廣西田東縣部分豬場四種疫病病原及三種疫病血清學(xué)的檢測與分析

班雪花，黃寶學(xué)*，劉春西 ， 覃鳳嬌

(1.田東縣動物疫病預(yù)防控制中心，廣西 田東531500；2.田東縣祥周鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站；3.田東縣林逢鎮(zhèn)水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)站)

疫病的流行是制約生豬產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展的主要因素之一，尤其是傳染性強的病毒性疫病，對養(yǎng)豬業(yè)危害日趨嚴(yán)重。相關(guān)研究結(jié)果表明，豬瘟(CSF)、高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征(HP-PRRS)、豬偽狂犬病(PR)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)是危害當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)的四種重要的病毒性疫病，這些病原常以單獨或混合感染的方式感染豬，引起豬體溫升高、腹瀉、繁殖障礙、呼吸困難等癥狀，造成豬群生長緩慢或停滯、病殘和死亡豬只數(shù)量增多，飼料報酬降低、生長速度和豬群整體均勻度降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，甚至危害到公共衛(wèi)生安全。因此，在養(yǎng)豬生產(chǎn)中對這四種疫病的防控尤為重要。

隨著養(yǎng)殖戶防控意識的提高，很多養(yǎng)豬場對以上四種疫病采取了疫苗免疫、結(jié)合凈化和生物安全措施進(jìn)行防控，但由于飼養(yǎng)管理不當(dāng)、防疫操作不規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)化養(yǎng)殖滯后、不注重飼養(yǎng)環(huán)境等各方面原因，上述疫病仍在豬群發(fā)生和流行。為掌握2021年廣西田東縣不同養(yǎng)殖階段豬群CSFV、HP-PRRSV、PCV-2和 PRV感染情況及整體免疫抗體水平，筆者利用 PCR、RT-PCR與ELISA方法開展監(jiān)測，以便為這些疫病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣方案與樣品來源

田東縣有10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)，每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)選定2個養(yǎng)殖量300頭以上的豬場為調(diào)查監(jiān)測對象，全縣共選定20個豬場為調(diào)查監(jiān)測對象，2021年1～12月按采樣計劃采集樣品，并做好樣品信息記錄，置于-20℃冰箱保存待檢。

1.1.1 組織樣品 調(diào)查監(jiān)測期間，對監(jiān)測對象的20個場發(fā)現(xiàn)有疑似豬瘟高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(豬藍(lán)耳病)、豬圓環(huán)病毒 2 型和豬偽狂犬病這四種疫病臨床癥狀的死淘豬，由田東縣動物疫病預(yù)防控制中心負(fù)責(zé)采集組織樣品，每份組織樣品包含脾臟、肺臟、扁桃體各約10 g、腹股溝淺淋巴結(jié)2個，用 10毫升螺旋管存放冰凍保存，并當(dāng)場收集樣品信息，記錄死淘豬的死亡時間、年齡段、免疫情況、臨床癥狀、病理特征等相關(guān)信息，存檔以便檢測后進(jìn)行分析，期間采集到母豬31份、育肥豬52份、保育豬79份共162份組織樣品，送至百色市動物疫病預(yù)防控制中心實驗室進(jìn)行CSFV、HP-PRRSV、PCV2和 PRV檢測。

1.1.2 血清樣品 各個豬場均按本場免疫程序開展免疫，每個豬場在常規(guī)免疫21天后采集種母豬5份、育肥豬10份、保育豬5份，共20份血樣。采集當(dāng)天做好樣品信息記錄，記錄內(nèi)容包含動物年齡、免疫疫苗種類、廠家、批號、免疫日期等信息，存檔以便檢測后進(jìn)行分析，期間采集到母豬100份、育肥豬200份、保育豬100份共400份血樣。血樣由田東縣動物疫病預(yù)防控制中心實驗室分離，每份血清不少于1.5 mL，-20℃保存待檢。根據(jù)采集的免疫血清信息了解到，所有豬場均免疫了CSF弱毒疫苗和HP-PRRS滅活苗，PR活疫苗和PCV2滅活疫苗免疫只有少數(shù)豬場開展，因此不檢測PR-gB和PCV2免疫抗體，PRV-gE-ELISA檢測目的是了解野毒感染情況。此次檢測對采集到的400份血清樣品進(jìn)行CSFV、PRRSV及PRV-gE抗體檢測。

1.2 主要試劑與檢測儀器

豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體ELISA檢測試劑盒購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司。PRV-gE 抗體檢測試劑購自深圳真瑞生物科技有限公司、豬瘟病毒 RT-PCR 檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Nsp2 1594-1680變異株)RT-PCR試劑盒、 偽狂犬病病毒PCR檢測試劑盒、豬圓環(huán)病毒PCR檢測試劑盒，均購自深圳澳東檢驗檢測科技有限公司。病毒基因組DNA/RNA快速抽提試劑盒，為西安天隆科技有限公司產(chǎn)品。組織研磨儀、天隆核酸提取儀、羅氏熒光RT-PCR儀、Biometra PCR儀、酶標(biāo)儀等。

1.3 方法

1.3.1 病原學(xué)檢測 ①病毒DNA/RNA提取，研磨處理病料，根DNA/RNA快速抽提試劑盒說明書進(jìn)行DNA/RNA提取，對所獲得的DNA/RNA直接進(jìn)行PCR/RT-PCR檢測或-20℃保存?zhèn)溆?。?CSFV、HP-PRRSV的RT-PCR檢測，對提取的樣品RNA進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR擴(kuò)增體系25μL：樣品RNA 5 μL，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液16μL，待檢病毒反應(yīng)液2μL，RT-PCR酶混液2 μL。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10s，55℃延伸40s，共45個循環(huán)。判定標(biāo)準(zhǔn)：反應(yīng)結(jié)束后讀取Ct值及結(jié)合擴(kuò)增曲線顯示判定，Ct值≤37.0，且出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期，判為病原核酸陽性。無Ct值或Ct值>37.0判為陰性。③PCV2和PRV的PCR檢測，對提取的樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系同 ②。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min；95℃變性5s；55℃退火/延伸40s，共 45 個循環(huán)。判定標(biāo)準(zhǔn)：反應(yīng)結(jié)束后取讀取Ct值及結(jié)合擴(kuò)增曲線顯示判定，Ct值≤37.0，且出現(xiàn)明顯的指數(shù)增長期，判為病原核酸陽性。無Ct值或Ct值>37.0判為陰性。

1.3.2 血清抗體檢測 CSFV、HP-PRRSV及PRV-gE抗體檢測按照相應(yīng)的檢測試劑盒說明書開展檢測，CSFV抗體檢測結(jié)果OD450值>陽性對照OD450值×0.3判定為陽性；HP-PRRSV抗體檢測結(jié)果OD650值>陽性對照OD650值×0.3判定為陽性；PRV-gE抗體檢測結(jié)果樣本OD450平均值/ 陰性對照OD450平均值≤ 0.6判定為陽性。否則判定為陰性。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

根據(jù)實驗檢測結(jié)果，結(jié)合采集的組織樣品和血清樣品記錄信息，采用SPSS statistics 17.0，對檢測結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 病原學(xué)檢測結(jié)果分析 ① 四種病原檢測豬年齡段感染結(jié)果，從表1可知：樣品檢出率最高的是PCV2， 陽性率為 40.74%，同比其他檢測病種陽性率差異顯著；HP-PRRSV次之，陽性率為 6.79%；再次為PRV ，陽性率為 1.85%；162份組織樣品中未檢出CSFV病原。② 四種病原檢測豬季節(jié)感染結(jié)果，從表2可知：檢測的162份組織樣品中，HP-PRRSV在第2-3季度病原檢出率相對第1、4季度高；PRV在第1、4季度檢出病原，第2～3季度未發(fā)現(xiàn)病原；PCV2感染發(fā)病沒有明顯的季節(jié)性，一年四季均可發(fā)生。從統(tǒng)計來看，按季節(jié)統(tǒng)計四個病種合計檢測陽性率沒有明顯差異。

表1 四種病原檢測豬年齡段感染情況

表2 四種病原檢測豬季節(jié)感染情況

2.2 血清學(xué)檢測結(jié)果分析

由表3可知：CSFV、HP-PRRSV抗體陽性率均達(dá)到了國家規(guī)定70%以上的要求。CSFV保育豬抗體水平與種母豬群、育肥豬群存在差異顯著。各養(yǎng)殖階段豬群PRV-gE均檢出抗體，種母豬的抗體陽性率最高,為23%，顯著高于育肥豬和保育豬。表明豬群感染PRV野毒較嚴(yán)重。

表3 不同階段豬群CSFV、HP-PRRV、PRV-gE抗體檢測結(jié)果

3 結(jié)論與討論

近年來，受非洲豬瘟疫情的影響，各豬場加強生物安全管理，為降低風(fēng)險而采取的綜合措施，對阻斷疫病的傳播與流行起到了重要作用。但是，本研究結(jié)果表明，HP-PRRS、PCV2 和PR三種病原還存在不同程度的風(fēng)險隱患，CSF病原雖然在本次檢測未發(fā)現(xiàn)，不代表它不存在，這四種疫病對豬群仍有不同程度的威脅，一但感染其中一種病毒都會對豬體產(chǎn)生免疫抑制和繁殖障礙，生產(chǎn)上一定要采取綜合防控措施。各豬場應(yīng)根據(jù)本場的疫病流行情況，根據(jù)季節(jié)氣候變化情況，采取免疫、監(jiān)測、凈化等綜合防控措施，切實做好CSF、HP-PRRSV、PRV、PCV2等四種疫病的防控。

3.1 鞏固當(dāng)前CSF的有效防控

本次CSFV檢測結(jié)果顯示：豬群CSFV抗體總陽性率為87%，超過了國家規(guī)定70%以上，表明田東縣豬場對豬瘟疫苗免疫較為重視，免疫效果較為理想。但不同種類別豬群之間的抗體陽性率存在差異，保育豬的抗體陽性率明顯低于種母豬與育肥豬，這與韋顯凱等的研究一致。疫苗免疫能夠降低疫病循環(huán)中的病原體數(shù)量，降低感染豬群的發(fā)病率和死亡率，能夠保護(hù)動物免于臨床發(fā)病，能夠使免疫豬群抗體陽性和抗原陽性呈反相關(guān)。本次檢測未能檢測到CSFV病原陽性，說明疫苗免疫取得了明顯成效，對控制疫病的發(fā)生與流行有一定的效果。但鑒于采集到的病料數(shù)量不多、覆蓋面不廣等因素影響，不排除豬瘟病原的存在。養(yǎng)豬生產(chǎn)中，應(yīng)定期對不同養(yǎng)殖階段豬群進(jìn)行疫苗免疫跟蹤監(jiān)測，尤其是對保育豬群進(jìn)行檢測，評估監(jiān)測結(jié)果，利用監(jiān)測數(shù)據(jù)對免疫程序進(jìn)行調(diào)整優(yōu)化，確保豬群在安全免疫范圍內(nèi)。

3.2 制定免疫計劃

本次HP-PRRSV檢測結(jié)果顯示：HP-PRRSV抗體總陽性率為77.5%，抗原總陽性率為 6.79%，說明HP-PRRSV在豬群中有一定的流行率。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，對照檢測中的HP-PRRSV陽性樣品信息，均免疫過HP-PRRS弱毒疫苗，但卻不能完全阻止HP-PRRSV感染。雖然，防止疫病的發(fā)生要采取提高飼養(yǎng)管理水平、嚴(yán)格的生物安全等綜合防控措施，但疫苗免疫仍是防控該病的最有效措施。免疫豬群還發(fā)生HP-PRRSV感染，是因為抗體效價達(dá)不到抵抗HP-PRRS野毒的要求。弱毒疫苗免疫效果與豬群中的流行毒株密切相關(guān)，其對同一基因型同源毒株(homologousisolate)提供幾乎完全保護(hù)，對異源毒株(heterologous isolate)提供部分保護(hù)，而對不同基因型毒株幾乎不提供保護(hù)。PRRSV極易變異，在疫病流行的同時，病毒基因組不斷發(fā)生變異，HP-PRRSV依然是廣西的優(yōu)勢流行毒株。養(yǎng)豬生產(chǎn)中，豬場應(yīng)重視選擇疫苗毒株與臨床流行毒株相匹配，要定期采集病料送實驗室檢測PRRSV毒株的類型，確定與哪種疫苗毒株的同源性和親緣關(guān)系最接近，才能使用該種疫苗毒株進(jìn)行免疫，實施針對性的免疫接種計劃。

3.3 做好PCV-2定期監(jiān)測

加強免疫接種，采取綜合防控措施。本研究發(fā)現(xiàn)，PCV2感染最為嚴(yán)重，是造成豬場豬死亡的主要病原，病原總陽性率達(dá)40.74%，高于黎軍199等2015—2019 年對廣西部分豬場病死豬5種病毒的抗原檢測，PCV2不同年度檢出率的范圍16.35%～36.11%，高于陳忠偉等2016—2019年對廣西玉林市部分豬場主要病毒性疫病監(jiān)測，對病死豬組織樣品PCV2不同年度檢出率范圍14.8%～20.88%。說明田東縣PCV2流行嚴(yán)重。分析可能是多數(shù)豬場不免疫PCV2疫苗、PCV2傳播能力強、傳播途徑廣泛，多為隱性感染，豬場不開展病原監(jiān)測淘汰陽性豬導(dǎo)致病原在豬場循環(huán)傳播、對患病豬沒有采取隔離治療、引種不規(guī)范、防疫混亂等因素有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，有5份樣品為PCV2與其他病混合感染，混合感染率為3.08%。韋顯凱等檢測了152份采自廣西地區(qū)的豬組織樣品，發(fā)現(xiàn)PCV2與其他病混合感染率為17.76%。同珂等檢測了152份采自華中部分地區(qū)發(fā)病豬群血清樣品， 發(fā)現(xiàn)PCV2與其他病混合感染率為66.39%。上述研究表明，豬群中的PCV2與其他病混合感染較為普遍，需引起重視。生產(chǎn)過程中，豬場應(yīng)加強疫苗的免疫接種，定期開展血清學(xué)與病原學(xué)監(jiān)測，制定科學(xué)合理的綜合防控措施，減少PCV2發(fā)生流行。

3.4 做好種豬群PR凈化工作

本研究發(fā)表現(xiàn)，不同養(yǎng)殖階段豬群中種母豬的PR野毒抗體陽性率最高，為 23%，病原檢測樣品中PRV在種母豬群檢出率也為最高，陽性率為6.45%。表明種母豬感染及帶毒現(xiàn)象嚴(yán)重。豬場中，母豬飼養(yǎng)時間較長，一旦感染PR野毒，可長期帶毒排毒，引起持續(xù)性感染，種豬群凈化是防控PRV的關(guān)鍵。目前，田東縣生豬養(yǎng)殖規(guī)模仍以中小型養(yǎng)殖為主，建議豬場有計劃對種豬群實行PR的凈化工作，采取免疫控制，制定合理的免疫程序，定期進(jìn)行抗體檢測，適時淘汰陽性種豬，不斷凈化種豬群，使豬群gE抗體呈陰性狀態(tài)，促進(jìn)豬場的健康發(fā)展。