炭疽、布病、結核病三重PCR檢測方法的建立與應用

豆 玲

(甘肅省動物疫病預防控制中心，甘肅 蘭州730046)

布魯氏菌主要侵害動物生殖系統(tǒng)，引起流產，而病原體能夠以精液、流產胎衣、乳腺分泌液等排出，人是終末宿主。目前，動物布魯氏菌病的實驗室檢測主要以RBPT和SAT等2種免疫學方法檢測為主。上述兩種方法抗原與血清用量較大，易感染人，且SAT檢測時間相對較長，現場檢測難以實現。人類通過直接或間接接觸炭疽芽孢桿菌可引起傳染，對畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全亦具有嚴重威脅。炭疽主要以細菌和血清檢測為主，細菌學檢測操作復雜，費時費力，存在一定的生物安全風險。血清學檢測目前尚無商品化診斷試劑盒，因而僅限于一些專門的實驗室進行。牛結核病目前以皮內變態(tài)反應診斷為主。該方法費時，操作難度大，必須進行現場操作，誤差大，假陽性較多。甘肅省歷來就是布病、炭疽、結核病的頻發(fā)地區(qū)。因此，尋求并建立一種簡單，迅速，系統(tǒng)準確的檢測方法，是保障畜牧業(yè)發(fā)展以及人類健康的迫切需要。PCR方法具有很高的檢出率，并且克服了常規(guī)方法耗時的缺點，被廣泛應用于動物疫病診斷中。本研究通過建立可一次性檢測三種病原的三重PCR檢測方法，并通過實驗驗證該方法靈敏度高、特異性強、重復性好，為動物及動物產品混合病菌的快速診斷提供了技術支撐。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 結核病、布魯氏菌病陽性滅活菌、炭疽芽孢疫苗來源同文后參考文獻第二和第九條提供的出處。

1.1.2 主要試劑 所購買試劑同文后參考文獻第二和第九條提供的出處。

1.1.3 主要儀器 小型高速離心機(sigma)、梯度PCR儀(德國Biometra T1)、凝膠成像處理系統(tǒng)(UVIvpro)等。

1.2 方法

1.2.1 設計與合成引物 布氏菌序列為BM21、結核菌序列為IS6110、炭疽質粒PXO1，利用Primer6.0軟件，設計三對特異性引物，由上海生工生物合成，其堿基序列、序列與擴增產物長度見表1。

表1 多重 PCR 引物

1.2.2 細菌基因組DNA的提取 對布魯氏菌液、炭疽芽孢疫苗和結核桿菌液進行滅活后各取100 μL，用一管式口腔拭子試劑盒提取模板DNA。

1.2.3 擴增目的基因片段 以提取的三種模板DNA，進行PCR擴增反應，對擴增后的產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并使用棋盤法對反應條件進行優(yōu)化，篩選出最適合的擴增程序見表2。

表2 多重 PCR 反應程序

1.2.4 對PCR產物進行鑒定 回收電泳產物，參照文后參考文獻第二和第九條〗中提供的方法進行鑒定。對陽性菌株進行測序，并與在GenBank已登錄的序列進行比對，根據同源性高低來鑒定PCR產物的正確性。

1.2.5 特異性試驗 建立好的三重PCR方法，對常見的巴氏桿菌、沙門氏菌等基因組DNA進行PCR擴增，比對特異性。

1.2.6 敏感性試驗 測定標準陽性DNA濃度，對其按10倍倍比稀釋后進行PCR方法檢測。

1.2.7 多重PCR檢測方法的臨床應用 對臨床上采集的23份病料進行多重PCR方法檢測，并與常規(guī)檢測結果進行比較，計算其符合率。符合率=(陽性數/總數)×100%

2 結果

2.1 布魯氏菌、炭疽桿菌、結核桿菌單一PCR擴增

單一PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳可見，退火溫度在56℃時，PCR擴增出布魯氏菌核酸DNA約255 bp，炭疽桿菌核酸DNA約329 bp，結核桿菌核酸DNA約129 bp三條特異性目的片段，大小與預期相符(如圖1)，確定了三重PCR的擴增條件為：預變性95℃5min，變性94℃ 30S，退火56℃ 30S，延伸72℃ 60S，共35個循環(huán)，72℃終延伸7 min。

M:DNA標準物;1:結核;2:布氏菌;3:炭疽

2.2 PCR產物鑒定

分析結果顯示，PCR陽性質粒與參照的炭疽、布氏菌、結核的苷酸序列同源性在98.0%以上，表明產物為預期擴增的目的片段。

2.3 三重PCR的特異性試驗

用建立的三重PCR方法檢測三種基因組DNA，均能擴增出相應的特異性目的條帶，但對巴氏桿菌、沙門氏菌以及鏈球菌混合作為模板進行PCR擴增，均未檢測到任何擴增產物，從而證實了所建多重PCR方法具有很好的特異性。結果如圖2所示。

M:DNA標準物;1:炭疽、布魯氏菌、結核菌;2:沙門氏菌、巴氏桿菌;3:鏈球菌、結核桿菌;4:巴氏桿菌、布魯氏菌;5:炭疽桿菌、鏈球菌;6:布氏菌、結核桿菌、沙門氏菌;7:炭疽桿菌、布魯氏菌、巴氏桿菌;8:炭疽桿菌、鏈球菌、結核桿菌;9:沙門氏菌、巴氏桿菌、鏈球菌;10:鏈球菌、沙門氏菌

2.4 三重PCR的敏感性試驗

對三種病菌的濃度進行測定，再分別進行10倍梯度的倍比稀釋，經多重PCR方法擴增凝膠電泳結果如圖3所示，該多重PCR方法對三種病菌的敏感性分別可達313fg/μL、345fg/μL以及322fg/μL以下。

M:DNA標準物質; 1:未稀釋;2:10倍稀釋;3:102倍稀釋;4:103倍稀釋;5: 104倍稀釋;6: 105倍稀釋7:106倍稀釋

2.5 三重PCR的重復性試驗

對倍比稀釋的三種DNA梯度重復檢測5次，并對相同樣品分別進行5次三PCR與單一PCR擴增檢測，所有檢測結果一致。

2.6 三重PCR檢測方法的可靠性

對三重PCR擴增產物同源性進行分析比較，可達99%～100%，充分證明了該三重PCR方法的可靠性。

2.7 三重PCR方法的臨床應用

用建立的多重PCR檢測臨床上的23份病料，其結果如圖4。第7、16、20號三重PCR檢測結果樣品為陽性，這與布病試管凝集試驗檢測結果符合率為100%；第20、22、23、24號樣品多重PCR檢測結果試驗呈陽性，與PPD結果符合率為100%；同時第20號臨床病料布魯氏菌核酸和結核桿菌核酸雙重陽性。

M:DNA 標準物質; 1:炭疽桿菌、布魯氏菌、結核桿菌;2～24:臨床病料

3 討論

布病、炭疽、結核這三種人獸共患病不但給甘肅省養(yǎng)殖畜牧業(yè)的發(fā)展帶來威脅與巨大的損失，且對人類的健康威脅嚴重。病原的分離鑒定培養(yǎng)或者傳統(tǒng)的實驗室檢測耗時長，操作繁瑣，單一PCR方法具有特異性強的特點，但是對多種病毒混合感染的鑒定不能實現。

本研究通過優(yōu)化PCR擴增程序，建立三重PCR方法，通過試驗均顯示檢測結果準確可靠?？梢淮涡钥焖贆z測鑒別布氏菌病、炭疽和結核三種病原體，這對于鑒別診斷臨床多種病原體混合感染的病料上具有獨特優(yōu)勢和實用價值。在采樣時僅用采集鼻腔棉拭子，相比于傳統(tǒng)的采集發(fā)病動物血清和組織樣本的生物安全風險較低，并能夠較好的避免獸醫(yī)工作人員感染上述人獸共患病。