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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接的蒲公英抗乳腺癌的機(jī)制研究*

    2023-01-31 11:57:16袁鑫怡曾淑欣楊潤李羿
    天津中醫(yī)藥 2023年1期
    關(guān)鍵詞:蒲公英靶點(diǎn)通路

    袁鑫怡,曾淑欣,楊潤,李羿

    (成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,成都 610500)

    中國每年女性乳腺癌發(fā)病率約7.7%,且病死率達(dá)8.12例/10萬[1],目前已位列女性癌癥發(fā)病率首位。乳腺癌受多基因多靶點(diǎn)控制,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確,晚期可出現(xiàn)多器官病變,威脅患者的生命。乳腺癌的治療手段多以放化療和根治性手術(shù)治療為主[2],治療效果佳,但并發(fā)癥較多,且現(xiàn)有的治療乳腺癌的藥物毒副作用大,容易產(chǎn)生耐受性。因此,亟待尋找新的乳腺癌治療藥物。

    蒲公英為菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz、堿地蒲公英Taraxracum borealisinense Kitam或同屬數(shù)種植物的干燥全草,含有黃酮類、多糖、萜類、酚類[3]等多種活性成分?,F(xiàn)代研究表明,蒲公英黃酮通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1及TIMP-2的表達(dá)來抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力[4];蒲公英多糖通過促進(jìn)P53和Bax蛋白表達(dá)、抑制B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡,抑制其增殖[5];蒲公英萜醇能夠顯著抑制T47D乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移并可誘導(dǎo)其凋亡[6]。但這些研究多聚焦于單一或指標(biāo)成分,而蒲公英抗乳腺癌的分子機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步深入研究。本研究擬利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整體性、系統(tǒng)性與中藥多成分、多靶點(diǎn)一致性的特點(diǎn),預(yù)測蒲公英抗乳腺癌作用可能的作用靶點(diǎn)和作用通路,結(jié)合分子對接法驗證其結(jié)果的可靠性,為蒲公英臨床深入研究和資源開發(fā)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 蒲公英活性成分和靶點(diǎn)的收集 在Batman-TCM 數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)里以“TARAXACUM MONGOLICUM”為檢索詞,以“Scorecutoff>20,AdjustedP-value<0.05”為條件,獲取蒲公英有效成分及其作用靶點(diǎn)信息,在TCMID數(shù)據(jù)庫(http://47.100.169.139/tcmid/search/)以“PU GONG YING”為檢索詞篩選有效成分,在TCMSP數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)以“OB(%)≥30,DL(%)≥0.18”為條件獲取 TCMID 數(shù)據(jù)庫中符合條件的蒲公英有效成分及其作用靶點(diǎn)信息。以CancerHSP 數(shù)據(jù)庫(https://old.tcmsp-e.com/CancerHSP.php)中的蒲公英有效成分及其靶點(diǎn)作為補(bǔ)充,檢索詞為“蒲公英”。

    1.2 “有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將1.1中得到的蒲公英有效成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件,構(gòu)建“有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

    1.3 乳腺癌靶點(diǎn)的收集及藥物-疾病靶點(diǎn)的獲取在 GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫(https://www.genecards.org/Search/Keyword?queryString=Breast%20Carcinoma)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)、TTD 數(shù)據(jù)庫(db.idrblab.net/ttd/) 和 DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/home/)中以“Breast Carcinoma”為檢索詞收集乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)信息。在Malacards數(shù)據(jù)庫(https://www.malacards.org)以“Breast Cancer”為檢索詞收集。在 Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(https://www.pharmgkb.org)里沒有“Breast Carcinoma”和“Breast Cancer”的信息,因此以“Carcinoma,ductal,breast”為檢索詞收集乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)信息。蒲公英有效成分作用靶點(diǎn)與乳腺癌疾病靶點(diǎn)通過venny2.1.1在線數(shù)據(jù) 庫(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)取交集,得到蒲公英抗乳腺癌的相關(guān)基因。

    1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 將1.3獲得的交集靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫,物種選擇“Homosapiens”,參數(shù)Interactionscore設(shè)定為0.40,保存結(jié)果并對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,分別建立network文件和type文件。將network文件和type文件信息依次導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行參數(shù)設(shè)置和調(diào)整,運(yùn)用CentiScaPe2.2計算得到Degree值、Betweenness值和Closeness值,在Excel中以“Degree>8.05,BetweennessunDir>40.00,ClosenessunDir>0.01”為條件篩選關(guān)鍵靶點(diǎn),最終獲得蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

    1.5 GO和KEGG通路富集分析 將1.4中得到的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/), 依 次 點(diǎn) 擊 “Official-Gene-Symbol”和“GeneList”,物種選擇“Homosapicns”。上傳數(shù)據(jù)后進(jìn)行KEGG通路富集分析,并從生物學(xué)過程BP(biologicalprocess)、細(xì)胞組分 CC(cellularcomponent)、分子功能MF(molecularfunction)3個方面進(jìn)行GO分析,P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出至Excel處理后導(dǎo)入微生信網(wǎng)站(http://www.bioinformatics.com.cn/)作圖得到 GO分析柱狀圖和KEGG通路分析氣泡圖。

    1.6 分子對接驗證 將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)作為受體,以“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的蒲公英活性成分作為配體,對兩者進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測,結(jié)合能數(shù)值越低表明結(jié)合能力越好。在 uniprot數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)輸入關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的基因名稱,查找得到靶點(diǎn)蛋白的uniprot號;在 RCSBPDB 數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)中輸入靶點(diǎn)蛋白的uniprot號,找到相對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白并下載其2D結(jié)構(gòu)保存為pdb格式;導(dǎo)入pymol軟件進(jìn)行去水和去配體操作,通過AntoDock軟件進(jìn)行加氫處理并導(dǎo)出為pdbqt文件;通過PubChem下載蒲公英活性成分2D結(jié)構(gòu)并保存為sdf格式,通過OpenBabel轉(zhuǎn)換為pdb格式文件,利用AntoDock軟件進(jìn)行檢測扭轉(zhuǎn)鍵和中心等預(yù)處理并導(dǎo)出為pdbqt文件;將pdbqt格式的配體和受體文件導(dǎo)入AntoDock軟件,并采用半柔性對接方法進(jìn)行對接預(yù)測分析,分析結(jié)果通過Pymol進(jìn)行可視化處理。

    2 結(jié)果

    2.1 蒲公英活性成分及其靶點(diǎn) 在Batman-TCM數(shù)據(jù)庫里得到蒲公英14種成分,其中6種沒有靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選了72種活性成分,只有5種活性成分符合條件,其中4種成分沒有目標(biāo)信息,1種活性成分在CancerHSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行篩選后得到。最后,總共獲得了10種活性成分,136個作用靶點(diǎn),基本信息見表1。

    表1 蒲公英活性成分及靶點(diǎn)Tab.1 Active ingredients and targets of dandelion

    2.2 “有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 “有效成分-作用靶點(diǎn)”圖如圖1所示,圖中黃色代表藥物,紅色橢圓形代表作用靶點(diǎn),綠色長方形代表有效成分,邊代表成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

    圖1 “有效成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram of“active ingredient-target of action”

    2.3 乳腺癌靶點(diǎn)的收集及藥物-疾病靶點(diǎn)的獲取 利用GeneCards、OMIM、TTD、DisGeNET、Pharmgkb、Malacards數(shù)據(jù)庫篩選得到1 856個乳腺癌疾病靶點(diǎn);最終通過韋恩數(shù)據(jù)庫2.1.1得到蒲公英抗乳腺癌的41個可能作用靶點(diǎn),詳細(xì)信息見圖2,靶點(diǎn)蛋白信息見OSID。

    圖2 蒲公英活性成分靶點(diǎn)與乳腺癌相關(guān)靶點(diǎn)的韋恩圖Fig.2 Wayne diagram of dandelion active ingredient target and breast cancer related target

    2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建 將獲得的交集靶點(diǎn)基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫,通過Cytoscape3.8.0軟件對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化,繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)及核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),見圖3和圖4。PPI網(wǎng)絡(luò)中包含40個節(jié)點(diǎn)和161條邊,顏色由深到淺表示節(jié)點(diǎn)的度值由大到小,節(jié)點(diǎn)由大到小表示節(jié)點(diǎn)的度值由大到小。經(jīng)篩選得到重要的基因有ESR1、PPARG、PTGS2等。

    圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

    圖4 核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.4 Core target network

    2.5 GO和KEGG通路富集分析 利用DAVID6.8數(shù)據(jù)庫對2.4中得到的10個關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析,從BP、CC、MF 3個方面進(jìn)行GO分析,共得到53條GO分析結(jié)果,按照P值大小進(jìn)行GO分析柱狀圖的繪制,見圖5、圖6和圖7,柱越高代表涉及此過程的基因數(shù)目越多。其中P<0.05的有47條GO分析結(jié)果,與BP有關(guān)的有RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄起始過程、類固醇激素介導(dǎo)的信號通路、應(yīng)對雌二醇RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、前列腺形態(tài)發(fā)生中分支的調(diào)節(jié)等;與CC相關(guān)的有核染色質(zhì)、核漿、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、蛋白質(zhì)復(fù)合體、細(xì)胞器膜等;與MF相關(guān)的有DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合、序列特異性DNA結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇激素受體活性等。KEGG分析共得到12條KEGG通路,按照P值大小進(jìn)行KEGG通路分析氣泡圖的繪制,氣泡顏色越深代表涉及此通路與疾病的相關(guān)性程度越高,見圖7。其中P<0.05的有6條KEGG通路,即癌癥通路、含血清素的神經(jīng)突觸、甲狀腺激素信號通路、癌癥中的蛋白多糖、癌癥中的微小RNA、甲狀腺癌,主要涉及的靶點(diǎn)有 AR、RXRA、CASP3、PRKCA、PPARG、PTGS2、CASP3、RXRA 和 ESR1。

    圖5 GO-BP柱狀圖Fig.5 GO-BP histogram

    圖6 GO-CC柱狀圖Fig.6 GO-CC histogram

    圖7 GO-MF柱狀圖Fig.7 GO-MF histogram

    2.6 分子對接驗證 本研究將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名靠前的靶點(diǎn)PTGS2、PPARG、ESR1與“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖中度值排名靠前的蒲公英萜醇、蒲公英甾醇、七葉內(nèi)酯進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測,靶點(diǎn)蛋白作為受體,活性成分作為配體。一般認(rèn)為,當(dāng)受體與配體結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定時,其能量越低,產(chǎn)生的相互作用型越大[7]。根據(jù)對接結(jié)果可知,除了Taraxerol和PTGS2的結(jié)合能大于零以外,其余成分和靶點(diǎn)的結(jié)合能都小于零,說明大部分成分和靶點(diǎn)都具有良好的結(jié)合活性。其中Taraxerol和ESR1的結(jié)合能最低,結(jié)合能力最好;Taraxasterol和PTGS2、PPARG、ESR1的結(jié)合能都較低,結(jié)合能力較好;Esculetin和PTGS2、PPARG、ESR1的結(jié)合能都較低,結(jié)合能力較好。上述成分與關(guān)鍵抗乳腺癌靶點(diǎn)最佳對接結(jié)構(gòu)見圖8,全部對接結(jié)合能結(jié)果見表2。

    圖8 KEGG氣泡圖Fig.8 KEGG bubble diagram

    表2 分子對接結(jié)合能Tab.2 Molecular docking binding energy

    3 討論

    本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,構(gòu)建蒲公英“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),通過多個數(shù)據(jù)庫篩選到10種活性成分和137個作用靶點(diǎn),其中與乳腺癌相關(guān)的靶點(diǎn)有41個,涉及ESR1、PPARG、PTGS2等10個關(guān)鍵靶點(diǎn),揭示了蒲公英抗乳腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。分子對接結(jié)果顯示,蒲公英與抗乳腺癌靶點(diǎn)結(jié)合能較低,說明其有良好的抗癌活性。

    蒲公英發(fā)揮抗乳腺癌作用的有效成分可能是蒲公英萜醇、蒲公英甾醇和七葉內(nèi)酯。研究表明,蒲公英萜醇通過誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生自噬,從而抑制細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與抑制mTOR信號通路有關(guān)[8];蒲公英甾醇在腫瘤發(fā)展的多個階段均發(fā)揮了作用,包括抑制腫瘤發(fā)生、促進(jìn)和誘導(dǎo)細(xì)胞分化,可以有效地抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[9];七葉內(nèi)酯誘導(dǎo)涉及細(xì)胞凋亡的細(xì)胞毒性,其機(jī)制可能與降低線粒體膜電位、促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放以及水解激活胱天蛋白酶-9/胱天蛋白酶-3的蛋白有關(guān)[10]。

    為闡明蒲公英抗乳腺癌的機(jī)制,將PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中篩選得到的10個關(guān)鍵靶點(diǎn)通過GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)蒲公英抗乳腺癌的BP涉及激素代謝過程、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等;CC主要涉及對核漿、核染色質(zhì)、蛋白質(zhì)復(fù)合體和RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的調(diào)控;MF主要涉及DNA結(jié)合、酶結(jié)合、類固醇結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性等。GO富集分析發(fā)現(xiàn)蒲公英抗乳腺癌的主要靶點(diǎn)有AR、RXRA、PPARG和ESR1。AR作為介導(dǎo)雄激素生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)受體,可以通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路參與乳腺的發(fā)育,同時能調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的增殖[11];RXRA是配體依賴的核受體家族的重要成員,在炎癥反應(yīng)和代謝障礙中發(fā)揮重要作用,而乳腺癌特別是三陰型乳腺癌的發(fā)生發(fā)展始終伴隨著炎癥反應(yīng)[12];PPARG可調(diào)節(jié)糖脂代謝、細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞凋亡、炎癥、肥胖等[13],研究發(fā)現(xiàn)PPARG激活可減弱腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[14],PPARG作為抑癌基因在乳腺癌的腫瘤發(fā)生上起著關(guān)鍵作用,并且與乳腺癌患者總生存時間相關(guān),研究表明PPARG可通過介導(dǎo)FABP4抑制乳腺癌的細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移及侵犯[15];ESR1參與乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌和骨質(zhì)疏松癥在內(nèi)的病理過程,它參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄信號通路及乳腺癌等婦科腫瘤細(xì)胞的增殖。

    通過KEGG通路富集分析,發(fā)現(xiàn)蒲公英抗乳腺癌的通路主要是癌癥通路、癌癥中的微小RNA通路和甲狀腺激素信號通路等,涉及的主要靶點(diǎn)有CASP3、PRKCA和PTGS2。癌癥中的微小RNA可以在各類腫瘤和腫瘤組織異常表達(dá),參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡等[16];甲狀腺激素可促進(jìn)血管生成、抗細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[17]。CASP3編碼的蛋白質(zhì)是半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶,在腫瘤細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著關(guān)鍵作用,通常被視作癌癥治療效果的標(biāo)志物,研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞利用凋亡過程產(chǎn)生有效的生長刺激信號,而活化的CASP3是細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵執(zhí)行者,參與生長刺激[18]。PRKCA屬于絲氨酸和蘇氨酸特異性蛋白激酶家族,可能與腫瘤細(xì)胞過度增殖相關(guān),它參與多種細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑,在許多不同的細(xì)胞過程中發(fā)揮作用,如細(xì)胞黏附、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、細(xì)胞周期檢查點(diǎn)和細(xì)胞體積控制等;PTGS2是環(huán)氧合酶-2(COX-2)的編碼基因,而COX-2是誘導(dǎo)型酶,可參與炎癥反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等多種病理過程[19],PTGS2通過在乳腺癌中的過表達(dá)促進(jìn)血管再生、腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,Esculetin和PTGS2對接活性好,有效抑制了PTGS2的表達(dá),可以預(yù)測為蒲公英治療乳腺癌的可能作用靶點(diǎn)。

    綜上所述,本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法初步闡述了蒲公英抗乳腺癌的作用機(jī)制,通過對具有多成分、多靶點(diǎn)特點(diǎn)的蒲公英與乳腺癌復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的研究,闡述了蒲公英抗乳腺癌的有效成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)、涉及的生物過程和通路,使“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化,為后續(xù)研究蒲公英抗乳腺癌提供了理論依據(jù)。

    圖9 關(guān)鍵抗乳腺癌靶點(diǎn)和活性成分最佳對接圖Fig.9 Optimal docking diagram of key anti breast cancer targets and active ingredients

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