芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

莫文靜，朱嘉偉，何新華，余海霞，江海玲，覃柳菲，張藝粒，李雨澤，羅聰

芒果MiZAT10A和MiZAT10B功能分析

莫文靜，朱嘉偉，何新華，余海霞，江海玲，覃柳菲，張藝粒，李雨澤，羅聰

廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院/亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護與利用國家重點實驗室/植物科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，南寧 530004

【】鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）在植物非生物脅迫應(yīng)答中起重要的作用，研究兩個鋅指蛋白基因和轉(zhuǎn)入擬南芥對鹽、干旱、重金屬以及外源激素等非生物脅迫的應(yīng)答，為抗逆育種提供理論依據(jù)?！尽坷迷诰€軟件PLACE和MEME分別對芒果和進行啟動子順式作用元件以及motif預(yù)測和分析，并利用TBtools軟件和‘四季蜜芒’基因注釋文件（GFF文件，未公開）繪制染色體定位圖；通過實時熒光定量分析和的組織表達模式；構(gòu)建芒果和超量表達載體，采用農(nóng)桿菌花序浸染法轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥，觀察并記錄轉(zhuǎn)基因擬南芥開花表型以及在鹽、干旱、重金屬以及外源激素脫落酸和赤霉素處理下的根生長情況?！尽繂幼禹樖皆治鲲@示，兩個基因的啟動子區(qū)域都有許多光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件。表達模式分析顯示，與在芽和花中表達水平最高。和分別獲得了9株和14株轉(zhuǎn)基因擬南芥，開花表型分析顯示，和轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開花。在鹽脅迫、干旱脅迫和重金屬脅迫以及GA3和ABA激素處理下，兩個超量表達轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著長于WT?！尽砍勘磉_的與可使轉(zhuǎn)基因擬南芥提前開花并提高其對鹽、干旱、重金屬及外源激素GA3和ABA的抗性。

芒果；非生物脅迫；鋅指蛋白；表達模式；基因功能分析

0 引言

【研究意義】芒果（L.）是著名的熱帶亞熱帶水果，逆境脅迫影響芒果的開花、生長發(fā)育、產(chǎn)量以及果實品質(zhì)，嚴重的脅迫會導(dǎo)致芒果死亡。常見的非生物脅迫包括低溫、鹽、干旱、重金屬等[1]。因此，研究并挖掘芒果與非生物脅迫有關(guān)的基因，為后續(xù)芒果的抗性育種提供理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】鋅指蛋白（zinc finger protein，ZFP）是一類具有‘指狀’結(jié)構(gòu)域的III型轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核生物中，人類基因組中甚至有近1%的序列含有這種結(jié)構(gòu)[2]。鋅指蛋白具有特殊二級結(jié)構(gòu)的小肽域，其分類依據(jù)為Cys和His殘基的數(shù)目和位置，目前研究得最廣泛和最深入的鋅指蛋白類型是C2H2型鋅指蛋白，也稱為TFIIIA型或Kruppel-like型[3-4]。C2H2型鋅指蛋白在植物生長發(fā)育、抗病以及逆境脅迫中都發(fā)揮了重要的作用，并參與了GA信號傳導(dǎo)、ABA信號傳導(dǎo)、CBF途徑平行的低溫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑以及光和信號傳導(dǎo)等多種信號途徑[5-6]。目前，擬南芥[6]、水稻[7]、玉米[8]、蕓薹屬蔬菜[9]、黃瓜[10]、番木瓜[11]、葡萄[12]等多種植物的C2H2型鋅指蛋白基因被陸續(xù)分離鑒定。C2H2型鋅指蛋白是植物生長發(fā)育中的主要調(diào)控者，擬南芥直接或間接影響器官脫落的過程[13]；番茄可以與互作，通過調(diào)控的表達影響番茄的開花時間[14]；在蘋果中，通過降低的表達，促進葉片的衰老[15]；參與鹽脅迫和滲透脅迫反應(yīng)[16]；受到調(diào)節(jié)H2調(diào)控的抑制脂質(zhì)過氧化和活性氧（ROS）爆發(fā)，提高耐鹽性[17]；過表達轉(zhuǎn)基因蘋果苗、愈傷組織及擬南芥均表現(xiàn)出降低干旱抗性的表型[15]；超表達轉(zhuǎn)基因檸檬使ROS維持在較低水平，增強了植株抗寒能力[18]；馬鈴薯可能通過ABA依賴途徑來參與干旱和鹽脅迫的反應(yīng)[19]?！颈狙芯壳腥朦c】C2H2型鋅指蛋白在植物成花調(diào)控、非生物脅迫響應(yīng)等方面起重要的調(diào)控作用。筆者課題組前期通過cDNA-SCOT差異顯示獲得了兩個C2H2型鋅指蛋白基因，命名為（）和（）[20]，表達模式分析顯示，兩個基因均受低溫、干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)[21]，但其功能未知。【擬解決的關(guān)鍵問題】構(gòu)建超量表達載體，將芒果兩個和分別轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，探討和在轉(zhuǎn)基因擬南芥成花和逆境脅迫應(yīng)答中的功能。

1 材料與方法

1.1 材料與菌株

芒果試驗材料栽培于廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院果樹標本園。芒果童期樣品采集于2年生‘四季蜜芒’幼樹的葉、莖、芽，成年期樣品采集于16年生‘四季蜜芒’的葉、莖、花、幼果（花后20 d）、成熟果（花后100 d）。采樣時間為2021年10月12日下午5：00—6：00，所有試驗材料采集后立刻用液氮速凍，寫好標簽后放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。擬南芥為哥倫比亞野生型擬南芥。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用軟件TBtools和基因組GFF文件繪制芒果和在‘四季蜜芒’品種中的染色體定位圖；利用MEME（https://meme-suite.org/ meme/tools/meme）對MiZAT10A和MiZAT10B蛋白質(zhì)序列保守基序進行分析，參數(shù)設(shè)置為基序長度8—100個氨基酸，尋找3個基序；利用在線數(shù)據(jù)庫PLACE（https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action= newplace）預(yù)測和在‘四季蜜芒’中ATG上游-2.0 kb區(qū)域的啟動子順式作用元件。

1.3 MiZAT10A和MiZAT10B的組織表達分析

為了研究芒果和的組織表達模式，采用美基公司的多糖多酚植物總RNA小提試劑盒提取芒果不同組織的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)試驗。用在線軟件Primer 3.0 Plus（https://www. bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/ primer3plus.cgi）設(shè)計特異引物（表1），通過實時熒光定量qRT-PCR對和的表達進行檢測，采用2-ΔΔCT方法對定量數(shù)據(jù)進行處理，以芒果為內(nèi)參基因[22]，使用IBM SPSS Statistics 24.0進行數(shù)據(jù)處理。qRT-PCR試驗使用TaKaRa公司的SYBR Green試劑，儀器為Applied Biosystems 7500實時定量PCR儀。

表1 引物序列

1.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲取、鑒定及培養(yǎng)

將和的全長ORF構(gòu)建到35S啟動子啟動的pBI121載體中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法侵染野生型擬南芥[23]，通過抗生素篩選和PCR檢測鑒定轉(zhuǎn)基因陽性植株，其中DNA提取參照余海霞等[24]改良的方法。

1.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性植株成花表型試驗

以野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)空載體擬南芥（pBI1121）為對照，觀察轉(zhuǎn)基因純合T3代植株的表型，統(tǒng)計第一朵花開放的時間、抽薹時（0.5 cm）的蓮座葉數(shù)以及第一朵花開花時的植株高度。每個株系統(tǒng)計12棵苗，結(jié)果采用Excel進行數(shù)據(jù)處理，SPSS19.0進行方差分析。以純合株系的葉片組織為材料提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并統(tǒng)一稀釋濃度為50 ng·μL-1，保存在-20℃。以擬南芥基因（AT3G18780）為內(nèi)參基因通過半定量法檢測芒果基因在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達水平。反應(yīng)體系為：Easy Buffer 2.5 μL、AtACTIN2u/d或MiZAT10Au/d或MiZAT10Bu/d 1 μL，DNA 2 μL，dNTP 0.5 μL、Taq 0.25 μL，超純水補至25 μL。反應(yīng)程序：95℃ 3 min；95℃ 20 s，56℃ 20 s，72℃ 20 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。1.5%瓊脂糖電泳檢測。

1.6 逆境脅迫處理

逆境脅迫下擬南芥的根長試驗：完成消毒播種后的擬南芥經(jīng)過2 d的4℃春化，培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)入逆境1/2MS培養(yǎng)基的方皿中，方皿豎直放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后觀察記錄野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長表型，并拍照記錄，每個株系5棵單株，每個處理做3個重復(fù)。逆境脅迫處理所用的試劑及濃度設(shè)計如下：氯化鈉（NaCl）模擬鹽脅迫，濃度為0和150 mmol?L-1；甘露醇（mannitol）模擬干旱脅迫，濃度為0和400 mmol·L-1；激素類有0、5 μmol·L-1脫落酸（ABA）和10 μmol·L-1赤霉素（GA3）；氯化鋁（AlCl3）模擬重金屬脅迫，濃度為0和50 μmol·L-1。

2 結(jié)果

2.1 MiZAT10A和MiZAT10B生物信息學(xué)分析

定位于19號染色體上，定位于10號染色體上（圖1）。對和進行保守基序分析發(fā)現(xiàn)，兩個基因高度相似的基序可能和其功能一致有關(guān)。

分別選取和ATG上游-2.0 kb區(qū)域的啟動子序列進行元件分析，兩個基因均包含多個光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件，赤霉素響應(yīng)元件、水楊酸響應(yīng)元件、茉莉酸響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件等（圖2），說明這兩個表達受光、溫度、鹽脅迫、干旱脅迫等環(huán)境因子的影響；同時，脫落酸和赤霉素等多種激素也對其表達產(chǎn)生影響，從而共同調(diào)控芒果的生長發(fā)育。

A：MiZAT10A和MiZAT10B的染色體定位圖；B：MiZAT10A和MiZAT10B蛋白保守基序分布圖

圖2 MiZAT10A和MiZAT10B啟動子的順式元件分析

2.2 MiZAT10A和MiZAT10B的組織表達分析

為了明確和在‘四季蜜芒’不同生長發(fā)育時期的表達特性，利用實時熒光定量PCR對和的表達模式進行分析（圖3）。結(jié)果顯示，兩個在‘四季蜜芒’中表達模式類似，和在營養(yǎng)組織和生殖組織中均表達，其中在童期的頂芽和成年期的花中表達水平最高，而在成年期的莖中表達水平最低。

2.3 MiZAT10A和MiZAT10B轉(zhuǎn)基因?qū)M南芥開花的影響

采用花序浸染法將和轉(zhuǎn)入模式植物擬南芥中，通過PCR檢測共獲得9株轉(zhuǎn)基因株系和14株轉(zhuǎn)基因株系。半定量PCR分析顯示，和在野生型和轉(zhuǎn)pBI121空載體植株中表達水平為零，而在各個轉(zhuǎn)基因株系中，和可以正常表達（圖4）。

A：MiZAT10A組織表達；B：MiZAT10B組織表達。不同小寫字母代表在P＜0.05水平上差異顯著。下同

A1：過表達MiZAT10A轉(zhuǎn)基因擬南芥開花圖；A2：過表達MiZAT10A轉(zhuǎn)基因擬南芥開花數(shù)據(jù)；B1：過表達MiZAT10B轉(zhuǎn)基因擬南芥開花圖；B2：過表達MiZAT10B轉(zhuǎn)基因擬南芥開花數(shù)據(jù) A1: Flowering photos of overexpressed MiZAT10A gene in Arabidopsis thaliana; A2: Flowering data of overexpressed MiZAT10A gene in Arabidopsis thaliana; B1: Flowering photos of overexpressed MiZAT10B gene in Arabidopsis thaliana; B2: Flowering data of overexpressed MiZAT10B gene in Arabidopsis thaliana

分別選取的OE-1、OE-4和OE-8以及的OE-7、OE-15和OE-31作為進一步研究的對象，以野生型擬南芥（WT）和轉(zhuǎn)空載體pBI121擬南芥為對照，對其開花時間進行統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示，陽性對照和陰性對照植株的開花時間分別為27.1 d和26.4 d，而超量表達的35S::MiZAT10A和35S::MiZAT10B轉(zhuǎn)基因植株的開花時間都平均約為24.5 d。因此，轉(zhuǎn)芒果和可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥提早成花。

2.4 MiZAT10A和MiZAT10B轉(zhuǎn)基因植株對逆境脅迫應(yīng)答的影響

為確定超量表達的鋅指蛋白基因是否能提高抗逆性，選取長勢一致的野生和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥，進行根的逆境脅迫處理（圖5）。由結(jié)果可知，對照組，即正常培養(yǎng)條件下，野生型擬南芥和超量表達和轉(zhuǎn)基因擬南芥之間長勢無顯著差異，說明和的超量表達并不影響擬南芥的根長生長；然而，150 mmol·L-1NaCl和300 mmol·L-1甘露醇處理下的擬南芥根長生長受到抑制，但超量表達和轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長受到的抑制程度顯著小于野生型擬南芥，說明超量表達的和提高了擬南芥的抗鹽和抗干旱能力；在5 μmol·L-1ABA和10 μmol·L-1GA3處理下，野生型擬南芥的根長生長受到抑制，而超量表達的和轉(zhuǎn)基因擬南芥在ABA的根長顯著長于野生型，在GA3處理下幾乎不受抑制，說明超量表達的和降低了ABA和GA3對擬南芥根長的敏感性；50 μmol·L-1AlCl3處理下，野生型擬南芥和超量表達和轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長生長出現(xiàn)顯著差異，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長優(yōu)于野生型，說明超量表達和轉(zhuǎn)基因增強了擬南芥對重金屬鋁的耐受性。

3 討論

3.1 MiZAT10A和MiZAT10B啟動子的順式元件分析

近年來，轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆過程中的作用是研究的熱點[25]，如CBF/DREB、MYB、CUC（NAC）、鋅指蛋白等[26]。啟動子不僅具有核心啟動元件，還在高等植物的基因表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，為研究植物基因功能提供了新的思路[27]。比如，大部分毛果楊鋅指蛋白基因[28]、蘋果[29]、麻風(fēng)樹[30]啟動子區(qū)域包含光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件和逆境脅迫響應(yīng)元件。本研究也得到類似的結(jié)果，在和中含有激素響應(yīng)元件、非生物脅迫響應(yīng)元件、光響應(yīng)元件以及多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，推測兩個基因可能受到光照、激素和逆境脅迫的影響。

3.2 MiZAT10A和MiZAT10B組織特異性表達分析

在葡萄中，的表達受脫落酸、干旱、高鹽、SA和MeJA的誘導(dǎo)，并對白粉病的感染也有快速反應(yīng)[31]；小麥受鹽誘導(dǎo)后，其表達量在根和葉中上調(diào)[32]；6個巨桉鋅指蛋白均受到鹽的誘導(dǎo)表達[33]；芒果（）和（）受到干旱、鹽和低溫的誘導(dǎo)表達[21]，表明其可能與非生物脅迫有關(guān)。水稻鋅指蛋白在花穗中表達[34]；毛果楊主要參與花的發(fā)育[28]；蒺藜苜蓿C2H2鋅指蛋白在花中特異性表達[35]。本研究中和在芽和花中的表達量較高，且芽到花呈上升趨勢，這表明兩個基因與芒果花芽分化有關(guān)。

3.3 MiZAT10A和MiZAT10B影響開花及逆境脅迫

前人研究發(fā)現(xiàn)，沙冬青可能參與成花[36]；小擬南芥表現(xiàn)為提前開花[37]；番茄促進開花[38]。本研究結(jié)果顯示超量表達的和分別使轉(zhuǎn)基因擬南芥提前2—3 d開花，證實其參與芒果的花期調(diào)控。

鋅指蛋白與植物的非生物脅迫密切相關(guān)。水稻過表達增強了其對鹽、冷、干旱脅迫的耐受性[39]；轉(zhuǎn)基因的小麥擬南芥在鹽脅迫下根長顯著長于野生型[40]。本研究也得到類似的結(jié)果，超量表達和的轉(zhuǎn)基因擬南芥在鹽、干旱和外源激素ABA的脅迫下，根長均優(yōu)于野生型擬南芥，說明超量表達的和提高了擬南芥對這些脅迫的抗性。GA3對主根的生長具有兩面性，低濃度的GA3會抑制根的生長，而高濃度GA3則會促進主根生長[41]，高濃度ABA抑制主根的生長[42]。本研究中，ABA抑制了WT主根的伸長，而轉(zhuǎn)基因擬南芥的主根受ABA抑制的程度顯著輕于對照，說明超量表達和減輕了ABA對擬南芥主根的脅迫。而GA3也抑制了WT主根的伸長，但轉(zhuǎn)基因擬南芥不受GA3的抑制。重金屬危害植物生長發(fā)育，尤其是根部[43]，本研究結(jié)果表明，重金屬處理下的超量表達和增強了擬南芥對重金屬鋁的耐受性。

A1：過表達MiZAT10A轉(zhuǎn)基因擬南芥逆境脅迫根長數(shù)據(jù)；A2：過表達MiZAT10B轉(zhuǎn)基因擬南芥逆境脅迫根長數(shù)據(jù)；B1：過表達轉(zhuǎn)MiZAT10A擬南芥根長數(shù)；B2：過表達MiZAT10B擬南芥根長；*表示在0.05水平上差異顯著

4 結(jié)論

超量表達芒果和可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因擬南芥提早2—3 d開花；同時，可以提高擬南芥在鹽脅迫、干旱脅迫和重金屬脅迫下的適應(yīng)能力，并能降低擬南芥對外源激素GA3和ABA的敏感性。

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Functional Analysis ofandGenes in Mango

MO WenJing, ZHU JiaWei, HE XinHua,YU HaiXia, JIANG HaiLing,QIN LiuFei,ZHANG YiLi,LI YuZe, LUO Cong

College of Agriculture, Guangxi University/State Key Laboratory of Subtropical Agricultural Biological Resources Protection and Utilization/National Experimental Teaching Demonstration Center of Plant Science, Nanning 530004

【】Zinc finger protein (ZFP) plays an important role in plant abiotic stress response. Therefore, to provide a theoretical basis for stress resistance breeding, this study aimed to analyze the response of two zinc finger protein genes ofandtransgenicto abiotic stresses, such as salt, drought, heavy metals and exogenous hormones. 【】The promoteracting elements and motif of mangoandgenes were predicted and analyzed by online software PLACE and MEME, respectively. The chromosome location map was drawn by TBtools software and SiJiMi gene annotation file (GFF file and unpublished). Tissue expression patterns ofandgenes were analyzed by qRT-PCR. The overexpression vectors ofandgenes were constructed and transformed intobyfloral-dip method. The phenotype ofandtransgenic plant were observed and recorded under salt, drought, heavy metals, abscisic acid and gibberellin treatments. 【】Promoter cis element analysis showed that there were many light response elements, hormone response elements and abiotic stress response elements in the promoter region ofandgenes. Expression analysis showed thatandwere highly expressed in buds and flowers. 9 ofand 14 oftransgenicstrains were obtained. Overexpression ofandsignificantly resulted early flowering compared with the control lines. The root length ofandoverexpressing transgenicwas significantly longer than that of control lines under salt stress, drought stress, heavy metal stress, GA3and ABA hormone treatments. 【】Overexpression ofandnot only promoted transgenicflowering early but also improved salt, drought, heavy metals and exogenous hormones GA3and ABA resistance.

mango; abiotic stress; zinc finger protein; expression; function analysis

2022-03-02；

2022-05-12

廣西自然科學(xué)基金（2015GXNSFAA139052）、國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西芒果創(chuàng)新團隊栽培與病蟲害防治崗位項目（nycytxgxcxtd- 2021-06-02）、科技先鋒隊‘強農(nóng)富民’‘富六個一’專項行動（202204）

莫文靜，E-mail：tuanzy97616@163.com。朱嘉偉，E-mail：zhujiaweiii1206@163.com。莫文靜和朱嘉偉為同等貢獻作者。通信作者羅聰，E-mail：22003luocong@163.com

（責任編輯 趙伶俐）