣和風(fēng)味，如果香、花香、香草香氣等[5]，賦予了白酒豐富的口感和復(fù)雜性。因此研究窖泥中微生物群落對提高白酒品質(zhì)非常重要。

鑒于窖泥在濃香型白酒生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵作用，本文簡述了窖泥微生物中的乳酸菌、己酸菌、芽孢桿菌及產(chǎn)甲烷菌，并綜述了濃香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)，探討了窖泥中的微生物菌群對濃香型白酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，旨在為進(jìn)一步研究濃香型白酒的窖泥微生物、提升白酒質(zhì)量以及增強(qiáng)風(fēng)味特性提供思路和支持。

1 窖泥中的微生物

1.1 乳酸菌

乳酸菌是自然界中廣泛存在的一類細(xì)菌，目前已經(jīng)鑒定出的乳酸菌屬種達(dá)到了23種[6]。同時，從窖泥等環(huán)境中也可以分離出多種乳酸菌，其屬種達(dá)到16個左右[7]。研究發(fā)現(xiàn)，酒醅中的乳酸菌和窖泥中的乳酸菌在氧的利用、移動元件含量和氧化脅迫耐受方面存在差異，且窖泥中兼性厭氧乳酸菌的豐度高于酒醅[8]。這幾年來，窖泥中乳酸菌的分離培養(yǎng)和代謝研究都取得了重大進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）在窖泥中豐度最高[9]。由于乳酸菌的代謝特點，其所產(chǎn)生的乳酸和乙酸在濃香型白酒的風(fēng)味及窖泥環(huán)境中具有重要作用。

乳酸是濃香型白酒中的一個重要有機(jī)酸，在窖池中的存在對窖泥的pH值影響較大，從而維持了適宜的酸性環(huán)境[10]。這種酸性環(huán)境不僅有助于淀粉的糖化過程，還能促進(jìn)乙醇的發(fā)酵。此外，乳酸還具備一定的抑制細(xì)菌生長的功能，對維持釀酒過程的正常進(jìn)行也起到了一定的作用[11]。張會敏等[12]研究確認(rèn)了窖泥中乳酸含量與pH值之間存在著密切的相關(guān)性。通過比較新舊窖泥中總氫含量的差異，并探究這些差異與pH值及乳酸含量之間的關(guān)系，可以更深入地了解窖泥微生物群落的代謝情況與窖泥質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)。

1.2 己酸菌

己酸菌隸屬梭菌科，廣泛存在于窖泥中。有研究表明[12]，己酸菌在某些窖泥樣本中是主要的優(yōu)勢菌，對濃香型白酒風(fēng)味的生成有著重要的作用。己酸菌在改良肉湯培養(yǎng)基中發(fā)酵后能得到乙酸、丁酸和己酸等多種酸[13]。GAO Z Z等[14]研究表明，己酸菌是窖泥和黃水中的重要微生物，與己酸的產(chǎn)生存在著重要的關(guān)聯(lián)。乙酸、丁酸和己酸是濃香型白酒中常見的酸性香氣物質(zhì)，其在發(fā)酵過程中可以與酒中的醇類反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類化合物，從而形成香氣物質(zhì)。這些酯類物質(zhì)通常具有芳香或果香味道，是濃香型白酒中重要的香氣成分之一。乙酸、丁酸和己酸是賦予濃香型白酒獨特香氣的重要元素，它們也是相關(guān)酯形成的關(guān)鍵成分。韓珍瓊等[15]研究發(fā)現(xiàn)，己酸菌在白酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的己酸，不僅僅有著賦予香氣、增強(qiáng)香味、減少刺激性的作用，同時還能與酵母發(fā)酵產(chǎn)生的酒精發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成一種稱為己酸乙酯的化合物。這種化合物是濃香型白酒獨特的主要香味成分之一。通過這種反應(yīng)，能夠改善濃香型白酒的風(fēng)味和口感。實際上，這個過程影響著濃香型白酒的風(fēng)格和質(zhì)量。胡承等[16]研究表明，窖泥的微生物群落主要是由厭氧異養(yǎng)菌和己酸菌等微生物構(gòu)成的，在酶的作用下，發(fā)生多種生化反應(yīng)，產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，進(jìn)而生成濃香型白酒的呈香物質(zhì)。近年來，隨著氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，窖泥中風(fēng)味物質(zhì)的分析也邁上了新的臺階。魯少文等[17]通過富集培養(yǎng)新型瘤胃梭菌（Clostridiumsp.）CPC-11并將其用于窖泥的養(yǎng)護(hù)中，使?jié)庀阈桶拙频闹饕L(fēng)味物質(zhì)（如己酸和己酸乙酯）在窖泥中積聚，從而增強(qiáng)窖泥品質(zhì)，提高白酒風(fēng)味質(zhì)量。

1.3 芽孢桿菌

芽孢桿菌屬（Bacillus）是廣泛分布于自然環(huán)境中的微生物，這類微生物在食品的發(fā)酵過程中，會產(chǎn)生各種風(fēng)味化合物。在自然條件下，濃香型白酒的發(fā)酵也常常會涉及到芽孢桿菌的作用[18]。事實上，窖泥中的芽孢桿菌也是濃香型白酒釀造的重要組成部分，從窖泥中分離得到了短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、耐硼賴氨酸芽孢桿菌（Bacillus boronophilus）等芽孢桿菌屬中的物種[15]。它們都能夠代謝產(chǎn)生3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇等濃香型白酒重要的香味物質(zhì)，對于濃香型白酒的風(fēng)味特征起到一定的調(diào)節(jié)作用[19]。因此，研究窖泥中芽孢桿菌屬的分布、代謝規(guī)律及其與白酒風(fēng)味之間的關(guān)聯(lián)，對于提高濃香型白酒生產(chǎn)技術(shù)和品質(zhì)具有重要的意義。眾多研究結(jié)果表明，芽孢桿菌對濃香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生起著重要作用，并且芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物與窖泥中眾多物質(zhì)相互作用和反應(yīng)，維持著窖泥穩(wěn)定的酸堿度環(huán)境，并且芽孢桿菌的穩(wěn)定生長可促使產(chǎn)甲烷菌（Methanogenic archaea）的生成[20]。劉燕梅等[19]從濃香型白酒的窖泥中分離出三種細(xì)菌，利用磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid analysis，PLFA）鑒定方法確認(rèn)它們分別是球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaerieus）、短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）和塵埃類芽孢桿菌（Paenibacillus larvaesubsup.pulvifaciens）。研究發(fā)現(xiàn)，這三種細(xì)菌具備強(qiáng)大的產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)能力，而且它們所合成的化合物種類繁多，主要包括高級醇、高級酮等芳香類化合物。這些微量成分在濃香型白酒中的存在起到了關(guān)鍵作用，它們不僅能夠貢獻(xiàn)香氣，還能在風(fēng)味方面提供協(xié)同效應(yīng)，豐富白酒的口感和氛圍。因此，這些細(xì)菌產(chǎn)生的化合物在塑造濃香型白酒獨特風(fēng)味特征方面具有重要的放香、增香和調(diào)香功能。多項研究結(jié)果均顯示，芽孢桿菌在濃香型白酒的香氣成分中扮演著重要角色，其次級代謝產(chǎn)物可能與其他窖泥微生物相互影響，從而維持了窖泥環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。這意味著芽孢桿菌不僅在香味方面對白酒貢獻(xiàn)巨大，同時也在維護(hù)窖泥生態(tài)平衡方面具有重要作用。侯小歌等[21]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸、丁酸、己酸等香味物質(zhì)會在梭狀芽孢桿菌、乳酸片球菌等細(xì)菌的代謝過程中產(chǎn)生，并且會影響濃香型白酒風(fēng)味和品質(zhì)的形成。

1.4 產(chǎn)甲烷菌

產(chǎn)甲烷菌是在厭氧條件下產(chǎn)生的，它產(chǎn)生的一些重要產(chǎn)物是濃香型白酒的重要香味成分。窖泥中有著豐富的產(chǎn)甲烷菌，這些產(chǎn)甲烷菌維持著窖泥的酸堿平衡以及整個厭氧消化體系的穩(wěn)定[22]。窖泥中主要的產(chǎn)甲烷菌為甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、甲烷囊菌屬（Methanoculleus）、甲烷八疊球菌屬（Methanosarcina）和甲烷桿菌屬（Methanobacterium）。這些甲烷產(chǎn)生菌能有效地利用發(fā)酵型細(xì)菌產(chǎn)生的氫氣，將其轉(zhuǎn)化為甲烷，從而防止氫氣在環(huán)境中積累，同時還抑制了脂肪酸的分解。由于這些甲烷產(chǎn)生菌在窖泥中調(diào)節(jié)了氫氣和乙酸的平衡，它們促進(jìn)了濃香型白酒中香味成分的生成[23]。產(chǎn)甲烷菌在窖泥中可以使酸性消化階段的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步分解，使酸堿度上升，并且甲烷菌能氧化分子狀態(tài)的氫，利用二氧化碳作為電子受體[24]。

研究表明，可以通過互營細(xì)菌和產(chǎn)甲烷菌互營合作實現(xiàn)對脂肪酸的降解[25]。窖泥中含有豐富的產(chǎn)甲烷菌，而且窖泥中的產(chǎn)甲烷菌與多數(shù)細(xì)菌呈正相關(guān)[26]。在濃香型白酒的發(fā)酵過程中，甲烷桿菌屬是窖池中古菌群中數(shù)量最多的一類。研究顯示，窖泥中的甲烷桿菌屬與氫孢菌屬以及產(chǎn)己酸菌屬之間存在著正向關(guān)聯(lián)，它們之間相互影響[27]。通過在窖泥中發(fā)現(xiàn)的各種短鏈脂肪酸的合成基因，得到了產(chǎn)甲烷菌與其他微生物相互作用的強(qiáng)有力證據(jù)。

2 濃香型白酒中的風(fēng)味物質(zhì)

2.1 酯類物質(zhì)

濃香型白酒的主要風(fēng)味成分之一是己酸乙酯，其含量在評價白酒的質(zhì)量上具有重要作用。此外，丁酸乙酯、戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基丙酸乙酯以及棕櫚酸乙酯等酯類化合物，在白酒的化學(xué)成分中所占比例較高，被認(rèn)為是白酒主要的香味成分[28-29]。FAN W L等[30]通過氣相色譜-嗅聞（gas chromatography-olfactory，GC-O）技術(shù)分析和香氣萃取稀釋分析（aromaextractdilutionanalysis，AEDA）發(fā)現(xiàn)，劍南春和五糧液這兩種濃香型白酒中含有一系列重要的香氣化合物。其中，丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、己酸丁酯、3-甲基丁酸乙酯以及己酸等酯類化合物被認(rèn)定為主要的香氣成分。在這些化合物中，酯類，尤其是乙酯，被認(rèn)為是這些濃香型白酒中最重要的芳香物質(zhì)。特香型白酒的獨特特征之一是其含有丙酸乙酯[31]，這種化合物的味道微澀，有芝麻和菠蘿的香氣[32]。研究發(fā)現(xiàn)[33]，通過引入企業(yè)自制富含營養(yǎng)的酒窖泥，可以增加特香型白酒基礎(chǔ)酒中丙酸乙酯的濃度，從而賦予酒品更加獨特的風(fēng)味。另一方面，在濃香型白酒中，己酸乙酯是主要的芳香化合物之一，在白酒的微生物發(fā)酵過程中，酯類的合成是一個重要步驟，主要是通過酸與醇在酯化酶的催化作用下形成的。因此，能夠賦予白酒獨特香氣的微生物包括兩類：一類是能夠產(chǎn)生香氣分子及其前體的微生物，另一類是具備酯化酶活性的微生物，其量的變化對于濃香型白酒的品質(zhì)具有至關(guān)重要的影響[21]。此外，辛酸乙酯的香氣強(qiáng)度僅次于己酸乙酯，研究表明，微量添加辛酸乙酯到濃香型白酒中，可以賦予酒液明顯的水果香氣；適度的辛酸乙酯含量有助于增強(qiáng)酒體的復(fù)合香氣，起到積極的促進(jìn)作用，然而，當(dāng)辛酸乙酯含量過多時，會對酒體中其他香味成分產(chǎn)生抑制效應(yīng)，在濃香型白酒的風(fēng)味中也扮演著重要的角色[34]。這些香氣成分在白酒的制作過程中發(fā)揮著重要作用，對于不同類型的白酒風(fēng)味貢獻(xiàn)獨特的特點。

2.2 酸類物質(zhì)

己酸、乙酸和丁酸是濃香型白酒中的三種重要有機(jī)酸，它們?yōu)榘拙茙砹擞鋹偟南銡?，因其在原酒中的含量較高。酒中適度的酸味能夠使白酒口感更加豐富，而酸味不足則可能導(dǎo)致白酒口味單調(diào)。這些酸類物質(zhì)在白酒中還具有另一個重要的作用，就是作為揮發(fā)性香味物質(zhì)酯類的合成前體。它們通過與醇類反應(yīng)，在酵母和微生物的作用下生成各種香味豐富的酯類化合物[35]。其中，己酸具有增強(qiáng)香氣、助于形成香氣、減輕酒體的刺激感，并在口感上產(chǎn)生緩沖平衡的作用。此外，己酸還是濃香型白酒的主要香氣成分之一，己酸乙酯的前體[36-37]。杜相林[38]研究對比了新老窖泥制作的白酒，分析了原酒中上、中、下三個糟層的五種主要揮發(fā)性酸類物質(zhì)。結(jié)果表明，在這兩種窖泥酒體中，酸類物質(zhì)的含量從高到低依次是乙酸、己酸、丁酸、戊酸和庚酸。綜合而言，新窖泥酒體相對于老窖泥酒體，其乙酸和己酸的總含量較高。張建敏等[39]研究顯示，適度的酸度可以調(diào)整白酒的風(fēng)格，提升其口感和適口性。

2.3 醇類物質(zhì)

醇類化合物在白酒中具有醇甜的風(fēng)味特點，并能夠起到助香的作用，對于白酒的風(fēng)味形成和酒體的豐滿濃厚具有重要作用。這些醇類化合物可以與窖泥中的微生物產(chǎn)生的酯化酶一同作用，與酸類物質(zhì)共同生成酯類化合物。醇類不僅僅賦予酒香和味道，同時也是醇甜和助香特點的主要來源，對于形成白酒的風(fēng)味以及增進(jìn)酒體的豐滿和濃郁具有關(guān)鍵影響[40]。段明松等[41]研究表明，對新舊窖泥制作的白酒，取其上、中、下三個糟層的原酒中的8種主要醇類化合物進(jìn)行了分析。正丁醇、仲丁醇、2,3-丁二醇、正己醇和β-苯乙醇這5種化合物在老窖泥的上層酒到新窖泥的下層酒中呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。其中，正丁醇和仲丁醇帶有微苦的味道，適量的含量能夠增加白酒的醇厚感和余味。2,3-丁二醇和正己醇具有甜味，隨著含量的增加，能夠為白酒帶來醇甜感。而β-苯乙醇則具有玫瑰花的香氣，為白酒賦予了獨特的花香特點。

3 結(jié)論

濃香型白酒的功能性微生物在生長和繁殖過程中主要依賴于窖泥作為生態(tài)載體。窖泥中的功能性微生物種類以及它們之間的相互作用在濃香型白酒的風(fēng)味形成過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這些微生物種類在釀造過程中參與了復(fù)雜的代謝反應(yīng)，產(chǎn)生了各種化合物，其中包括影響白酒風(fēng)味的關(guān)鍵成分。它們的相互作用可以影響代謝產(chǎn)物的種類和含量，從而直接影響到白酒的香氣特點和品質(zhì)。然而，需要注意的是，窖泥中影響濃香型白酒風(fēng)味的物質(zhì)并不是在實驗室條件下單一成分的簡單存在。相反，這些物質(zhì)是由己酸菌、產(chǎn)甲烷菌（Methanogenus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等多種微生物共同存在的有機(jī)整體所組成，構(gòu)成了一個復(fù)雜的相互作用體系。例如，產(chǎn)甲烷菌并不直接產(chǎn)生濃香型白酒風(fēng)味化合物，但是產(chǎn)甲烷菌會解除已酸菌代謝產(chǎn)物氫的抑制作用，在同一窖池環(huán)境中產(chǎn)甲烷菌和己酸菌具有相同的變化趨勢[42]。基于窖泥微生物體系的復(fù)雜性，需要從整體微生物群落水平研究窖泥微生物群落與產(chǎn)香化合物組成之間的關(guān)系，影響白酒風(fēng)味的功能微生物還有待于進(jìn)一步研究。