多囊蛋白-1在急性主動脈夾層發(fā)病機制中的作用

王 蕾，崔立坤，張 琳，劉 娜

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院急救中心，河南 鄭州 450052)

急性主動脈夾層(aortic dissection,AD)是一種急性大血管病變，致死率極高，嚴(yán)重危及人類健康，目前其發(fā)病機制仍不明確[1-2]。AD的主要病理特征是動脈壁中層退行性變[3-4]，血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)凋亡被認(rèn)為是主動脈中層退行性變的重要原因[5-6]。多囊蛋白-1(polycystin-1,PC-1)是由多囊腎病1型(polycystic kidney disease 1,PKD1)基因編碼的蛋白，是常染色體顯性遺傳多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)的重要致病基因之一。研究表明，約85%的ADPKD患者存在PKD1基因突變[7-8]。PC-1廣泛存在于腎小管上皮細(xì)胞及VSMC，對維持血管壁結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性具有重要作用。研究顯示，PC-1在AD的發(fā)病機制中起重要作用，其可以通過活化磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)信號通路而參與調(diào)控多種細(xì)胞凋亡過程[9-12]，但其是否影響主動脈VSMC凋亡過程而參與急性AD發(fā)病機制，目前尚未見文獻(xiàn)報道。本研究通過觀察AD患者主動脈組織中PC-1及相關(guān)信號通路蛋白、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討PC-1在AD發(fā)病機制中的作用及分子機制。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源收集2019年10月至2020年1月于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院行主動脈弓置換術(shù)的6例急性AD患者的病變主動脈組織標(biāo)本作為AD組。其中男4例，女2例；年齡39～64(50.33±8.80)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：從發(fā)病到確診時間≤24 h，且經(jīng)血管超聲、CT血管成像和磁共振血管成像檢查確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡小于18歲；(2)馬方綜合征；(3)Ehlers-Danlos綜合征；(4)Turner綜合征；(5)家族性胸(腹)主動脈瘤；(6)主動脈潰瘍或主動脈壁間血腫形成者；(7)妊娠；(8)術(shù)中證明非主動脈夾層的患者；(9)創(chuàng)傷所致夾層；(10)術(shù)后患者。另選擇6例非主動脈疾病的器官捐贈者的正常主動脈組織標(biāo)本作為對照組。其中男3例，女3例；年齡33～68(51.67±12.34)歲。器官捐贈者選擇既往身體健康，突發(fā)疾病引起不可逆的腦死亡患者，且無心血管疾病。2組受試者的性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者和(或)家屬簽署知情同意書。將一部分主動脈組織離體10 min內(nèi)置于液氮后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，用于蛋白表達(dá)分析；另一部分主動脈組織保存于甲醛溶液中，用于SM22α免疫熒光/DNA末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TdT-mediated biotinylated-dUTP nick end labeling,TUNEL)雙標(biāo)染色分析。

1.2 試劑與儀器TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自德國Roche公司，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料購自美國Sigma-Aldrich公司，二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技股份有限公司，聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore公司，cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9、Bcl-2、Bax、PI3K(p85)、PI3K(p110β)、Akt(p-Ser-Akt和p-Thr-Akt)等抗體均購自英國Abcam公司，SM22α抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，Pierce增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑購自芬蘭Affifinity Biosciences公司。

1.3 Western blot法檢測2組受試者主動脈組織中凋亡相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化位點表達(dá)取主動脈組織，加入組織裂解液提取總蛋白，二喹啉甲酸蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度，以β-actin為內(nèi)參對樣本蛋白進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。每組取40 μg樣品蛋白與等量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，進(jìn)行100 g·L-1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳；然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，加入50 g·L-1脫脂奶粉封閉膜1 h，用兔抗人cleaved caspase-3(滴度1500)、cleaved caspase-7(滴度11 000)、cleaved caspase-9(滴度1500)、Bcl-2(滴度11 000)、Bax(滴度11 000)、p85(滴度11 000)、p110β(滴度1500)、Akt(滴度1500)、p-Ser-Akt(滴度12 000)、p-Thr-Akt(滴度1500)、β-actin(滴度12 000)一抗，4 ℃孵育過夜；然后加入羊抗兔辣根過氧化物酶二抗(滴度120 000)，37 ℃孵育4 h；加入ECL試劑發(fā)光，應(yīng)用Image-pro Plus 6.0凝膠圖像處理系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.4 SM22α免疫熒光/TUNEL雙標(biāo)染色法檢測2組受試者主動脈VSMC凋亡情況采用免疫熒光染色定位VSMC分子標(biāo)記SM22α，通過TUNEL染色評估細(xì)胞凋亡情況。取主動脈組織石蠟切片，脫蠟、水化，先加入抗SM22α單克隆抗體(滴度1500)，放在濕盒中，4 ℃過夜；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)漂洗3次，再滴加Cy3標(biāo)記的二抗(滴度1100)，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次；根據(jù)TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書操作，配置、滴加反應(yīng)液，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗3次，封片。在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，每組至少選取5張切片，每張切片選取5個不重復(fù)視野，用Image-pro Plus 6.0軟件分析圖片的熒光強度。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者主動脈組織中PC-1蛋白表達(dá)比較結(jié)果見圖1。對照組和AD組主動脈組織中PC-1蛋白的相對表達(dá)量分別為1.00±0.07和0.72±0.04，AD組主動脈組織中PC-1蛋白的相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.614，P<0.01)。

注：A：對照組；B：AD組。

2.2 2組主動脈VSMC凋亡水平比較結(jié)果見圖2。對照組和AD組主動脈VSMC凋亡的熒光強度分別為59.03±4.57和71.26±8.25，AD組主動脈VSMC凋亡的熒光強度顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.178，P<0.05)。

2.3 2組主動脈組織中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)比較結(jié)果見圖3和表1。AD組患者主動脈組織中cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9、Bax蛋白相對表達(dá)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；AD組患者主動脈組織中Bcl-2蛋白相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 2組主動脈組織中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化位點表達(dá)比較結(jié)果見圖4和表2。AD組患者主動脈組織中PI3K的p85、P110β磷酸化位點及Akt的p-Ser-Akt、p-Thr-Akt磷酸化位點的相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：A：對照組；B：AD組。

注：A：對照組；B：AD組。

表1 2組受試者主動脈組織中凋亡相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

注：A：對照組；B：AD組。

表2 2組受試者主動脈組織中PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化位點表達(dá)比較

3 討論

AD是一種嚴(yán)重危及患者生命的大血管疾病，發(fā)病率為(6～30)/100萬，其兇險程度遠(yuǎn)高于腦梗死、心肌梗死和惡性腫瘤[1]。VSMC凋亡導(dǎo)致大量細(xì)胞丟失引起的中層退行性變在AD的發(fā)病機制中起重要作用，但其分子發(fā)病機制至今尚未完全闡明。因此，進(jìn)一步研究AD的發(fā)病機制對AD的有效預(yù)防、早期診斷和治療具有重要意義。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，AD患者血漿和主動脈組織中miR-4787-5p表達(dá)顯著升高，還通過生物信息分析、雙熒光素報告和Western bolt法證實了miR-4787-5p與PC-1之間的靶基因及負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系[13]。關(guān)于PC-1的研究大多集中于ADPKD的發(fā)病機制與治療[14-16]，但仍有少量闡述PC-1與AD發(fā)病機制的相關(guān)研究。有研究顯示，AD患者的主動脈組織中PC-1表達(dá)顯著下調(diào)[17]。FENG等[10]研究發(fā)現(xiàn)，AD患者主動脈組織中PC-1表達(dá)下調(diào)可以通過提高細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化來改變VSMC的表型，使其從收縮型向增殖型轉(zhuǎn)變，從而參與AD的發(fā)病機制。有研究顯示，PC-1可以通過活化PI3K/Akt信號通路參與調(diào)控細(xì)胞凋亡過程[12，18]，這說明miR-4787-5p有可能通過調(diào)控PC-1來參與AD的發(fā)病機制，但其具體機制仍不清楚。

PC-1是一個大分子的膜蛋白，其結(jié)構(gòu)主要包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3部分。PC-1的胞外區(qū)具有一個很長的N-末端，有許多與配體結(jié)合的區(qū)域，在細(xì)胞間和(或)細(xì)胞基質(zhì)間的相互連接中起重要作用。PC-1有11個跨膜區(qū)域，外部刺激可以通過該區(qū)域向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號。PC-1的胞內(nèi)區(qū)是具有約200個氨基酸的C-末端區(qū)域，有很多磷酸化位點，通過調(diào)控其磷酸化水平來介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而影響細(xì)胞的各項功能[19]。有研究顯示，PC-1參與調(diào)控多種細(xì)胞的凋亡過程[12]，BOCA 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PC-1的犬腎上皮細(xì)胞(MDCK細(xì)胞)和肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)可以通過活化PI3K/Akt信號通路來抑制凋亡的發(fā)生，而下調(diào)或敲除PKD1可以使細(xì)胞凋亡率明顯升高。本研究結(jié)果顯示，AD患者主動脈組織中PC-1蛋白表達(dá)顯著降低，這說明PC-1有可能通過促進(jìn)主動脈組織的細(xì)胞凋亡參與AD的發(fā)生發(fā)展。

為探討AD組織中PC-1蛋白低表達(dá)是否會促進(jìn)細(xì)胞凋亡，本研究采用免疫熒光/TUNEL雙標(biāo)染色檢測了AD患者病變主動脈VSMC的凋亡情況，結(jié)果顯示，AD患者病變主動脈VSMC凋亡顯著增多，且AD患者主動脈組織中促凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-7、cleaved caspase-9、Bax表達(dá)顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著降低，提示AD患者促凋亡機制增強而抗凋亡機制減弱。為了進(jìn)一步明確PC-1通過何種機制影響細(xì)胞凋亡，本研究檢測了PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白磷酸化位點的表達(dá)，結(jié)果顯示，AD患者主動脈組織中PI3K的p85、p110β磷酸化位點及Akt的p-Ser-Akt、p-Thr-Akt 磷酸化位點的表達(dá)顯著降低。磷酸化位點表達(dá)水平越高說明該通路處于活化狀態(tài)，而反之磷酸化位點表達(dá)水平降低表示該通路處于抑制狀態(tài)，本研究結(jié)果表明，AD患者主動脈組織中PI3K/Akt信號通路處于抑制狀態(tài)，這可能與PC-1蛋白低表達(dá)導(dǎo)致該通路失活有關(guān)。

綜上所述，AD患者主動脈組織中PC-1蛋白表達(dá)降低，PC-1蛋白低表達(dá)可能通過抑制PI3K/Akt信號通路活化、提高促凋亡基因表達(dá)、降低抗凋亡基因表達(dá)而促進(jìn)VSMC凋亡，導(dǎo)致主動脈壁薄弱，這可能是AD發(fā)病的潛在機制之一。本研究為AD的發(fā)病機制提供了一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)，不足之處在于尚未完全明確其分子機制及內(nèi)在聯(lián)系，還有待后續(xù)實驗進(jìn)一步研究。