葉面噴施不同濃度腐胺復(fù)配劑對(duì)黃瓜幼苗高溫抗性的影響

劉宏運(yùn) 林威柱 王 健 孫 錦 束 勝 郭世榮 王 玉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇南京 210095）

腐胺（Put）廣泛存在于植物體內(nèi)，是一種含氮化合物，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)中具有重要的作用。短期高溫處理會(huì)增加植物葉片中Put 的含量，外源噴施Put 能夠通過(guò)調(diào)節(jié)NO 合成提高植物耐熱性（Kolupaev et al.，2021）。此外，在短期高溫脅迫前葉面噴施Put 可提高甜瓜的果實(shí)品質(zhì)（María et al.，2020）。褪黑素（MT）是一種生物調(diào)節(jié)劑，可以抑制ROS 產(chǎn)生，保護(hù)質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，提高黃瓜幼苗對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)性（徐向東 等，2010；Imran et al.，2021）。高溫脅迫誘導(dǎo)MT 積累，外源葉面噴施100 μmol·L-1MT 可有效提高番茄的耐熱性（Jahan et al.，2019，2021）。脯氨酸（Pro）是一種有效的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過(guò)保護(hù)生物大分子的功能結(jié)構(gòu)，為生理生化反應(yīng)提供充足的自由水和活性物質(zhì)，從而提高植物對(duì)脅迫的適應(yīng)性。外源施用Pro 能夠顯著提高植物抗氧化酶活性，減少高溫造成的氧化脅迫，增強(qiáng)植物的光合作用能力（蘇貝貝 等，2015）。高溫脅迫下，葉面噴施3 mmol·L-1的Pro 明顯促進(jìn)了黃瓜幼苗的生長(zhǎng)，降低細(xì)胞滲透勢(shì)，緩解了滲透脅迫對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制作用（劉書(shū)仁 等，2010）。黃腐酸鉀（MFA）是一種黃腐酸肥料，具有分子量小、易于生物吸收利用、生理活性強(qiáng)、易溶于水等特點(diǎn)；MFA 不僅可以調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)，還可以補(bǔ)充作物生長(zhǎng)發(fā)育所需的鉀元素（van Oosten et al.，2017）。MFA 也能夠提高植物中多種抗氧化酶的活性，降低電解質(zhì)滲透率和MDA 含量，提高根系活力，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收和植物生長(zhǎng)，從而增強(qiáng)植株耐熱性（林梅桂，2013；沈偉 等，2022）。

近年來(lái)，單獨(dú)施用Put、MT、Pro 和MFA 緩解逆境脅迫的研究報(bào)道較多，但對(duì)其復(fù)合效果的研究較少。本試驗(yàn)以Put 為主，配合施用MT、Pro 和MFA，研究不同濃度組合對(duì)黃瓜幼苗高溫抗性、光合速率和抗氧化酶活性的影響，以期篩選出緩解高溫脅迫最優(yōu)的配方，為指導(dǎo)設(shè)施黃瓜耐熱栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試黃瓜品種為津春4 號(hào)，購(gòu)自天津科潤(rùn)農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。試驗(yàn)于2020 年10—12 月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室進(jìn)行。選擇飽滿、整齊一致的種子，溫湯浸種后于28 ℃催芽，發(fā)芽后播于15 孔穴盤，育苗基質(zhì)購(gòu)自江蘇興農(nóng)基質(zhì)科技有限公司。育苗在人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，白天溫度控制在25～28 ℃，夜間溫度為18～20 ℃，14 h/10 h（晝/夜），相對(duì)濕度保持在75%～80%。試驗(yàn)處理采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），在第2 片真葉完全展開(kāi)時(shí)，各處理選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗15 株，葉面噴施不同濃度的Put 復(fù)配劑后放置于42 ℃光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫處理，以葉片噴施等量蒸餾水為對(duì)照，3 次重復(fù)。高溫處理48 h 后隨機(jī)選擇3 株取樣，測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。

表1 腐胺復(fù)配劑濃度篩選處理

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.2.1 光合及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 高溫處理結(jié)束后，將黃瓜幼苗移至25 ℃人工氣候室恢復(fù)1 h，選擇生長(zhǎng)點(diǎn)往下完全展開(kāi)的第2 片真葉，采用LI-6400 便攜式光合儀（美國(guó)LI-COR 公司）測(cè)定凈光合速率（Pn）、胞間CO2濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）等光合參數(shù)。測(cè)量時(shí)儀器的參數(shù)設(shè)定如下：光照強(qiáng)度為800 μmol·m-2·s-1，葉室內(nèi)溫度控制在25 ℃，葉室內(nèi)CO2濃度為380 μmol ·mol-1，相對(duì)濕度為60%～70%。

高溫處理48 h、葉片暗適應(yīng)30 min 后，采用PAM-2100 便攜式調(diào)制熒光儀（德國(guó)Walz 公司）測(cè)定生長(zhǎng)點(diǎn)往下完全展開(kāi)的第2 片真葉的PSⅡ最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率〔Y（Ⅱ）〕。

1.2.2 生理生化指標(biāo)測(cè)定 葉綠素含量采用乙醇浸提法測(cè)定（Wellburn，1994），相對(duì)電導(dǎo)率采用型號(hào)為DDS-11C 的電導(dǎo)率儀進(jìn)行測(cè)定（Hong et al.，2003），MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定（Hodges et al.，1999），可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定（Bradford，1976），H2O2含量采用紫外分光光度法測(cè)定（Velikova et al.，2000），超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法測(cè)定（Dhindsa et al.，1981），過(guò)氧化物酶（POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定（Kochba et al.，1977），過(guò)氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測(cè)定（Dhindsa et al.，1981）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用模糊數(shù)學(xué)中隸屬函數(shù)的方法，綜合評(píng)價(jià)不同處理的高溫抗性。挑選測(cè)定指標(biāo)中對(duì)植物高溫抗性正相關(guān)的指標(biāo)，并計(jì)算其指標(biāo)的隸屬函數(shù)值，計(jì)算公式為：

X（mz）＝（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）

結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)查我們發(fā)現(xiàn)在發(fā)生CRE感染的科室中，急診科、ICU和手術(shù)科室是感染的“重災(zāi)區(qū)”，這可能是由于以上科室的患者大多病情危重，機(jī)體免疫力較差，大多會(huì)接受抗生素治療，與醫(yī)護(hù)人員接觸更加密切等，因而更容易發(fā)生感染。多數(shù)學(xué)者都將既往接受過(guò)抗生素治療，老齡患者，機(jī)械通氣或其他有創(chuàng)支持治療，慢性疾病，曾接受過(guò)移植或進(jìn)行免疫抑制相關(guān)治療等列為危險(xiǎn)因素。還有研究者提出感染CRE為患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而這也促使我們?cè)谄綍r(shí)的工作中將更加關(guān)注具有相關(guān)危險(xiǎn)因素的患者。

挑選測(cè)定指標(biāo)中對(duì)植物高溫抗性負(fù)相關(guān)的指標(biāo)，計(jì)算其指標(biāo)的反隸屬函數(shù)值，計(jì)算公式為：

X（mf）＝1-（X-Xmin）/（Xmax-Xmin）

式中，X為該指標(biāo)的測(cè)量值，Xmax為測(cè)量指標(biāo)的最大值，Xmin為測(cè)量指標(biāo)的最小值。

將指標(biāo)的隸屬函數(shù)值和反隸屬函數(shù)值進(jìn)行累計(jì)相加，求平均值，平均值越大，則該處理的綜合高溫抗性越強(qiáng)，此配方效果越優(yōu)。

使用直觀分析法對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析（董如何 等，2004）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2017 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理并作圖，采用SPSS 18.0 軟件Duncan法進(jìn)行多重比較（P＜0.05），使用Pearson 分析各指標(biāo)相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗表型及高溫抗性指標(biāo)的影響

如圖1 所示，黃瓜幼苗對(duì)高溫脅迫比較敏感，高溫脅迫下對(duì)照幼苗葉片發(fā)黃、失水、萎蔫；T3、T4 和T6 處理效果較差，雖有一定緩解高溫脅迫的作用，但并不明顯；T7、T8 和T9 處理幼苗僅葉緣失水卷曲，植株形態(tài)較為正常，受高溫影響較小。

圖1 高溫脅迫下腐胺復(fù)配劑處理48 h 的黃瓜幼苗表型

從表2 可以看出，與對(duì)照相比，T1、T2、T5、T7、T8 和T9 處理顯著抑制了高溫誘導(dǎo)下黃瓜幼苗葉片相對(duì)電導(dǎo)率升高，其中T8 處理的效果最優(yōu)，降低了57.50%。外源噴施Put 復(fù)配劑能夠顯著降低H2O2含量，其中T9 處理的H2O2含量下降最多，比對(duì)照降低了40.64%。MDA 含量與相對(duì)電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)相同，T8 處理的效果最優(yōu)，比對(duì)照降低了76.00%。此外，Put 復(fù)配劑噴施處理在不同程度上增加了幼苗葉片可溶性蛋白含量，其中T9 處理可溶性蛋白含量最高，比對(duì)照增加了126.92%。

表2 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗高溫抗性指標(biāo)的影響 （FW）

2.2 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

如表3 所示，T7、T8 和T9 處理的黃瓜幼苗葉片葉綠素含量均顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高了21.90%、32.12% 和35.77%；T1、T7、T8 和T9處理的Fv/Fm 顯著高于對(duì)照，其中T9 處理最高，比對(duì)照增加了29.82%；T9 處理的Y（Ⅱ）亦最高，比對(duì)照增加了227.59%。

表3 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗葉片葉綠素含量及葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

2.3 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗光合作用的影響

如表4 所示，除T1、T4 和T5 處理外，其他處理的黃瓜幼苗葉片Pn 均顯著高于對(duì)照，其中T9處理最高，比對(duì)照提高了160.71%；此外，T2、T3、T6、T7 和T8 處理的Pn 分別比對(duì)照提高了81.92%、55.21%、65.03%、45.97% 和151.47%。T1、T2、T7、T8 和T9 處理的Ci 顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高了27.96%、93.45%、84.00%、63.48%和60.83%。與對(duì)照相比，外源噴施Put 復(fù)配劑能夠顯著提高高溫脅迫下黃瓜幼苗葉片的Tr，其中T9 處理Tr 最高，比對(duì)照提高了600.00%，效果最顯著；T1～T8 處理分別比對(duì)照提高了126.73%、164.36%、181.19%、121.78%、82.18%、169.31%、300.99%和111.88%。除T4 處理外，其他Put 復(fù)配劑處理的Gs 均顯著高于對(duì)照，其中T9處理Gs 最大，比對(duì)照提高了457.69%。

表4 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗葉片光合參數(shù)的影響

2.4 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響

由表5 可知，T9 處理的黃瓜幼苗葉片抗氧化酶活性均高于其他處理，且均顯著高于對(duì)照，SOD、POD、CAT 活性分別比對(duì)照提高了29.32%、31.66%、52.16%。此外，T1、T2、T7 和T8 處理的SOD 活性也顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高了19.96%、20.37%、18.65% 和20.29%；T8 處理的POD 活性顯著高于對(duì)照，比對(duì)照提高了29.14%；T1、T2、T5、T7 和T8 處理的CAT 活性也顯著高于對(duì)照，分別比對(duì)照提高了33.84%、19.42%、12.77%、32.67%和38.44%。

表5 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗抗氧化酶活性的影響（FW）

2.5 腐胺復(fù)配劑處理下黃瓜幼苗各指標(biāo)的相關(guān)性分析

將Put 復(fù)配劑處理下黃瓜幼苗的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明（圖2），各數(shù)據(jù)可分為兩組，Pn、Gs、Ci、Tr、Fv/Fm、Y（Ⅱ）、可溶性蛋白含量、SOD 活性、POD 活性和CAT 活性兩兩之間均成正相關(guān)關(guān)系，而與H2O2含量、MDA 含量、相對(duì)電導(dǎo)率均成負(fù)相關(guān)關(guān)系。Pn 與Gs、Fv/Fm、Y（Ⅱ）、SOD 活性和CAT 活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系。H2O2含量、MDA 含量和相對(duì)電導(dǎo)率與3 種抗氧化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。表明，Put 復(fù)配劑可能通過(guò)提高抗氧化酶活性清除H2O2，同時(shí)提高光合速率，進(jìn)而提高黃瓜幼苗的高溫抗性。

圖2 腐胺復(fù)配劑處理下黃瓜幼苗各指標(biāo)的相關(guān)關(guān)系

2.6 腐胺復(fù)配劑處理下黃瓜幼苗高溫抗性綜合評(píng)價(jià)

采用模糊隸屬函數(shù)法對(duì)不同濃度Put 復(fù)配劑處理的黃瓜幼苗葉片葉綠素含量、相對(duì)電導(dǎo)率、MDA 含量、H2O2含量、可溶性蛋白含量、SOD 活性、POD 活性和CAT 活性等8 項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行高溫抗性隸屬函數(shù)值計(jì)算，通過(guò)隸屬函數(shù)平均值進(jìn)行噴施效果的優(yōu)劣排名。結(jié)果表明（表6），T9 處理的隸屬函數(shù)平均值最高，為0.974，其次為T8 處理。表明，T9 處理黃瓜幼苗的高溫抗性最強(qiáng)，即8 mmol·L-1Put 配合施用0.3 g·L-1MFA、1.5 mmol·L-1Pro和50 μmol·L-1MT 緩解高溫脅迫對(duì)黃瓜幼苗傷害的效果最好。

表6 腐胺復(fù)配劑對(duì)高溫脅迫下黃瓜幼苗高溫抗性的影響

2.7 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

采用直觀分析法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明（表7），影響黃瓜幼苗高溫抗性因素的主次順序?yàn)椋篋＞B＞C＞A，即MT 的濃度對(duì)黃瓜幼苗高溫抗性的影響最大；比較各因素K1、K2、K3 大小，篩選出最優(yōu)的配方為A2B1C1D3。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫會(huì)破壞植物光合作用系統(tǒng)，導(dǎo)致光合效率下降，也會(huì)破壞抗氧化系統(tǒng)，提高ROS 和MDA 含量，影響植物正常的生理生化反應(yīng)（孫勝楠 等，2017）。更重要的是，高溫脅迫導(dǎo)致果實(shí)畸形和脫落，嚴(yán)重影響黃瓜的產(chǎn)量和品質(zhì)（薛思嘉等，2017）。

外源Put 通過(guò)調(diào)節(jié)H2O2和NO 合成提高植物抗氧化系統(tǒng)的功能，進(jìn)而增強(qiáng)植物的高溫脅迫抗性（Kolupaev et al.，2021；Jahan et al.，2022）。MT在植物耐熱方面有著重要的作用，外源施用MT 有效提高了甘藍(lán)、黃瓜、甜瓜和番茄等作物的耐熱性（徐向東 等，2010；曾慶棟 等，2017；Jahan et al.，2019；周永海 等，2020）。Pro 作為重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過(guò)提高植物的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力增強(qiáng)高溫脅迫抗性（曹毅 等，2011）。MFA 可以促進(jìn)植物對(duì)K+的利用，提高營(yíng)養(yǎng)吸收能力，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，在提高辣椒植株的耐熱性方面也有一定的作用（林梅桂，2013）。受到逆境脅迫的植物，體內(nèi)ROS 增多，細(xì)胞膜遭到破壞，導(dǎo)致膜透性增大，從而使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲，同時(shí)生成大量的MDA，而MDA 會(huì)進(jìn)一步加劇細(xì)胞生物膜的氧化反應(yīng)，造成生物膜結(jié)構(gòu)破壞（徐松華，2021）。因此，植物細(xì)胞內(nèi)MDA 含量可以間接代表其受氧化脅迫的程度。本試驗(yàn)結(jié)果表明，合適配比的Put復(fù)配劑處理能夠顯著降低黃瓜葉片的相對(duì)電導(dǎo)率，減少H2O2和MDA 含量，提高植物體內(nèi)的可溶性蛋白含量。向玥如等（2014）研究表明，逆境脅迫下外源多胺能夠清除植物體內(nèi)自由基和ROS，提高保護(hù)酶活性，降低膜脂過(guò)氧化程度。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)外源噴施合適配比的Put 復(fù)配劑后，黃瓜幼苗葉片中抗氧化酶的活性可得到不同程度的增強(qiáng)。因此，合適配比的Put 復(fù)配劑能夠減少植物質(zhì)膜的損傷，維持滲透平衡，減少氧化脅迫，提高植株抗性。

Put 復(fù)配劑處理可以緩解高溫脅迫對(duì)植物光合作用的抑制。當(dāng)植物遇到非生物脅迫時(shí)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)葉片氣孔的分布、大小和數(shù)量來(lái)適應(yīng)逆境，提高光合作用能力，抵抗外部環(huán)境脅迫（Casson &Gray，2008）。高溫脅迫下植物Gs 減小伴隨著Ci的降低，光合速率的降低是由于氣孔限制引起的，外源Put 復(fù)配劑的使用可通過(guò)解除氣孔因素的限制改善高溫對(duì)光合作用的影響。在高溫脅迫下，植物的光合系統(tǒng)會(huì)受到一定程度的損傷，因此葉綠素?zé)晒鈪?shù)也會(huì)受到相應(yīng)的影響（崔慶梅 等，2021）。高溫脅迫也會(huì)影響葉綠素合成相關(guān)酶的活性，降低光合色素的含量。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照相比，合適配比的外源Put 復(fù)配劑處理可以提高黃瓜幼苗葉片F(xiàn)v/Fm 和Y（Ⅱ），表明其能夠提高PSⅡ反應(yīng)中心內(nèi)的光能轉(zhuǎn)換效率，這可能與葉綠素含量的增加有關(guān)。

本試驗(yàn)中，隸屬函數(shù)綜合評(píng)價(jià)各處理的高溫抗性排序?yàn)門9＞T8＞T1＞T7＞T2＞T5＞T6＞T3＞CK＞T4。T9 處理的綜合排名最高，此配方可以在高溫脅迫下有效提高黃瓜幼苗光合作用，提高Fv/Fm 和Y（Ⅱ），降低相對(duì)電導(dǎo)率、H2O2和MDA 含量，提高可溶性蛋白含量及抗氧化酶SOD、POD、CAT 活性，有效緩解高溫脅迫引起的傷害。正交試驗(yàn)結(jié)果分析表明，4 mmol·L-1Put、0.3 g·L-1MFA、1.0 mmol·L-1Pro 和50 μmol·L-1MT 組成的腐胺復(fù)配制劑為最優(yōu)的配方。