腹部推拿調(diào)控Tryptase-PAR2-PKCε通路防治IBS-D內(nèi)臟痛的機(jī)制研究*

李華南，王毓巖，張小凡，張瑋，馬菲，董樺，王金貴

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)針灸臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300381；2．國家中醫(yī)藥管理局推拿手法生物效應(yīng)三級實(shí)驗(yàn)室，天津 300381；3．天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

腸易激綜合征（IBS）是消化系統(tǒng)疾病中最常見的慢性非炎癥性疾病之一，主要以腹痛和排便習(xí)慣的改變?yōu)樘卣鳌８鶕?jù)異常的排便表現(xiàn)，IBS分為4個(gè)亞型：腹瀉型（IBS-D）、便秘型、混合型和不定型。全球的IBS發(fā)病率為10%～17%[1]，其中IBS-D占比為23．4%，超過其他亞型[2]。隨著生活和工作壓力的增加，近年來IBS-D患病人群逐漸年輕化，且男性多于女性，給患者和家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。

由于IBS-D發(fā)病復(fù)雜，其機(jī)制至今尚未完全明確。隨著現(xiàn)代研究的深入，內(nèi)臟高敏感被認(rèn)為是其重要病理生理發(fā)生機(jī)制之一[3]，主要反映出對疼痛刺激的敏感性增強(qiáng)，或?qū)Φ陀谔弁撮撝档拇碳ち扛械讲贿m或反應(yīng)強(qiáng)烈，癥狀表現(xiàn)為腹痛和（或）腹部不適。由于無法確定疾病的主要病因，因此臨床上多對癥治療，包括：緩瀉劑、解痙劑及腸道微生態(tài)藥物等。腹部推拿療法作為中醫(yī)藥的重要分支，其施用于腹部，通過對人體臟腑經(jīng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，在本病的治療上取得了很好的療效[4]。

近年來，肥大細(xì)胞（MC）在IBS-D發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸受到研究者們的關(guān)注。MC在IBS-D發(fā)病中作用重要，而引人關(guān)注的是MC在IBS-D內(nèi)臟敏感性方面的作用，MC活化也被認(rèn)為是內(nèi)臟高敏感發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，是生理學(xué)和病理學(xué)疼痛途徑的重要調(diào)節(jié)劑。研究顯示當(dāng)多種機(jī)械、化學(xué)刺激或神經(jīng)遞質(zhì)作用于神經(jīng)末梢，引起外周神經(jīng)損傷后會產(chǎn)生炎性反應(yīng)，激發(fā)免疫細(xì)胞如MCs活化脫顆粒，分泌釋放類胰蛋白酶（Tryptase）、白細(xì)胞介素 5、5-羥色胺、組胺以及神經(jīng)生長因子，進(jìn)而引起蛋白酶激活受體2（PAR2）的過度表達(dá)，且進(jìn)一步激活蛋白激酶Cε（PKCε），PKCε活化可介導(dǎo)辣椒素受體1磷酸化[5-6]，最終導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感的發(fā)生。基于上述研究基礎(chǔ)，本文采用母嬰分離聯(lián)合慢性應(yīng)激刺激（強(qiáng)迫游泳+束縛應(yīng)激+夾尾刺激法）造模方式構(gòu)建IBS-D大鼠模型，觀察腹部推拿對IBS-D大鼠模型腸道敏感化的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為腹部推拿的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Spargue-Dawle（SD）孕鼠購置于北京華阜康有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證書號：SCXK（京）2020-004。大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，恒溫恒濕，每日自由飲食水。通過1周的常規(guī)適應(yīng)性喂養(yǎng)，待孕鼠正常生產(chǎn)之后，將子鼠中雌鼠剔除，留雄性SD幼鼠。

1.2 主要儀器 血壓表式血壓測量計(jì)購于江蘇魚躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司；干燥消毒烤箱（DHG-9246A）、水浴恒溫箱（DK-8）均購于上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；倒置顯微鏡購于日本OLYMPUS公司；TS-1性脫色搖床購于江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Tanon凝膠成像系統(tǒng)購于上海天能公司；VE-386購于北京原平皓生物技術(shù)有限公司；DYCZ-24DN型垂直電泳裝置購于北京六一儀器廠。

1.3 主要試劑 酮替芬粉劑購于奧默生物技術(shù)（上海） 有限公司；Anti-Tryptase、Anti-PAR2 antibody、Anti-PKCε antibody均購于美國Abcam公司；Antiβ-actin antibody購于天津創(chuàng)科生物科技有限公司；Anti-GAPDH antibody購于天津創(chuàng)科生物科技有限公司；PVDF膜（0.22 μm）購于蘇州凈化設(shè)備有限公司；HRP標(biāo)記的驢抗兔IgG二抗購于天津創(chuàng)科生物科技有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG/HP聚合物二抗購于美國Abcam公司；DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、腹部推拿組、西藥組，每組10只。分組情況如下，空白組：不予任何處理，自由進(jìn)食飲水；模型組：造模，不予治療；腹部推拿組：造模后，予以腹部推拿14 d；西藥組：造模后，給予以腹腔注射酮替芬溶液（0.8 mg/kg）14 d。酮替芬可有效抑制MC中過敏介質(zhì)的釋放，用于IBS-D的常規(guī)干預(yù)治療。

2.2 造模方法 采取母嬰分離聯(lián)合慢性應(yīng)激刺激（強(qiáng)迫游泳+束縛應(yīng)激+夾尾刺激法）復(fù)制IBS-D大鼠模型[7]，具體實(shí)施如下：1）母嬰分離實(shí)驗(yàn)將SD雄性幼鼠從出生第1天開始，與母鼠一起飼養(yǎng)在同一個(gè)鼠籠，自出生后第2天到第21天，每日隨機(jī)時(shí)間和母鼠分開3 h，分離時(shí)子鼠不能看到母鼠，自出生第22天起徹底分離，單籠飼養(yǎng)，46日齡即可進(jìn)行慢性應(yīng)激刺激。2）慢性應(yīng)激刺激實(shí)驗(yàn)將SD大鼠放入小型裱花袋，將其嘴部置于裱花袋口部，并用皮筋將大鼠尾部與裱花袋后部固定，使大鼠不能活動(dòng)，每日束縛3 h。第2天將SD大鼠放入盛有5℃水的桶中，6 min后取出。第3天用止血鉗（外裹棉花）夾住鼠尾距尾根4 cm處，不間斷夾尾2 min。上述3種刺激方式，3 d為1個(gè)循環(huán)，直至14 d后結(jié)束造模，應(yīng)用糞便性狀（Bristol）評分評價(jià)造模是否成功。

2.3 干預(yù)方法 選用津沽臟腑推拿中核心手法“按腹法”“摩腹法”作為主要治療手法。將實(shí)驗(yàn)大鼠束縛于實(shí)驗(yàn)臺取仰臥位。1）腹部摩法：手法操作者拇指指面著力于腹部施術(shù)部位，并以中脘穴為圓心，做順時(shí)針方向摩動(dòng)，頻率宜緩，每分鐘20～30次，如此反復(fù)操作6 min。2）腹部按法：手法操作者以右手拇指按置于中脘穴上主動(dòng)施力，力量向下且宜由輕而重，直至能夠清晰感覺到大鼠腹部動(dòng)脈搏動(dòng)，停留2 min，而后手法操作者拇指徐徐上提，直至完全離開受壓部位。如此反復(fù)操作3次，共9 min。腹部摩法和腹部按法均每日治療1次，連續(xù)治療14 d。

3 取材及觀察指標(biāo)

3.1 腹壁撤退反射評分（AWR）的檢測 應(yīng)用AWR評分[8]評價(jià)各組大鼠內(nèi)臟痛情況。SD大鼠水合氯醛麻醉后，將抹有甘油的橡膠氣囊（采用5寸圓形乳膠氣球）從肛門插入結(jié)直腸內(nèi)（深度約為8 cm），使用醫(yī)用膠布固定導(dǎo)管和大鼠尾根部，隨后將大鼠置入透明亞克力板固定盒中，只可以前后移動(dòng)，無法轉(zhuǎn)身，當(dāng)其蘇醒適應(yīng)30 min后開始實(shí)驗(yàn)，每只大鼠分別給予4種壓力刺激，分別為 20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa，下同），后維持 20 s，每次間隔4 min。主要觀察大鼠對于擴(kuò)張刺激的反應(yīng)、是否存在短暫的頭部運(yùn)動(dòng)后停滯、腹部肌肉收縮、腹部收縮并提起、弓背并抬起骨盆等表現(xiàn)。

AWR的評分標(biāo)準(zhǔn)如下：1分：CRD刺激時(shí)，無任何反應(yīng)或僅有頭部活動(dòng)增多；2分：CRD時(shí)腹部肌肉收縮；3分：CRD時(shí)腹部收縮并抬離桌面；4分：CRD時(shí)腹部肌肉明顯收縮使身體呈弓形抬起。

3.2 結(jié)腸組織甲苯胺藍(lán)染色 將結(jié)腸組織立即固定在4%的多聚甲醛里，進(jìn)行沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，開始持續(xù)切片（厚度為5 μm，相鄰2片間隔為30 μm），并于脫蠟后進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色，最后在高倍顯微鏡（200倍）下拍照、觀察。

3.3 免疫組化檢測Tryptase的表達(dá)情況 取大鼠結(jié)腸組織脫蠟，梯度乙醇水化；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗4次，每次5 min；抗原煮沸熱修復(fù)：將0．01 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6．0）使用水浴鍋加熱至95℃左右，將結(jié)腸組織切片置入加熱15～20 min，隨后用PBS沖洗5 min；注入正常山羊血清封閉液，正常室溫環(huán)境下孵育20 min；PBS沖洗后滴加Ⅰ抗；4℃孵育10 h后PBS沖洗滴加Ⅱ抗；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯影，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇（50%、70%、85%、95%、100%）脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，每個(gè)樣本使用200倍顯微鏡觀察，分別取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，觀察蛋白陽性表達(dá)情況并用Image pro-Plus軟件分析計(jì)算平均光密度值。

3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測大鼠結(jié)腸組織中PAR2和PKCε蛋白表達(dá) 利用蛋白濃度定量試劑盒（BCA法）對樣品蛋白含量進(jìn)行測定，分別配制SDS變性10%聚丙烯酰胺凝膠（下層分離膠，單面），5%聚丙烯酰胺凝膠（上層積層膠，單面）均勻混合后，取適量的蛋白樣品上樣，采取SDS變性10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），最終使目的蛋白完全分離后停止電泳。再經(jīng)轉(zhuǎn)膜（半干轉(zhuǎn)法）、封閉，對抗體進(jìn)行稀釋，封閉對應(yīng)的一抗，4℃過夜孵育；回收一抗，用PBS在水平搖床上洗滌NC膜3次，每次10 min；稀釋二抗，稀釋比為1∶5 000，然后加入跟一抗相同屬性熒光標(biāo)記的二抗，在水平搖床避光孵育2 h；回收二抗，用PBS在水平搖床上洗滌NC膜3次，每次洗10 min，注意避光，采用凝膠成像系統(tǒng)掃膜。

3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采取SPSS 22．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，進(jìn)行組間比較時(shí)，計(jì)量資料呈現(xiàn)出正態(tài)分布時(shí)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間采用單因素方差分析；計(jì)量資料呈現(xiàn)出非正態(tài)分布時(shí)，數(shù)據(jù)則以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 各組大鼠腹壁撤退評分比較 由各組大鼠腹壁撤退評分（表1）可見，與空白組同期比較，模型組AWR 分?jǐn)?shù)升高（P＜0．05）。與模型組同期比較，腹部推拿組、西藥組大鼠AWR分?jǐn)?shù)明顯降低（P＜0．05）。腹部推拿組、西藥組兩組組間比較，腹部推拿組撤退評分在20 mm Hg壓力刺激時(shí)劣于西藥組、80 mm Hg壓力刺激時(shí)優(yōu)于西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），其余壓力測定時(shí)評分接近。

表1 各組大鼠腹壁撤退評分[M（P25，P75）]Tab.1 Abdominal withdrawal reflex score of rats in each group[M（P25，P75）]分

4.2 各組大鼠結(jié)腸組織MC計(jì)數(shù)比較 甲苯胺藍(lán)染色后MC呈紫紅色顆粒，可在光學(xué)顯微鏡下觀測MC形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)和計(jì)數(shù)。鏡下顯示，模型組MC形態(tài)不規(guī)則，計(jì)數(shù)及密度顯著高于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）；與模型組相比，腹部推拿組、西藥組MC計(jì)數(shù)降低、密度減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01）。腹部推拿組、西藥組兩組比較，腹部推拿組MC計(jì)數(shù)及密度高于西藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見圖1、圖2。

圖1 結(jié)腸組織甲苯胺藍(lán)染色Fig.1 Toluidine blue staining of colon tissue

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中MC密度的變化（±s）Fig.2 Changes of MC density in colon tissue of rats in each group（±s）

4.3 各組大鼠Tryptase表達(dá)結(jié)果比較 由各組大鼠Tryptase免疫組化檢測（圖3，圖4）可見，與空白組相比，模型組MC Tryptase顆粒分布顯著增加（P＜0．01）；與模型組相比，腹部推拿組、西藥組 MC Tryptase顆粒分布明顯降低（P＜0．01）；腹部推拿組、西藥組兩組比較，腹部推拿組MC Tryptase顆粒高于西藥組（P＜0．01）。

圖3 各組大鼠Tryptase免疫組化表達(dá)Fig.3 Tryptase immunohistochemical expression of rats in each group

4.4 各組大鼠PAR2和PKCε表達(dá)比較 由各組大鼠PAR2和PKCε蛋白灰度比值可見，與空白組相比，模型組PAR2和PKCε蛋白灰度比值和表達(dá)量顯著升高（P＜0．01）；與模型組相比，腹部推拿組和西藥組的PAR2和PKCε的蛋白灰度比值和表達(dá)量均顯著降低（P＜0．01）；腹部推拿組、西藥組兩組比較，腹部推拿組大鼠腸道PAR2和PKCε表達(dá)率高于西藥組（P＜0．01）。見圖5。

圖5 各組大鼠PAR2和PKCε蛋白相對表達(dá)量（±s）Fig.5 Relative protein expression of PAR2 and PKCε of rats in each group（±s）

5 討論

IBS-D屬中醫(yī)學(xué)“便秘”“泄瀉”“腹痛”等范疇，本病的中醫(yī)治療手段豐富。中醫(yī)認(rèn)為脾胃作為人體氣機(jī)升降樞紐，氣機(jī)不通則痛，腹部推拿通調(diào)脾胃氣機(jī)為治療IBS-D內(nèi)臟痛提供了有力的理論依據(jù)。民間素有風(fēng)俗“腹痛揉腹來止痛”。由此可見，腹部推拿可以為病患解決胃腸問題，消除腹部疼痛。本研究中腹部推拿重點(diǎn)作用于中脘穴，中脘為調(diào)節(jié)中焦氣化的要穴，刺激該穴可健運(yùn)脾土，一方面固護(hù)中州，一方面運(yùn)化水濕，使補(bǔ)而不滯，能守能走。同時(shí)，選擇層按中脘穴，通過深層激發(fā)伏沖之脈，灌注氣血于周身，以血行載氣行，以氣運(yùn)攝血運(yùn)，中醫(yī)認(rèn)為通則不痛，經(jīng)絡(luò)氣血通暢則痛自減。

內(nèi)臟高敏感一直被認(rèn)為是IBS-D的重要發(fā)病原因之一，它的發(fā)生主要途徑可以分為：外周神經(jīng)系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、腸神經(jīng)系統(tǒng)3個(gè)方面[9]。本研究從外周敏化誘發(fā)中樞敏化的角度出發(fā)，結(jié)合傷害感受器敏化與免疫炎性反應(yīng)之間的相互作用，探討腹部推拿治療IBS-D內(nèi)臟高敏感的作用機(jī)制。

外周敏化是人體疼痛感受器受多種因素影響，導(dǎo)致的傳入神經(jīng)刺激敏感性增強(qiáng)而產(chǎn)生的表現(xiàn)[10]。在這個(gè)過程中，外周神經(jīng)產(chǎn)生炎性反應(yīng)，激發(fā)免疫細(xì)胞如MCs活化脫顆粒。Tryptase作為MC活化后的基本標(biāo)志產(chǎn)物之一，研究表明在IBS患者的腸道黏膜中發(fā)現(xiàn)的Tryptase密度和MC數(shù)量比正常非IBS人群普遍要高，此外Tryptase密度與腹部不適程度或（和）腹部疼痛、糞便頻率、性狀改變等臨床癥狀呈正相關(guān)[11]。同時(shí)，Tryptase還參與了腸道黏膜的內(nèi)分泌-神經(jīng)-免疫系統(tǒng)的交互作用[12]。當(dāng)MCs被激活并通過活化脫顆粒的形式分泌出Tryptase后，會級聯(lián)激活Tryptase神經(jīng)表面蛋白酶激活受體2（PAR2），調(diào)控鄰近的腸道傷害感受器神經(jīng)元，發(fā)送疼痛性信號，并能引起內(nèi)臟感覺的變化[13]。Lee等[14]研究表明，IBS-D患者直腸黏膜組織中Tryptase激活明顯高于正常組，并且Tryptase表達(dá)和PAR2水平顯著增高。PAR2集中分布在消化道神經(jīng)中，協(xié)同參與腸道運(yùn)動(dòng)、腸道內(nèi)分泌、內(nèi)臟超敏反應(yīng)等病生理反應(yīng)[15]。另外，PKCε是PAR2的下游物質(zhì)之一，過往的研究表明，PAR2-PKCε是產(chǎn)生疼痛并加以維持的重要通路[16-17]。研究顯示[18]，應(yīng)用前列腺素（PG）E2建立痛覺敏化誘發(fā)模型，給予注射PAR2拮抗劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不論在PGE2注射前還是注射后給予PAR2抑制劑，均能顯著改善由PGE2誘發(fā)的慢性疼痛，并明顯抑制PKCε在外周神經(jīng)元中的表達(dá)，說明了抑制PAR2能降低PKCε的活化[19]，從而改善內(nèi)臟敏感性，降低痛覺敏化。

IBS-D作為一種功能性的胃腸疾病，通常以腹痛、腹部不適、腹瀉為主要臨床表現(xiàn)，并常伴隨精神心理癥狀。由于IBS-D的發(fā)病并非單一因素，所以造模方法尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。總體要求同時(shí)模擬出IBS-D內(nèi)臟高敏感性、腹瀉和精神癥狀，因此采用多因素復(fù)合的造模方法。有研究采用番瀉葉灌胃或乙酸灌腸的方法造成模型大鼠腹瀉癥狀[20]。但本研究認(rèn)為這類方法會把內(nèi)臟高敏感性和腸道功能紊亂割裂開，一方面易造成腸黏膜的損傷（如乙酸灌腸），另一方面番瀉葉性寒，純?yōu)a無補(bǔ)，易導(dǎo)致虛寒性而非肝脾不和引起的糞便異常，同時(shí)也否認(rèn)了應(yīng)激事件在造成內(nèi)臟高敏感的同時(shí)又影響著糞便的性狀。而中醫(yī)整體思維指導(dǎo)下的辨證觀點(diǎn)認(rèn)為同一病機(jī)會引發(fā)不同的癥狀，肝郁脾虛型IBS-D，多在精神因素應(yīng)激下出現(xiàn)腹痛，并同時(shí)伴隨急迫欲瀉的癥狀。在這一理論的啟發(fā)下，本研究嘗試以加強(qiáng)應(yīng)激事件的方法，采用束縛、冰水、夾尾3種應(yīng)激方法配合并鞏固母嬰分離實(shí)驗(yàn)，造成模型大鼠抑郁狀態(tài)、提升大鼠內(nèi)臟敏感性并引發(fā)腹瀉癥狀[21]。

在本研究，筆者通過應(yīng)用腹壁撤退評分實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了腹部推拿對于模型大鼠內(nèi)臟高敏感的效果。同時(shí)，應(yīng)用光鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織MC形態(tài)學(xué)及數(shù)量變化，采用免疫組化檢測Tryptase顆粒分布，應(yīng)用Western blot法檢測大鼠結(jié)腸組織中PAR2和PKCε蛋白含量。研究結(jié)果顯示與模型組比較，AWR評分明顯降低，這說明腹部推拿能降低IBS-D模型大鼠的內(nèi)臟高敏感性。鏡下顯示，模型組MC形態(tài)不規(guī)則，計(jì)數(shù)及密度顯著高于空白組；腹部推拿組與模型組相比，則表現(xiàn)為MC計(jì)數(shù)降低、密度減少，這說明腹部推拿可以降低腸道局部的免疫反應(yīng)。MC Tryptase顆粒免疫組化：與模型組相比，腹部推拿組分布也呈現(xiàn)降低趨勢，PAR2、PKCε表達(dá)量檢測結(jié)果顯示：與模型組相比，腹部推拿組顯著降低。結(jié)果充分表明，腹部推拿能有效改善IBS-D模型大鼠內(nèi)臟高敏感癥狀，特別是降低腸道Tryptase、PAR2、PKCε異常表達(dá)，說明其對調(diào)節(jié)Tryptase-PAR2-PKCε通路是有效的。為深化腹部推拿防治IBS-D的基礎(chǔ)研究，促進(jìn)推拿學(xué)科發(fā)展及推廣提供了依據(jù)。另外，本研究還設(shè)置了西藥對照組，該組選取的酮替芬作為主要干預(yù)手段，酮替芬是一種全身性抗組胺藥，通過對抗組胺H1受體和抑制過敏反應(yīng)介質(zhì)的釋放來治療過敏性鼻炎、過敏性支氣管炎、腸道炎癥等疾病[22]。結(jié)果顯示腹部推拿組的干預(yù)效果趨近于西藥組。隨著腹部推拿研究的更加深入，一方面腹部推拿是否可以替代酮替芬等西藥治療值得思考？另一方面，是否其可與酮替芬結(jié)合達(dá)到更優(yōu)效果，也是未來研究探討的問題。

當(dāng)然本研究也存在一定的局限性。首先是樣本量較低，研究的偏倚性存在。其次是，研究中的干預(yù)手法還有待進(jìn)一步的客觀化、規(guī)范化，比如用機(jī)器操作代替人去操作，這樣減少干預(yù)量的影響。另外，因?yàn)楫?dāng)實(shí)驗(yàn)操作者對大鼠進(jìn)行腹部推拿時(shí)，其行為本身可能會對大鼠造成心理壓力，其可能影響整體治療效果。這些因素均可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差，這也為筆者今后的研究提出了新的要求，盡量去規(guī)避此部分的影響使結(jié)果更具有客觀、科學(xué)性。另外，研究展示的通路可能是推拿手法眾多靶點(diǎn)中的一條，未來還需要進(jìn)一步研究，不能以偏概全的定義推拿干預(yù)作用機(jī)制。