LC-MS/MS法測定人血漿伊曲康唑和羥基伊曲康唑濃度

韋佳佳，傅雷宇，董露露，凌靜，胡楠，蔣艷，楊旭萍

伊曲康唑(itraconazole，ITZ)是第一代三唑類高效廣譜抗真菌藥，通過抑制麥角固醇合成通路上的細胞色素P450羊毛固醇14α-去甲基化酶發(fā)揮抗真菌作用[1]。對皮膚癬菌、孢子絲菌屬、念珠菌屬、暗色及雙相真菌等均具有較高的抗菌活性，在臨床治療真菌感染方面應(yīng)用廣泛[2]。伊曲康唑具有非線性藥代動力學(xué)特征，長期或大劑量使用可能引起藥物蓄積，從而產(chǎn)生毒副作用，對肝藥酶及腸P-糖蛋白(P-gP)的抑制作用可增加藥物相互作用不良反應(yīng)(adverse reactions，ADR)發(fā)生風(fēng)險。因此，臨床應(yīng)注重治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring，TDM)，調(diào)整給藥劑量，從而保障患者的用藥安全[3-4]。伊曲康唑主要通過細胞色素P450酶CYP3A4代謝，羥基伊曲康唑(hydroxyitraconazole，HITZ)為主要代謝產(chǎn)物，具有與原形藥物等效的抗菌活性[5]。本研究擬建立簡便、快速、準(zhǔn)確的人血漿伊曲康唑和羥基伊曲康唑的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法( LC-MS/MS)測定方法，為臨床TDM提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備 Jasper HPLC液相色譜儀(島津,日本)、AB Sciex Triple Quad 4500MD型液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測系統(tǒng)(AB SCIEX公司，美國)、 Vortex-Genie 2渦旋混合器(scientific industries，美國)、5417R低溫高速離心機(eppendorf，德國)、Direct-Q純水儀(millipore，美國)、BT25S電子分析天平(sartorius，德國)。

1.2 藥品與試劑 伊曲康唑(加拿大TRC公司；純度：98%；批號：13-GHZ-186-1)、羥基伊曲康唑(加拿大TRC公司；純度：97%；批號：11-KSS-103-4)、伊曲康唑-d9(中國Cmass公司；純度：97%；批號：2-OMK-97-1)。伊曲康唑、羥基伊曲康唑的內(nèi)標(biāo)為伊曲康唑-d9。甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)均購自美國Merck公司；甲酸(分析純度)、乙酸銨(分析純度)均購自美國Sigma-Aldrich公司；實驗用水由實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)自制。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜及質(zhì)譜條件 (1)色譜條件。色譜柱為Kinetex C18(3 mm×100 mm，2.6 μm)，柱溫：40 ℃，進樣量：5 μL，流動相A：5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液，流動相B：0.1%甲酸的甲醇溶液，流速：0.6 mL/min，洗脫方式：梯度洗脫，其中0.01～0.80 min，B相濃度40%，0.80～1.00 min，B相濃度40%→90%，1.00～3.50 min，B相濃度90%，3.50～4.00 min，B相濃度90%→40%，4.00～5.00min，B相濃度40%。(2)質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧電離源(ESI)，離子極性：正離子模式，掃描方式：多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)，噴射電壓：5 500 V，源溫度：550 ℃，霧化氣：50 psi，輔助氣：50 psi，氣簾氣：35 psi，碰撞氣：8 psi。各成分選用的離子對和DP、CE電壓如下：ITZ：m/z705.2 → 392.2，170V和50V；HITZ：m/z721.5 → 408.3，170V和50V；內(nèi)標(biāo)ITZ-d9：m/z714.3 → 401.4，160V和50V。

1.3.2 對照品貯備液的配制 精密稱取伊曲康唑和羥基伊曲康唑標(biāo)準(zhǔn)品適量，分別用甲醇定量配制成0.5和1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇依次稀釋成濃度為1、2、5、10、20、50、100、200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液和3、30、150 μg/mL的質(zhì)控工作液。精密稱取伊曲康唑-d9標(biāo)準(zhǔn)品適量，200 μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲備液由乙腈定量配制，臨用前用甲醇稀釋為500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.3 樣品處理方法 精密吸取樣本血漿50 μL置于1.5 mL EP管中，加入500 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液150 μL，渦旋振蕩3 min，16 400 r/min，離心10 min，取上清液20 μL置于1.5 mL EP管中，用50%甲醇水溶液稀釋至200 μL，置于自動進樣器。

2 結(jié)果

2.1 ITZ、HITZ及內(nèi)標(biāo)專屬性分析 取6份不同個體的人空白血漿，加入工作液制成定量下限樣本(0.1 μg/mL)和中濃度質(zhì)控樣本(3 μg/mL)，按“1.3.3”項方法處理并按“1.3.1”項條件進行LC-MS/MS分析。結(jié)果如圖1所示，ITZ、HITZ及內(nèi)標(biāo)(ITZ-d9)保留時間分別為 2.43、2.27及2.42 min，血漿中相應(yīng)色譜峰保留時間內(nèi)均無內(nèi)源性組分干擾，方法特異性良好。

2.2 ITZ和HITZ標(biāo)準(zhǔn)曲線 在人空白血漿中加入“1.3.2”項系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別配制成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本，按“1.3.3”項樣品處理方法處理后行LC-MS/MS分析，以待測物與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為因變量(Y)，待測物濃度為自變量(X)，構(gòu)建線性回歸模型，得出相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以加權(quán)(W=1/χ2)最小二乘法進行線性回歸運算。 ITZ標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.9819X+0.0189(r=0.9959)，HITZ標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.5474X+0.0131(r=0.9977)。ITZ和HITZ的檢出限均為0.002 μg/mL，定量限均為0.005 μg/mL。

2.3 不同濃度 ITZ和HITZ準(zhǔn)確度和精密度分析在人空白血漿中分別加入“1.3.2”項質(zhì)控工作液，配制成0.1、0.3、3、15 μg/mL質(zhì)控樣本，按“1.3.3”項方法處理樣品后行LC-MS/MS分析，每個濃度6份，在2周內(nèi)測定3次。根據(jù)當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算批內(nèi)和批間準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果顯示，不同濃度羥基伊曲康唑和伊曲康唑準(zhǔn)確度范圍為90.69%～114.20%，精密度RSD為1.19%～8.70%，滿足生物樣本的檢測需求。見表1。

表1 人血漿樣本中ITZ和HITZ準(zhǔn)確度和精密度

1A 空白血漿色譜圖 1B 空白血漿添加定量下限對照品色譜圖(0.1 μg/mL) 1C 空白血漿添加中濃度對照品色譜圖(3 μg/mL) 1D 臨床樣品色譜圖圖1 ITZ和HITZ及內(nèi)標(biāo)ITZ-d9提取離子色譜圖

2.4 不同濃度ITZ和HITZ提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分析 在人空白血漿中分別加入“1.3.2”項的質(zhì)控工作液，配制成0.3、3、15 μg/mL的質(zhì)控樣本，每個濃度6份，按“1.3.3”項方法處理后，按“1.3.1”項條件行LC-MS/MS分析，得到待測物峰面積A1。人空白血漿經(jīng)蛋白沉淀處理后，取上清液并加入質(zhì)控工作液，配制成0.3、3、15 μg/mL質(zhì)控樣本，每個濃度6份，同“1.3.3”項方法處理后進樣行LC-MS/MS分析，得到待測物峰面積A2，峰面積比A1/A2求得3種濃度待測物的提取回收率。結(jié)果顯示，3種濃度提取回收率范圍為80.49%～93.70%，RSD均<15%。另以純水配制0.3、3、15 μg/mL 3個濃度的樣本，每個濃度6份，同“1.3.3”項方法處理后得到待測物的峰面積A3，峰面積比A2/A3可求得3種濃度的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，3種濃度基質(zhì)效應(yīng)范圍為123.75%～136.63%，RSD均<15%。見表2。提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)均符合方法學(xué)要求。

2.5 不同濃度ITZ和HITZ穩(wěn)定性分析 在人空白血漿中分別加入“1.3.2”項3個濃度的質(zhì)控工作液各5 μL，每個濃度6份，分別在室溫下放置24 h；在4 ℃下放置72 h，56 ℃水浴30 min，在-80 ℃下，反復(fù)凍融3次，按“1.3.3”項方法處理后進樣行LC-MS/MS分析，分析處理后樣本在自動進樣器(15 ℃)中放置6 h的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，不同濃度ITZ和HITZ測定值與理論值的平均偏差均在±15%范圍內(nèi)， ITZ及其代謝物在本實驗涉及條件下穩(wěn)定。見表3。

表2 人血漿樣本中ITZ和HITZ提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分析

2.6 臨床應(yīng)用結(jié)果 經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意,應(yīng)用本研究所建立的方法測定了2020年3月—2021年3月 常州市第一人民醫(yī)院收治的8例侵襲性真菌感染患者口服伊曲康唑3天后達穩(wěn)態(tài)的血漿ITZ和HITZ濃度，其中男性3例，女性 5例，感染灶均位于肺部，真菌培養(yǎng)結(jié)果均顯示曲霉菌感染，均采用伊曲康唑口服液(150 mL∶1.5 g)20 mL bid的用藥方案。見表4。

表3 人血漿樣本中ITZ和HITZ穩(wěn)定性分析 (n=6)

表4 服藥患者血漿中ITZ和HITZ的血藥濃度

3 討論

伊曲康唑因口服吸收快、半衰期長、生物利用度高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于臨床抗真菌治療。但隨之出現(xiàn)的不良反應(yīng)也在增多，使藥物使用受到限制，血藥濃度監(jiān)測對調(diào)整給藥劑量，減少藥物不良反應(yīng)具有重要意義[6-7]。目前，同時測定人血漿中伊曲康唑及其代謝物的方法主要有微生物法、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography ，HPLC)法及LC-MS/MS法[8-9]，由于羥基伊曲康唑會明顯增強微生物活性，微生物檢測結(jié)果可比HPLC法高出2～3倍，最終導(dǎo)致檢測準(zhǔn)確度降低，而HPLC法分析時間較長，不適用于治療藥物監(jiān)測[10]。本研究通過Jasper HPLC液相色譜儀進行分離、富集ITZ和HITZ，用AB Sciex Triple Quad 4500MD型質(zhì)譜儀進行監(jiān)測，處理方法簡單、易于操作，準(zhǔn)確度高，特異性強，適于臨床血藥濃度監(jiān)測。伊曲康唑在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物為羥基伊曲康唑，其活性與伊曲康唑基本一致。由于伊曲康唑的臨床療效與血漿藥物的濃度和相互作用的藥物相關(guān)，臨床使用過程中通過治療藥物檢測及時調(diào)整劑量，優(yōu)化治療效果，從而避免藥物毒性。相關(guān)文獻[11]指出，當(dāng)伊曲康唑有效濃度>0.5 μg/mL，不建議谷濃度高于5 μg/mL 。

伊曲康唑不僅廣泛應(yīng)用于各種抗真菌感染治療，對多種腫瘤的抗癌作用亦顯著[12]。李慧霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑可促進腺苷酸蛋白激酶磷酸化誘發(fā)結(jié)直腸癌細胞鐵死亡，抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖。畢菡等[14]認為伊曲康唑可能通過調(diào)節(jié)Ca2+信號通路和癌癥轉(zhuǎn)移途徑有效抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移。江帆等[15]研究表明，伊曲康唑能夠通過調(diào)節(jié)B細胞淋巴瘤/白血病-2同源拮抗劑1信號通路的活化從而發(fā)揮抗胰腺癌作用。此外伊曲康唑在預(yù)防治療上也有應(yīng)用，李慧等[16]分析發(fā)現(xiàn)，伊曲康唑可預(yù)防淋巴瘤患兒應(yīng)用利妥昔單抗治療期間的繼發(fā)感染，通過伊曲康唑血藥濃度調(diào)整給藥劑量，降低感染率，具有較高的安全性。

本研究建立的LC-MS/MS法，特異性強，靈敏度高，操作簡單，血漿樣品用量少，分析時間較短，適用于臨床治療藥物監(jiān)測。