黑色素瘤細胞PRDM1對增殖、凋亡和遷移的影響

陳 婷 蘇文楊 朱希聰

·論 著·

黑色素瘤細胞PRDM1對增殖、凋亡和遷移的影響

陳 婷1蘇文楊2朱希聰1

1.浙江省臺州醫(yī)院皮膚科，浙江臺州 317000；2.浙江省臺州醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江臺州 317000

探討含PR/SET域蛋白1（PR/SET domain 1，PRDM1）表達水平與黑色素瘤患者預后的關系，及對黑色素瘤細胞增殖、凋亡、遷移的影響。分別通過基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）數(shù)據(jù)庫和基因集變異分析（gene seb camcer analysis，GSCA）數(shù)據(jù)庫分析PRDM1在皮膚黑色素瘤和正常組織中的表達差異及其與預后的關系。在細胞水平上將黑色素瘤A375分為兩組，分別為轉染siRNA-PRDM1和空載對照siRNA-NC，流式細胞儀檢測各組黑色素瘤A375細胞的增殖能力、抗凋亡能力，Transwell小室檢測各組黑色素瘤A375細胞的遷移能力，Western blot法檢測各組黑色素瘤A375細胞中MYC的表達水平。與正常組織比較，PRDM1在黑色素瘤中低表達，且黑色素瘤患者中PRDM1高表達者預后較低表達者好。在黑色素瘤A375細胞中PRDM1低表達后細胞的增殖、遷移能力增強，而抗凋亡能力下降，且細胞中MYC蛋白表達水平上調(diào)（<0.05）。PRDM1在黑色素瘤組織中低表達，且與患者不良預后相關。PRDM1可能通過MYC抑制黑色素瘤細胞的增殖、遷移，促進凋亡，進而抑制黑色素瘤的生長發(fā)展。

黑色素瘤；PRDM1；MYC；增殖；生物信息學分析

黑色素瘤是一種易發(fā)生轉移且具有致死性高的常見皮膚惡性腫瘤，目前主流治療方案為早期手術、晚期放療和化療，以及近年來迅速發(fā)展的免疫抑制治療。大部分黑色素瘤均能得到控制，但若發(fā)生遠處轉移、耐藥及免疫逃避，其療效則會顯著降低[1-5]。探討黑色素瘤的生長機制，尋找新的分子靶目標提供更多的選擇方案具有重要意義。含PR域蛋白1（PR domain containing protein 1，PRDM1）作為近年來新發(fā)現(xiàn)的一種潛在抑癌基因[6-8]，被發(fā)現(xiàn)在黑色素瘤中呈低表達，且在遠處轉移瘤中多呈低表達，同時證實在斑馬魚黑色素瘤模型中，缺失PRDM1的表達易促進黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]。本研究應用生物信息學技術檢測了PRDM1在黑色素瘤中的表達情況和預后相關性，并在人黑色素瘤細胞上了驗證PRDM1生物學功能，為尋求黑色素瘤新的治療方案提供思路。

1 材料與方法

1.1 基因表達譜數(shù)據(jù)動態(tài)分析（gene expression profiling interactive analysis，GEPIA）

將TCGA與GTEx數(shù)據(jù)庫中腫瘤和正常組織樣本數(shù)據(jù)整合后進行基因分析表達的可視化數(shù)據(jù)庫，涵蓋了9736個腫瘤組織和8587個正常組織的RNA數(shù)據(jù)[10]。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析PRDM1基因在皮膚黑色素瘤中的表達情況。

1.2 細胞和主要試劑

人黑色素瘤細胞株A375（美國模式培養(yǎng)物集存庫ATCC），DMEM培養(yǎng)基、Transwell小室（美國Corning公司），胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素（美國Thermo Fisher公司），Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司），Trizol、反轉錄試劑盒、SYBR Green（日本TaKaRa公司），EdU試劑盒、siRNA-PRDM1及siRNA-NC（廣州銳博生物技術有限公司），RNase A、凋亡試劑盒購（南京凱基生物有限公司），PRDM1、MYC、GAPDH單克隆抗體（中國愛博泰克生物公司，引物購自上海生工生物公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染

黑色素瘤細胞A375 10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素高糖培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔、24孔、96孔細胞培養(yǎng)板上，細胞融合度達到70%時將培養(yǎng)基換成不含胎牛血清的DMEM饑餓6h，按照Lipofectamine 2000說明書轉染siRNA-PRDM1、siRNA-NC，結束后繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.4 實時熒光定量PCR檢測

采用Trizol提取細胞總RNA后按照反轉錄說明書操作獲得cDNA。以β-actin作為內(nèi)參利用SYBR Green進行實時熒光定量PCR分析mRNA相對表達量。

1.5 流式細胞術檢測細胞周期和凋亡實驗

收集成功轉染siRNA-PRDM1及siRNA-NC的A375細胞，冷凍過的100%乙醇固定過夜。重懸細胞后RNase A室溫孵育5min，碘化丙啶避光室溫染色15min，篩網(wǎng)過濾后流式細胞儀檢測，F(xiàn)lowJo軟件分析細胞周期。成功轉染siRNA-PRDM1和siRNA- NC的A375細胞培養(yǎng)24h后，重懸細胞進行Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，應用流式細胞儀測定細胞凋亡。

1.6 EdU細胞增殖檢測

應用EdU測定細胞增殖，將A375細胞以2×105/ml的密度接種于96孔板上，在成功轉染siRNA-PRDM1和空載對照48h結束前2h加入EdU，后4%多聚甲醛4℃固定過夜。甘氨酸中和殘留的固定液并洗滌干凈后0.5% Triton X室溫孵育30min。利用EdU檢測試劑盒根據(jù)操作說明書染色、避光孵育。熒光顯微鏡EdU陽性細胞數(shù)計數(shù)。

1.7 細胞遷移檢測

轉染siRNA-PRDM1及siRNA-NC，24h后A375細胞以2×105/ml的密度重懸于無FBS的DMEM中。吸取200μl細胞懸浮液至Transwell小室的上室，下室加入600μl含有10%FBS的DMEM，繼續(xù)孵育37℃孵育48h。結束后棄上室液用4%多聚甲醛固定，風干后0.1%結晶紫染色，漂洗干凈后倒置顯微鏡拍攝。

1.8 免疫蛋白印跡檢測

從細胞中提取總蛋白后將等量的蛋白質(zhì)樣本分別進行電泳、轉膜、封閉，加入抗PRDM1、MYC、GAPDH單克隆抗體（1:1000）4℃孵育過夜，再次二抗室溫孵育2h，洗膜，電化學發(fā)光可視化系統(tǒng)顯影。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理，兩組間數(shù)據(jù)比較采用Unpaired t檢驗，另外PRDM1在腫瘤與正常組織中的表達差異分析采用Wilcoxon檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PRDM1在黑色素瘤和正常組織中的表達差異及與患者預后的相關性

利用GEPIA平臺對最新TCGA數(shù)據(jù)庫皮膚黑色素瘤和GTEx數(shù)據(jù)庫正常皮膚組織進行差異表達分析，發(fā)現(xiàn)PRDM1在黑色素瘤中呈低表達。GSCA數(shù)據(jù)庫可視化分析顯示，PRDM1高表達組總體生存期（overall survival，OS）延長。

2.2 敲低PRDM1的表達對黑色素瘤細胞增殖的影響

在黑色素瘤A375細胞流式細胞術實驗中，siRNA-PRDM1轉染組G0/G1期細胞數(shù)（57.9±2.1）%相比siRNA-NC空載對照組（65.4±1.5）%顯著減少（=4.697，<0.05），且siRNA-PRDM1轉染組S期（30.6±2.3）%相比siRNA-NC空載對照組（22.5±2.5）%則明顯增多（=5.055，<0.05），G2/M期比較，差異無統(tǒng)計學意義（=0.446，>0.05），見圖1A。同樣的EdU實驗100倍顯微鏡下siRNA- PRDM1轉染組每個視野的陽性細胞數(shù)（36.5±4.0）%平均要高于空載對照組（29.3±3.2）%，差異有統(tǒng)計學意義（=13.030，<0.05），見圖1B。

2.3 敲低PRDM1的表達對黑色素瘤細胞凋亡的影響

黑色素瘤A375細胞凋亡實驗中，siRNA-PRDM1轉染組凋亡細胞百分比（13.4±2.9）%低于siRNA-NC空載對照組（20.7±2.0）%，差異有統(tǒng)計學意義（=3.966，<0.05），而siRNA-PRDM1轉染組存活細胞百分比（84.4±3.3）%則要高于siRNA-NC空載對照組（76.9±2.3）%，差異有統(tǒng)計學意義（=4.078，<0.05），見圖2。

2.4 下調(diào)PRDM1的表達對黑色素瘤細胞遷移能力的影響

黑色素瘤A375細胞遷移實驗中，siRNA-PRDM1轉染組100倍顯微鏡下每個視野的結晶紫染色陽性細胞數(shù)（230±17）明顯高于siRNA-NC空載對照組（97±13）（=23.800，<0.05），見圖3。

2.5 PRDM1影響黑色素細胞瘤的生長發(fā)展

利用GEPIA平臺分析發(fā)現(xiàn)黑色素瘤中PRDM1與MYC存在相關性，見圖6A。免疫蛋白印記實驗證實當黑色素瘤A375細胞中PRDM1的表達下調(diào)，MYC蛋白表達水平上調(diào)，見圖4。

圖1 敲低PRDM1的表達對黑色素瘤細胞增殖影響

A.流式細胞術檢測黑色素瘤細胞周期；B.EdU檢測黑色素瘤細胞增殖

注：與對照組比較，*<0.05

圖2 實時熒光定量PCR檢測細胞中PRDM1 mRNA相對表達水平

注：與對照組比較，*<0.05

圖3 敲低PRDM1的表達對黑色素瘤細胞遷移的影響（結晶紫染色，×100）

注：與對照組比較，*<0.05

圖4 黑色素瘤細胞中PRDM1和MYC的關系

A.GEPIA數(shù)據(jù)庫黑色素瘤中PRDM1與MYC的相關性；B.蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測PRDM1對MYC的影響

注：與對照組比較，*<0.05

3 討論

PRDM1作為一種支架蛋白能通過甲基化或者去乙?；种苹蜣D錄，發(fā)揮沉默靶基因的效應[11]。已知PRDM1在部分腫瘤類型中具有腫瘤抑制因子的作用，特別是B、T和自然殺傷細胞淋巴瘤和肺癌[6,12]。而在黑色素瘤中，有文獻報道PRDM1是神經(jīng)嵴細胞分化為黑素細胞的重要調(diào)節(jié)因子，斑馬魚模型中缺失prdm1后早期黑色素干細胞標志物sox10表達上調(diào)，且促進了黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展[9]，但PRDM1在黑色素瘤中是否具有抑癌基因的效果尚無未明確結論。

首先通過分析可視化公共數(shù)據(jù)庫可知，與正常組織相比，PRDM1在黑色素瘤中低表達，同時黑色素瘤患者中PRDM1高表達水平者預后較低表達水平者高，生存時間延長，表明PRDM1表達水平的高低與黑色素瘤患者預后相關，且PRDM1具有作為黑色素瘤患者預后生物標記物的可能。既往有報道證實黑色素瘤免疫抑制治療中，PRDM1缺失更容易發(fā)生免疫相關不良事件[13]，可能是導致預后不良的因素之一，同時PRDM1的表達水平也可作為黑色素瘤患者開展免疫抑制治療方案的篩選指標之一。此外，已知PRDM1在生發(fā)中心B細胞和漿細胞中高表達，與B淋巴細胞分化成熟密切相關，在維持T淋巴細胞穩(wěn)態(tài)及分化中也發(fā)揮著重要作用[11,14]。在腫瘤微環(huán)境中，PRDM1可能通過促進B、T淋巴細胞分化成熟增強免疫細胞浸潤，進而延長PRDM1高表達黑色素瘤患者的生存時間，這也是下一步的研究方向。

為了進一步證實PRDM1是黑色素瘤腫瘤抑制基因的一員。首先在A375細胞中成功轉染PRDM1- siRNA，抑制細胞內(nèi)PRDM1基因的表達。流式細胞術分析發(fā)現(xiàn)S期細胞顯著增加，表明PRDM1阻礙黑色素瘤細胞細胞周期G1/S的轉化，說明PRDM1抑制黑色素瘤細胞增殖，同樣EdU實驗也證實這一點；另外流式細胞術證明PRDM1表達下調(diào)后促進細胞凋亡；而遷移實驗則表明PRDM1低表達后遷移能力增強。這些數(shù)據(jù)證實了PRDM1抑制黑色素瘤細胞生長發(fā)展。

MYC是已被普遍證實的一種原癌基因，參與多種生長促進相關信號通路的傳導，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[15,16]。MYC在多種類型腫瘤中處于高度擴增狀態(tài)，短暫抑制MYC的表達可逆轉體內(nèi)腫瘤的發(fā)生[17]。此外有研究表明在彌漫性大B細胞淋巴瘤中PRDM1基因失活誘導MYC基因表達上調(diào)[18]。為探索黑色素瘤細胞中PRDM1是否通過MYC發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用，進一步的在黑色素瘤細胞中成功轉染siRNA-PRDM1后，蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結果顯示PRDM1表達下調(diào)，而MYC的蛋白表達水平則升高，可見PRDM1負向調(diào)控MYC，說明PRDM1可能是通過MYC調(diào)控黑色素瘤細胞的增殖、凋亡和遷移。

綜上所述，在黑色素瘤患者中PRDM1高表達水平者相對生存期更長，且初步證明PRDM1可能是通過下調(diào)MYC抑制黑色素瘤細胞的增殖、凋亡和遷移。

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Effect of PRDM1 on melanoma cell proliferation, apoptosis and migration and its underlying mechanism

CHEN Ting SU Wenyang ZHU Xicong

1.Department of Dermatology, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Taizhou 317000, Zhejiang, China; 2.Department of Neurology, Taizhou Hospital of Zhejiang Province, Taizhou 317000, Zhejiang, China

To explore the relationship between the expression level of PR/SET domain (PRDM1) and the prognosis of melanoma patients, as well as the effect on proliferation, apoptosis and migration of melanoma cells.The expression level of PRDM1 in melanoma and normal tissues was analyzed by GEPIA database and GSCA database. The melanoma A375 cells were divided into two groups, then transfected with small interfering RNA PRDM1 (siRNA-PRDM1) and empty vector small interfering RNA negative control (siRNA-NC). The proliferation, anti-apoptosis and migration of A375 cells were detected by flow cytometer, transwell assay, respectively, at last use Western blot to detect the protein expression level of MYC.The expression level of PRDM1 in melanoma was significantly lower than that of normal tissue, and the highly expressed PRDM1 was related with the poor prognosis of melanoma patients. Compared with empty vector group, the proliferation and migration of the cells was increased, while the anti-apoptosis was decreased, and the protein expression level of MYC in the cells was significantly decreased after transfection of siRNA-PRDM1 (<0.05).The PRDM1 was under-expressed in melanoma tissues and correlated with poor prognosis of the melanoma patients. PRDM1 may inhibit the development of melanoma by increasing MYC to prevent the proliferation, migration and promote anti-apoptosis of melanoma cells.

Melanoma; PRDM1; MYC; Proliferation; Bioinformatics analysis

R739.5

A

1673-9701(2022)36-0018-05

臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）科研基金項目（19EZA2）

朱希聰，電子郵箱：zhuxc@enzemed.com

（2022–07–11）

（2022–09–12）