梅花鹿鹿茸總蛋白對糖尿病腎病大鼠腎損傷的治療作用及分子機(jī)制

崔 艷，趙曉露，師晶晶，劉 云

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎臟病醫(yī)院，河南 衛(wèi)輝 453100)

我國糖尿病患者眾多，成人中糖尿病患病率超過10%；糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常見的并發(fā)癥之一，2020年中華醫(yī)學(xué)會糖尿病分會調(diào)查顯示，我國20%～40%的糖尿病患者合并DN[1]。DN現(xiàn)已成為慢性腎臟病的主要原因，并與心血管疾病的發(fā)病率和病死率顯著增加相關(guān)；因此，延緩DN進(jìn)展尤為重要。研究表明，DN的發(fā)生和發(fā)展與氧化應(yīng)激、糖脂代謝紊亂、晚期糖基化終產(chǎn)物沉積以及腎臟血流動力學(xué)改變等多種因素相關(guān)[2-3]。研究報道，梅花鹿鹿茸總蛋白(Sika deer velvet antler protein，SVPr)能夠抑制細(xì)胞無序供能，延緩腎臟活性氧(reactive oxygen species，ROS)氧化應(yīng)激損傷進(jìn)程，從而減輕慶大霉素誘導(dǎo)的急性腎損傷[4-5]。核轉(zhuǎn)錄因子 E2 相關(guān)因子-2(nuclear factor erythroid-2 related factor-2，Nrf-2)/血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)通路是一條經(jīng)典的抗氧化通路，其與DN的發(fā)展尤為相關(guān)[6]。沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin1，SIRT1) 是一類組蛋白去乙?；?，可通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、腎小管間質(zhì)纖維化、自噬、細(xì)胞凋亡和炎癥等各種內(nèi)源性途徑參與DN的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究擬從Nrf-2/HO-1、SIRT1的角度探討SVPr在DN大鼠腎臟高糖代謝、ROS氧化應(yīng)激、腎臟纖維化損傷中的作用，以期為臨床DN的治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級2～4周齡雄性Sprague Dawley(SD)大鼠購自鄭州大學(xué)藥物研究院，動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(豫)2018-0004，體質(zhì)量83.15～99.14 g,于溫度(22±2)℃、相對濕度(65±5)%、光照周期12 h/12 h條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物、主要試劑和儀器梅花鹿鹿茸粉購自上海雅吉生物科技有限公司；二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字H20023371)，鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)購自伊塔生物科技有限公司，血糖儀及試紙購自美國強(qiáng)生公司，24 h尿蛋白、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)和血肌酐(serum creatinine，SCr)檢測試劑盒購自北京利德曼生物股份有限公司，ROS酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自上海瓦蘭生物科技有限公司，核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB) ELISA試劑盒購自江西艾博因生物科技有限公司，SIRT1、Nrf-2抗體購自武漢菲恩生物科技有限公司，HO-1抗體購自美國Abbiotec公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自溫州科淼有限公司；全自動生物化學(xué)分析儀購自美國雅培公司，連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀購自日本美谷分子儀器有限公司，Chemi Doc XR型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 SVPr制備梅花鹿鹿茸粉碎過120目篩，取鹿茸粉末50.0 g，按液料比13加入蒸餾水，60 ℃、80 Hz條件下超聲60 min，過濾，重復(fù)3次，合并提取液，凝膠色譜柱測定顯示梅花鹿鹿茸總蛋白提取物有效濃度比為0.766 4[7]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及DN模型制備將120只SD大鼠按照簡單隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、二甲雙胍組、低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組，每組20只。模型組、二甲雙胍組、低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組大鼠造模前禁食12 h，單次腹腔注射50 mg·kg-1STZ，7 d后測量大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)≥16.7 mmol·L-1判定為DN模型大鼠造模成功[8]，棄去死亡大鼠(模型組、低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組各1只，二甲雙胍組2只)。對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。造模成功后，二甲雙胍組大鼠給予二甲雙胍500 mg·kg-1·d-1灌胃；低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射質(zhì)量濃度為1.47、2.94、4.41 g·L-1的SVPr溶液0.1 mL，每日1次；對照組及模型組大鼠注射等量生理鹽水。各組大鼠持續(xù)尾靜脈注射給藥4周。

1.3.3 標(biāo)本采集給藥4周后，將各組大鼠置于代謝籠中，禁食，自由飲水，搜集大鼠24 h總尿量。各組大鼠于空腹?fàn)顟B(tài)下采用尾靜脈穿刺法采集尾靜脈血0.5 mL，4 ℃下4 000 r·min-1離心20 min，取上層血清置于-80 ℃冰箱保存；使用乙醛將各組大鼠麻醉后開腹，完整剝離雙側(cè)腎實(shí)質(zhì)組織，將腎實(shí)質(zhì)組織分裝保存于-80 ℃液氮冰箱。

1.3.4 大鼠24 h尿蛋白、血糖、BUN和SCr水平檢測應(yīng)用血糖儀測定各組大鼠尾靜脈血糖值；取各組大鼠24 h總尿量，應(yīng)用全自動生物化學(xué)分析儀檢測24 h尿蛋白量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作；取各組大鼠血清，應(yīng)用全自動生物化學(xué)分析儀檢測BUN和SCr水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.5 ELISA法檢測各組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平取各組大鼠腎組織，加入磷酸鹽緩沖液，用勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，3 000 r·min-1離心20 min，取上清，采用ELISA法檢測ROS、NF-κB水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3.6 Western blot法檢測各組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白表達(dá)取各組大鼠腎組織，用體積分?jǐn)?shù)25%裂解液于冰上裂解腎組織樣本，研磨勻漿，-4 ℃下6 000 r·min-1離心15 min，取上清，采用二喹啉甲酸法測定蛋白濃度；取30 μg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉、聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，封閉液封閉2 h，滴加SIRT1、Nrf-2、HO-1、GAPDH一抗，4 ℃下孵育過夜，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(Tris-HCl)搖動漂洗10 min×3次，置于二抗中室溫下孵育2 h，含吐溫-20 Tris緩沖液洗膜10 min×3 次，增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光法顯色，應(yīng)用Chemi Doc XR型凝膠成像儀成像，Image J 軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白灰度值，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 6組大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平比較結(jié)果見表1。模型組大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組和二甲雙胍組大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量SVPr組大鼠SCr、24 h尿蛋白水平顯著低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量SVPr組與二甲雙胍組大鼠BUN、血糖水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量SVPr組大鼠SCr水平顯著低于二甲雙胍組，BUN、血糖水平顯著高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量SVPr組與二甲雙胍組大鼠24 h尿蛋白水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量SVPr組大鼠BUN、24 h尿蛋白、血糖水平顯著高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量SVPr組與二甲雙胍組大鼠SCr水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量SVPr組大鼠BUN、血糖、24 h尿蛋白、SCr水平顯著低于中劑量SVPr組和低劑量SVPr組，中劑量SVPr組大鼠BUN、血糖、24 h尿蛋白、SCr水平顯著低于低劑量SVPr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 6組大鼠BUN、SCr、24 h尿蛋白、血糖水平比較

2.2 6組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平比較結(jié)果見表2。模型組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組和二甲雙胍組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS水平顯著高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量SVPr組與二甲雙胍組大鼠腎組織中NF-κB水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS、NF-κB 水平顯著高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著低于中劑量SVPr組和低劑量SVPr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS水平顯著低于低劑量SVPr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中劑量SVPr組與低劑量SVPr組大鼠腎組織中NF-κB水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 6組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平比較

2.3 6組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量比較結(jié)果見圖1和表3。模型組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量SVPr組、中劑量SVPr組、高劑量SVPr組和二甲雙胍組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。高劑量SVPr組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2蛋白相對表達(dá)量顯著高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量SVPr組與二甲雙胍組大鼠腎組織中HO-1蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量SVPr組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2蛋白相對表達(dá)量顯著高于二甲雙胍組，HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著低于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低劑量SVPr組大鼠腎組織中SIRT1蛋白相對表達(dá)量顯著高于二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；低劑量SVPr組與二甲雙胍組大鼠腎組織中Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。高劑量SVPr組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著高于中劑量SVPr組和低劑量SVPr組，中劑量SVPr組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著高于低劑量SVPr組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1：高劑量SVPr組；2：中劑量SVPr組；3：低劑量SVPr組；4：二甲雙胍組；5：模型組；6：對照組。

表3 6組大鼠腎組織中SIRT1、Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

隨著我國人口老齡化的加速及居民飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的顯著變化，糖尿病的患病率顯著增加。DN是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，是慢性腎臟病的主要病因，其病理改變復(fù)雜，大多呈慢性進(jìn)行性發(fā)展，最終可進(jìn)展為腎衰竭。DN不僅給患者帶來沉重的生活經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可造成心血管事件和病死率的升高，故DN的治療具有重大的意義。目前對于DN的治療主要包括降糖和降壓治療，但即使控制血糖、血壓，仍有部分DN患者進(jìn)展至終末期腎病，因此，探索其他的治療方法對于改善DN的預(yù)后具有重大意義。

SVPr具有清除組織自由基、延緩神經(jīng)組織纖維化進(jìn)程、抑制炎癥因子及神經(jīng)保護(hù)功能等作用[9]。WANG等[4]研究顯示，SVPr可通過增加Nrf-2和HO-1的表達(dá)激活Nrf2/HO-1通路，通過降低NF-κB 的蛋白表達(dá)抑制 NF-κB 通路，可抑制慶大霉素誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷，提示SVPr具有很強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡作用。另有研究顯示，SVPr提取物對順鉑誘發(fā)的腎損傷、對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的急性腎損傷均有改善作用[10-11]。但SVPr在DN模型中的作用尚未進(jìn)行驗(yàn)證。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血糖、24 h尿蛋白、尿素氮、血肌酐顯著高于對照組，各劑量SVPr組和二甲雙胍組大鼠血糖、24 h尿蛋白、BUN、SCr水平低于模型組，而血糖、24 h尿蛋白、BUN、SCr水平隨SVPr劑量的增加逐漸降低，這說明，SVPr和二甲雙胍均可減輕DN大鼠腎損傷，而SVPr效果更為明顯，且呈劑量依賴性。

DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與遺傳因素、代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞因子、自噬等多種因素相關(guān)。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)過多生成的ROS與內(nèi)源性氧化酶失衡引起的內(nèi)部反應(yīng)，這是DN發(fā)生的重要機(jī)制[12]。腎臟損傷相關(guān)的多種因素可激活NF-κB，活化的NF-κB復(fù)合物易位至細(xì)胞核并結(jié)合NF-κB結(jié)合基序的DNA進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致各種基因異常轉(zhuǎn)錄如晚期糖基化終產(chǎn)物積累、氧化應(yīng)激等。Nrf2/HO-1信號通路是抗氧化應(yīng)激的經(jīng)典信號通路，Nrf2是該信號途徑中重要的細(xì)胞保護(hù)性轉(zhuǎn)錄因子[13-17]。當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2從細(xì)胞質(zhì)中與 Keap1 解離，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中，與抗氧化元件結(jié)合，激活下游 HO-1等內(nèi)源性抗氧化劑的基因表達(dá)，以此清除過量的ROS[18]，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激損傷程度，因此，阻斷ROS及其下游氧化應(yīng)激、激活HO-1/Nrf-2信號通路是治療DN的潛在方法之一。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著高于對照組，Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量均顯著低于對照組；低、中、高劑量SVPr組和二甲雙胍組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著低于模型組，Nrf-2、HO-1蛋白相對表達(dá)量顯著高于模型組；高劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS、NF-κB 水平顯著低于二甲雙胍組，Nrf-2蛋白相對表達(dá)量顯著高于二甲雙胍組；中劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS、Nrf-2水平顯著高于二甲雙胍組，HO-1水平顯著低于二甲雙胍組；低劑量SVPr組大鼠腎組織中ROS、NF-κB水平顯著高于二甲雙胍組；隨SVPr劑量增加，DN大鼠腎組織中ROS、NF-κB 水平逐漸降低，Nrf-2、HO-1水平逐漸增高。這一結(jié)果說明，SVPr可能是通過降低ROS和NF-κB水平阻斷氧化應(yīng)激，增加HO-1、Nrf-2水平激活HO-1/Nrf-2 抗氧化應(yīng)激信號，從而減輕DN大鼠腎損傷。

SIRT1是一種去乙?；?，廣泛存在于人類組織中，其通過去乙?；墙M蛋白調(diào)節(jié)糖和脂代謝、應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、炎癥反應(yīng)和自噬等。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠腎臟中NF-κB呈過表達(dá)，其通過上調(diào)SIRT1表達(dá)可對NF-κB上的p65亞基去乙?；?干擾NF-κB信號并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)NF-κB表達(dá)，抑制NF-κB介導(dǎo)的炎癥信號通路對腎小管上皮的破壞，從而改善腎臟組織炎癥反應(yīng)[19]。有研究顯示，SIRT1的異常表達(dá)是高糖氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腎臟不可逆性纖維進(jìn)程中腎臟代謝紊亂、高自由基超載的關(guān)鍵因素，在DN等疾病轉(zhuǎn)歸中發(fā)揮著重要作用[6,20-23]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織中SIRT1蛋白相對表達(dá)量均顯著低于對照組，低、中、高劑量SVPr組和二甲雙胍組大鼠腎組織中SIRT1蛋白相對表達(dá)量顯著高于模型組，低、中、高劑量SVPr組大鼠腎組織中SIRT1蛋白相對表達(dá)量顯著高于二甲雙胍組，且SIRT1蛋白相對表達(dá)量隨SVPr劑量的增加顯著升高。這一結(jié)果證明，SVPr可能通過上調(diào)SIRT1表達(dá)，抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，激活HO-1/Nrf-2 抗氧化應(yīng)激信號，減輕氧化應(yīng)激，進(jìn)而減輕DN大鼠腎損傷。

綜上所述，與二甲雙胍相比較，SVPr能顯著減輕DN大鼠腎損傷，其機(jī)制可能是通過上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)來抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性、激活HO-1/Nrf-2抗氧化應(yīng)激信號，減輕氧化應(yīng)激，從而減輕腎損傷。