食源性金黃色葡萄球菌耐消毒劑基因檢測及消毒劑抗性研究

摘要：研究食源性金黃色葡萄球菌分離株耐消毒劑基因攜帶情況及對常用5種消毒劑的抗性。對41株食源性金黃色葡萄球菌分離株進行耐消毒劑基因qacA/B PCR擴增，檢測耐消毒劑基因攜帶情況。選取6株具有不同耐藥特征和qacA/B基因攜帶情況的菌株，對其進行5種常用消毒劑的抗性檢測，以了解食源性金黃色葡萄球菌菌株耐消毒劑基因的攜帶情況以及對常用消毒劑的抗性特征。 結果表明實驗菌株qacA/B基因攜帶率為19.51%，其中MRSA菌株qacA/B基因檢出率為37.5%，大于MSSA菌株中15.15%的檢出率。 實驗菌株對戊二醛與84消毒液具有較一致的抗性，MRSA菌株對醋酸氯己定、碘伏的抗性強于MSSA菌株。金黃色葡萄球菌菌株具有較高的qacA/B檢出率，對常用消毒劑具有不同的抗性特征，需加強消毒劑使用管理，防止消毒劑抗性菌株的出現(xiàn)以及在不同環(huán)境中的傳播。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；消毒劑；抗性；最小抑菌濃度金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是最常見的人體致病菌之一，其既可引起院內(nèi)和社區(qū)獲得性感染，也可產(chǎn)生腸毒素引起食物中毒，是重要的造成食源性感染的病原菌［1］。

目前，消毒劑在世界范圍內(nèi)被廣泛應用于醫(yī)療器械、醫(yī)院和家庭環(huán)境設施、食品加工領域等的消毒處理，甚至存在于化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品中。然而，消毒劑的濫用和誤用，導致細菌產(chǎn)生對消毒劑的抗性這一問題也正在迅速出現(xiàn)［2］。基于此，本研究選取41株食源性金黃色葡萄球菌分離菌株，進行了耐消毒劑基因檢測，并選取6株菌株進行了5種常用消毒劑的抗性檢測，以了解食源性金黃色葡萄球菌菌株的耐消毒劑基因攜帶情況和消毒劑抗性情況，報告如下。

1試驗

1.1材料

1.1.1菌株

實驗室保存食源性金黃色葡萄球菌41株，其中MRSA菌株8株，MSSA菌株33 株，金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213為對照菌株。

1.1.2試劑與儀器

戊二醛、碘伏、84消毒液購自山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司，醋酸氯己丁購自廣州和泰醫(yī)療器械有限公司，過氧乙酸購自山東瑞泰奇洗滌消毒科技有限公司。

細菌基因組DNA快速提取試劑盒、瓊脂糖、DNA Marker、即用PCR擴增試劑盒等試劑均購于生工生物工程（上海）股份有限公司，營養(yǎng)肉湯、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購自廣州環(huán)凱微生物有限公司。

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海三申醫(yī)療器械有限公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）、數(shù)控恒溫水浴箱（江蘇新康醫(yī)療器械有限公司）、PCR基因擴增儀（美國Tarkara）、凝膠成像系統(tǒng)（美國BioRad）。

1.1.3PCR引物

qacA/B基因擴增引物序列參照文獻［3］，F(xiàn)orward primer： 5’GCTGCATTTATGACAATGTTTG3’; Reverse Primer： 5’AATCCCACCTACTAAAGCAG3’，引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2方法

1.2.1qacA/B耐消毒劑基因檢測

菌株復蘇后，收集營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)金黃色葡萄球菌菌株，按照細菌基因組DNA快速提取試劑盒操作提取各菌株基因組，-20 ℃保存。

聚合酶鏈反應（PCR）方法檢測各菌株qacA/B耐消毒劑基因。擴增體系為：模板3 μL，上下游引物1.5 μL（10 μmol/L）， 2×TaqPCRMasterMix 10 μL，ddH2O補足20 μL。反應條件為：94 ℃4 min；95 ℃變性45 s，41 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。取10 μL 擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.2菌懸液制備

食源性金黃色葡萄球菌菌株6株（MRSA和 MSSA菌株各3株），標準菌株ATCC29213作為對照株。將以上各菌株接種于營養(yǎng)肉湯37 ℃培養(yǎng)24 h，用營養(yǎng)肉湯制備成吸光度為1 OD（波長600 nm）的菌懸液備用。

1.2.3MIC測定

根據(jù)肉湯稀釋法［4］進行各菌株MIC測定。用無菌超純水將每種消毒液做系列對半梯度稀釋，取2.5 mL各不同梯度消毒液加入裝有2.5 mL兩倍濃度營養(yǎng)肉湯的培養(yǎng)瓶中，再加入10 μL不同菌株的菌懸液混勻，同時分別設置不加消毒劑和不加菌懸液的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)瓶作為陽性和陰性對照。將各營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)瓶37 ℃培養(yǎng)48 h，以各試驗組培養(yǎng)瓶中無菌生長的最低濃度作為菌株對消毒劑的MIC值。

2結果

2.1qacA/B基因檢測

qacA/B基因的檢出情況如表1所示。在41株金黃色葡萄球菌菌株中共檢出8株攜帶qacA/B基因，總檢出率為19.51%。MRSA菌株qacA/B基因檢出率為37.5%，大于MSSA菌株中15.15% 的檢出率。但組間卡方檢驗結果表明，MRSA菌株和MSSA菌株qacA/B基因攜帶率間無明顯統(tǒng)計差異。qacA/B基因擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。

2.2MIC檢測

5種消毒劑對實驗菌株的最小抑菌濃度（MIC）測定結果如表2所示。戊二醛對實驗菌株和對照菌株的MIC均為687.5 mg/L；“ 84”消毒劑對實驗菌株的MIC值均為500 mg/L，大于對照菌株的250 mg/L，醋酸氯己定對1株MSSA/-菌株的MIC為0.938 mg/L，對其余5株食源性菌株的MIC為1.875 mg/L，碘伏對1株MSSA/-菌株的MIC為312.5 mg/L，對其它5株菌株的MIC為625 mg/L，對照菌株的MIC為312.5 mg/L；過氧乙酸對實驗菌株的MIC均為137.5 mg/L，對照菌株的MIC為34.375 mg/L。

3討論

金黃色葡萄球菌是臨床分離的最常見的革蘭陽性病原菌，也是引起食物中毒的常見的病原菌。隨著抗生素在醫(yī)療衛(wèi)生、食品加工以及畜牧養(yǎng)殖業(yè)等領域廣泛使用，金黃色葡萄球菌的耐藥性增強問題日益嚴峻。為控制金黃色葡萄球菌等病原菌在醫(yī)院內(nèi)外的感染及傳播，不同種類的消毒劑被大量應用。然而在消毒劑的選擇壓力作用下，消毒劑抗性菌株不斷產(chǎn)生，甚至有抗生素和消毒劑交叉抗性菌株的出現(xiàn)。

質(zhì)粒介導的外排泵機制是細菌對多種陽離子消毒劑產(chǎn)生抗性的重要機制。質(zhì)粒介導的外排泵主要是由不同質(zhì)粒上的消毒劑抗性決定子qac基因家族編碼。亞洲地區(qū)MRSA菌株中qacA/B為介導消毒劑抗性的最重要基因，檢出率遠高于其他qac基因［5］。然而不同國家和地區(qū)qacA/B檢出率差別較大，巴西較高（80%），日本較低（32.6%）［6］。

本研究對不同食源性菌株qacA/B基因的檢測結果表明，MRSA菌株的檢出率分別為37.5% （3/8）和20.69% （6/29），高于李小輝等［7］報道的qacA/B在MRSA菌株中的檢出率（18.5%），這可能與不同地區(qū)間消毒劑的使用情況差異有關。

有研究表明，抗生素和消毒劑抗性可能存在相關性。Ho等［8］的研究顯示，氯己丁對MRSA菌株的MIC是MSSA菌株的2倍。本研究中幾種消毒劑對實驗菌株的MIC檢測結果顯示，“84”消毒劑和戊二醛對實驗菌株具有較強的抑菌一致性，表明其對金葡菌菌株有著均一的殺菌效果。而醋酸氯己定、碘伏對一株MSSA菌株的MIC低于其他MRSA菌株，表明這兩種消毒劑的殺菌作用一致性較弱，是否表明MRSA菌株對這兩種消毒劑的抗性高于MSSA菌株還需要增加實驗菌株的數(shù)量進一步驗證。

4結論

本研究中金黃色葡萄球菌菌株具有較高的qacA/B檢出率，戊二醛與“84”消毒液對實驗菌株具有較一致的抗性。由于金葡菌對消毒劑抗性的產(chǎn)生以及消毒劑基因的傳播存在多種復雜的形成方式，需加強消毒劑使用管理和監(jiān)測，指導消毒劑合理應用，防止消毒劑抗性菌株甚至抗生素交叉抗性菌株的形成和傳播擴散。

參考文獻：

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基金項目：湖北省自然科學基金項目（2016CFB319）；襄陽市科技研究與開發(fā)項目（2021ZD23 ）

作者簡介：朱金平，女，江蘇泗洪人，本科，研究方向：兒童保健。

通信作者：肖娜，女，河南確山人，高級實驗師，碩士，研究方向：病原菌耐藥性。