生物信息學(xué)分析與分子對(duì)接紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎分析

朱 潔 王青華 趙丹丹

·論 著·

生物信息學(xué)分析與分子對(duì)接紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎分析

朱 潔 王青華 趙丹丹

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院藥劑科，浙江湖州 313000

探討紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的作用機(jī)制。通過自研Python腳本在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選紫英抗炎合劑的活性成分和靶基因，并通過人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards獲得濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的靶基因，使用CytoScape3.9.0構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”、“成分-通路”網(wǎng)絡(luò)。將篩選到的關(guān)鍵靶基因?qū)隨TRING在線平臺(tái)，建立蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行生物信息分析以研究其機(jī)制。最后通過AutoDockTools和AutoDock vina進(jìn)行分子對(duì)接分析，并與醫(yī)院現(xiàn)有的西藥的結(jié)合度進(jìn)行對(duì)比后應(yīng)用PyMol可視化作圖。①?gòu)淖嫌⒖寡缀蟿┲泻Y選出豆甾醇等59個(gè)中藥有效活性成分，白細(xì)胞介素6、腫瘤壞死因子等72個(gè)關(guān)鍵基因；②生物信息分析結(jié)果顯示，紫英抗炎合劑生物學(xué)過程和功能集中在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞因子活性等；③生物信息分析信號(hào)通路顯示，紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎主要涉及PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-kB信號(hào)通路等；④分子對(duì)接結(jié)果顯示紫英抗炎合劑中的重要活性成分與慢性盆腔炎的核心靶點(diǎn)結(jié)合較好，甚至優(yōu)于阿奇霉素和頭孢西丁，篩選出結(jié)合度好、有氫鍵形成的構(gòu)象關(guān)系IL6-Stigmasterol進(jìn)行可視化處理。以上研究為紫英抗炎合劑日后進(jìn)一步探索提供了新思路，也為通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息分析和分子對(duì)接的方法，發(fā)展醫(yī)院的新制劑提供了新的研究途徑。

濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎；中藥復(fù)方；紫英抗炎合劑；生物信息分析；分子對(duì)接

盆腔炎是婦科常見的生殖系統(tǒng)疾病[1]，慢性盆腔炎患者常見癥狀有下腹部脹墜、腰骶部酸痛[2]。中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，盆腔炎是由于正氣虧損、濕熱之邪內(nèi)侵，化毒蓄積下焦而致氣血瘀滯引起，瘀濕過甚而化為熱，致病情纏綿不愈，中醫(yī)辨證可將其分為氣滯血瘀、濕熱瘀阻等多種分型[3-5]。

紫英抗炎合劑為浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院已故省名老中醫(yī)朱承漢經(jīng)驗(yàn)方，方中敗醬草、紫花地丁等藥均可起到清熱解毒的效果，同時(shí)紫花地丁、乳香活血消腫，蒲公英散結(jié)，延胡索行氣、止痛，多藥共用奏清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛的功效，適用于濕熱瘀結(jié)型盆腔炎。浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院多年的臨床應(yīng)用和對(duì)照研究也證明，紫英抗炎合劑在治療濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎方面具有顯著的療效[6-9]。

隨著大數(shù)據(jù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息分析、分子對(duì)接技術(shù)的發(fā)展，對(duì)藥物的研究尤其是針對(duì)中藥復(fù)方中存在的多成分、多靶點(diǎn)的研究有了新的探索方法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、生物信息分析使用的數(shù)據(jù)庫(kù)持續(xù)更新，分析精準(zhǔn)；使用分子對(duì)接工具進(jìn)行分子虛擬對(duì)接運(yùn)算速度快，應(yīng)用精度高，可以為中藥復(fù)方成分的研究提供有力的參考依據(jù)。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)合生物信息分析，構(gòu)建藥物、成分、靶點(diǎn)、通路之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，探討紫英抗炎合劑的藥物活性成分、潛在靶點(diǎn)、作用機(jī)制和相關(guān)信號(hào)通路，闡述紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的作用機(jī)制。通過分子對(duì)接技術(shù)，并增加西藥對(duì)照組進(jìn)行對(duì)接，選取結(jié)合能高、有氫鍵形成并有較穩(wěn)定構(gòu)象的對(duì)接結(jié)果，在證實(shí)紫英抗炎合劑治療疾病的優(yōu)勢(shì)方面具有指導(dǎo)意義，同時(shí)為治療開辟新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件

①TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)：https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php；②中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)：http://www. organchem.csdb.cn.[1978-2021]；③蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt：http://www.uniprot. org/uploadlists/；④人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards：https://www.genecards.org；⑤STRINGVersion 11.5：https://cn.string-db.org/cgi/input?sessionId=bBrtGEVz6u1L&input_page_show_search=off；⑥Metascape平臺(tái)：https://metascape.org/gp/index.html；⑦微生信平臺(tái)：http://www.bioinformatics.com.cn/；⑧PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)：https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/；⑨CTD比較毒理基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)：http://ctdbase.org/；⑩RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)：https:// www.rcsb.org/；?DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)：https://go.drugbank. com/；?CytoScape 3.9.0；?AutoDockTools 1.5.7；?PyMol；?AutoDock vina1.2.3，Draw Venn Diagram：http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

1.2 方法

1.2.1 篩選紫英抗炎合劑有效活性成分及相關(guān)靶基因 通過自研Python腳本設(shè)置TCMSP參數(shù)“Ingredients”“Related Targets”、口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18，批量輸入關(guān)鍵詞，自動(dòng)篩選紫英抗炎合劑各藥物活性成分及對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)據(jù)。同時(shí)通過中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所、化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)查找TCMSP中沒有的藥物，獲取化學(xué)成分，并選擇相同篩選條件，獲取對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)據(jù)，最后通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。

1.2.2 獲取慢性盆腔炎相關(guān)基因 在人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)GeneCards中以“Chronic pelvic inflammatory disease”搜索慢性盆腔炎相關(guān)基因。根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》對(duì)于濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的癥狀描述內(nèi)容，以下腹痛、白帶多、色黃質(zhì)稠、腰骶痛、舌有瘀斑、苔膩、脈弦等繼續(xù)搜索，得到的基因經(jīng)過合并去重后，與之前得到的慢性盆腔炎基因一同錄入Draw Venn Diagram網(wǎng)站，交集數(shù)據(jù)即研究所需濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎基因[10]。

1.2.3 紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎作用靶點(diǎn)篩選 將“敗醬草”“蒲公英”“大血藤”“紫花地丁”“乳香”“延胡索”的藥物靶點(diǎn)合并去重，與慢性盆腔炎的疾病靶點(diǎn)共同錄入Draw Venn Diagram網(wǎng)站，繪制韋恩圖后顯示的兩者交集即為紫英抗炎合劑潛在治療靶點(diǎn)。

1.2.4 構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) STRING平臺(tái)中導(dǎo)入篩選出的紫英抗炎合劑靶點(diǎn)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。參數(shù)設(shè)置選項(xiàng)為“multiple proteins（多種蛋白質(zhì)）”，蛋白種類為“homo sapiens”，相互作用閾值設(shè)定為高置信度“highconfidence>0.9”，隱藏游離蛋白，其他均默認(rèn)，生成的PPI文件下載后導(dǎo)入CytoScape軟件繪制成圖。運(yùn)用Cytoscape中“CytoHubba”插件中的多種算法結(jié)合“MCODE”插件篩選核心靶點(diǎn)，取交集基因，根據(jù)CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中疾病靶基因的inference score排名情況，綜合考量后獲得最終的核心靶點(diǎn)。

1.2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 對(duì)比紫英抗炎合劑中成分靶點(diǎn)及慢性盆腔炎（濕熱瘀結(jié)型）靶點(diǎn)，找出各項(xiàng)成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，整理文件數(shù)據(jù)并導(dǎo)入CytoScape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，即“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。在網(wǎng)絡(luò)中各項(xiàng)節(jié)點(diǎn)代表藥物、靶點(diǎn)及化學(xué)成分，邊代表每個(gè)節(jié)點(diǎn)之間相互的作用。

1.2.6 紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎的靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 Metascape平臺(tái)功能包括PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)、生物通路富集分析及基因注釋。將潛在治療靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái)，選擇物種種類為“homo sapiens”，設(shè)置<0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子值超過1.5，對(duì)生物學(xué)過程和代謝通路進(jìn)行分析，同時(shí)將KEGG與GO數(shù)據(jù)結(jié)果保存后上傳至微生信平臺(tái)，并進(jìn)行可視化構(gòu)圖。

1.2.7 重要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證 將藥物活性成分網(wǎng)絡(luò)按度值排序，選擇前5的成分從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)搜索對(duì)應(yīng)配體的結(jié)構(gòu)。將與濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎相關(guān)的核心靶點(diǎn)作為對(duì)接的受體。在UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)中查找人類已驗(yàn)證的靶點(diǎn)受體蛋白ID，進(jìn)入RCSB PDB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇分辨率最高的人源結(jié)構(gòu)做為對(duì)應(yīng)的蛋白受體結(jié)構(gòu)；將受體蛋白文件導(dǎo)入PyMOL軟件進(jìn)行去除溶劑、改性殘基等操作，然后利用AutoDockTools加氫、計(jì)算電荷，轉(zhuǎn)換格式保存。通過AutoDockTools的Grid Box對(duì)活性口袋參數(shù)進(jìn)行確定，使用vina分子對(duì)接，并應(yīng)用“Analyze”中“Show Interations”查看氫鍵，最后選擇結(jié)合能高、構(gòu)象較好的結(jié)果導(dǎo)入Pymol進(jìn)行可視化作圖[11]。

在DrugBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索關(guān)鍵詞“Chronic pelvic inflammatory disease”，獲得用于治療慢性盆腔炎的西藥藥物，并選取浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院現(xiàn)有的品種從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)做為對(duì)照配體，與核心靶蛋白受體進(jìn)行分子對(duì)接，并比較對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 紫英抗炎合劑有效活性成分和靶基因

TCMSP中篩選發(fā)現(xiàn)，“紫花地丁”沒有相應(yīng)結(jié)果，不能進(jìn)行后續(xù)研究；通過中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)查找“蒲公英”獲取化學(xué)成分，并在TCMSP中以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件，篩選有效活性成分及對(duì)應(yīng)的靶基因數(shù)據(jù)。

蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)UniProt進(jìn)行校正后得到敗醬草、大血藤、蒲公英、乳香及延胡索靶基因分別有209個(gè)、46個(gè)、28個(gè)、12個(gè)、208個(gè)，合并去重后共得到中藥靶基因237個(gè)。

2.2 濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎相關(guān)基因

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Chronic pelvic inflammatory disease”，并通過中位數(shù)卡值、去重后共篩選出1936個(gè)慢性盆腔炎相關(guān)基因。檢索下腹痛、白帶多、色黃質(zhì)稠、腰骶痛、舌有瘀斑、苔膩、脈弦為關(guān)鍵詞搜索，合并去重后得到646個(gè)濕熱瘀結(jié)型相關(guān)的基因，與慢性盆腔炎基因錄入Draw Venn Diagram，得到兩者交集并導(dǎo)出數(shù)據(jù)，即濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎基因共434個(gè)。

2.3 疾病—成分靶點(diǎn)

將紫英抗炎合劑各成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)組內(nèi)去重后，和疾病基因共同導(dǎo)入Draw Venn Diagram網(wǎng)站，繪制韋恩圖，所得72個(gè)靶點(diǎn)即紫英抗炎合劑作用于濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的潛在靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 紫英抗炎合劑-濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎靶點(diǎn)韋恩圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將前述72個(gè)關(guān)鍵靶基因輸入STRING，按照1.2.4進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，下載PPI.tsv文件后導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，圖中八邊形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，靶點(diǎn)越大越深代表其在網(wǎng)絡(luò)中涉及的生物功能越多，越重要，見圖2。

運(yùn)用Cytoscape中“CytoHubba”插件中的多種算法結(jié)合“MCODE”插件篩選核心靶點(diǎn)，取交集基因，見圖3。結(jié)合CTD數(shù)據(jù)庫(kù)中疾病靶基因的檢索結(jié)果，根據(jù)inference score排名情況綜合考量后獲得最終的核心靶點(diǎn)為IL6、TNF。

2.5 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將紫英抗炎合劑的5個(gè)藥物、59種有效活性成分及72個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)按要求整理成Network和Type文件后導(dǎo)入Cytoscape，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見圖4。

圖2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

注：八邊形代表靶點(diǎn)，顏色由深至淺、大小由大到小代表重要程度降低

圖3 核心靶基因

圖4 紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎藥物-化學(xué)成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

注：六邊形代表藥物，三角形代表化學(xué)成分，菱形代表靶點(diǎn)

該網(wǎng)絡(luò)圖包括136個(gè)節(jié)點(diǎn)，423條邊，其中邊代表相互關(guān)系，使用“Analyze Network”計(jì)算“degree”值，degree前5數(shù)據(jù)結(jié)果提示，“degree”值排名前5的化學(xué)成分為MOL000098槲皮素、MOL000006木犀草素、MOL000422山奈酚、MOL000449豆甾醇、MOL000358β-谷甾醇，此5種成分為紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的主要成分。圖中一個(gè)藥物包含了多種成分，一種成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，一個(gè)靶點(diǎn)又和不同的成分相對(duì)應(yīng)，充分驗(yàn)證了紫英抗炎合劑做為一種中藥復(fù)方制劑治療慢性盆腔炎是通過多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用進(jìn)行。

2.6 Go功能富集分析和KEGG通路富集分析

2.6.1 Go功能富集分析 通過將2.3中獲取的靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái)，選擇物種種類為“homo sapiens”，設(shè)置<0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子>1.5，分析其主要的生物學(xué)過程與功能，共富集出1300個(gè)生物學(xué)過程（BP）、47個(gè)細(xì)胞成分（CC）、89個(gè)分子功能（MF），根據(jù)校正后值進(jìn)行排序，BP、CC、MF三項(xiàng)各自選擇前20、16、20個(gè)導(dǎo)入微生信進(jìn)行柱狀圖展示，見圖5。

紫英抗炎合劑主要參與的生物過程包括對(duì)細(xì)胞遷移的積極調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的負(fù)調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞增殖、對(duì)生長(zhǎng)因子的反應(yīng)、調(diào)節(jié)炎癥、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)等。

分子功能主要富集在細(xì)胞因子活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、生長(zhǎng)因子結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合、腫瘤壞死因子受體結(jié)合、磷酸蛋白結(jié)合、酶抑制劑活性等。

2.6.2 KEGG通路富集分析 通過將2.3中所得靶點(diǎn)錄入Metascape平臺(tái)，選擇物種種類為“homo sapiens”，設(shè)置<0.01，最小計(jì)數(shù)為3，富集因子>1.5，分析其主要的信號(hào)通路，共獲取143條通路，結(jié)合值對(duì)通路排序，選擇排名前20的通路導(dǎo)入微生信進(jìn)行氣泡圖展示，見圖6。

圖5 GO富集BP、CC、MF三合一柱形圖

注：柱形高度由高到低代表涉及功能重要性依次降低

圖6 KEGG通路氣泡圖

注：氣泡由大到小、顏色由深到淺代表參與通路數(shù)量依次降低

紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎參與的信號(hào)通路包括癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、NF-κB、甲狀腺激素、VEGF、趨化因子信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等。

將排名前20的通路和其作用相關(guān)的63個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入CytoScape構(gòu)建“通路-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，見圖7。

2.7 重要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接驗(yàn)證

將篩選出的成分槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇作為配體，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取對(duì)應(yīng)配體的結(jié)構(gòu)。將2.4中獲得的核心靶點(diǎn)蛋白IL6、TNF按1.2.7中所示方法選擇分辨率最高的人源結(jié)構(gòu)1ALU、5UUI做為對(duì)應(yīng)的蛋白受體結(jié)構(gòu)。應(yīng)用AutoDockTools確定Grid Box獲得活性口袋參數(shù)后，使用vina進(jìn)行分子對(duì)接操作得到每種活性成分配體和受體蛋白之間的結(jié)合能，見表1。

圖7 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

注：圖中圓形代表通路，六邊形代表靶點(diǎn)

配體和受體對(duì)接結(jié)合能越低表示分子間結(jié)合的越穩(wěn)固，結(jié)合能≤-5.0kcal/mol時(shí)表示兩者結(jié)合的較好，結(jié)合能≤-7.5kcal/mol時(shí)表示兩者間結(jié)合的非常好[11,12]。紫英抗炎合劑中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的各組對(duì)接結(jié)果均<-5.0kcal/mol，表明結(jié)合活性良好，紫英抗炎合劑的主要活性成分對(duì)慢性盆腔炎的核心靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。使用“Analyze”中“Show Interations”查看氫鍵，最后選擇結(jié)合能高、構(gòu)象較好的結(jié)果Stigmasterol-IL6進(jìn)行可視化處理，分子對(duì)接圖和結(jié)合位點(diǎn)，見圖8。

表1 紫英抗炎合劑重要活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能

圖8 豆甾醇-IL6分子對(duì)接圖

選取浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬湖州中醫(yī)院現(xiàn)有治療慢性盆腔炎的品種Azithromycin、Cefoxitin，從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)，做為對(duì)照配體，和核心靶蛋白受體進(jìn)行分子對(duì)接，見表2。紫英抗炎合劑中的幾組結(jié)合能均低于對(duì)照的西藥結(jié)合能，紫英抗炎合劑的主要活性成分對(duì)慢性盆腔炎的核心靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性可能優(yōu)于西藥。

表2 對(duì)照西藥活性成分與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)合能

3 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息分析的方法，分析了紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎時(shí)疾病-藥物-成分-靶點(diǎn)之間的相關(guān)信息，進(jìn)行梳理后構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，直觀顯示該復(fù)方制劑中各有效成分、制劑的核心成分和疾病靶點(diǎn)的互相作用，也展示了生物功能和信號(hào)通路之間等各種復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。

研究人員共篩選出活性成分59個(gè)，與疾病的交集靶點(diǎn)72個(gè)，GO富集出1300個(gè)生物學(xué)過程，89個(gè)分子功能，得到143條信號(hào)通路，驗(yàn)證了紫英抗炎合劑是由多種成分相互協(xié)同作用，對(duì)疾病通過多通路、多靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控和治療。

通過研究發(fā)現(xiàn)，紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎的主要靶點(diǎn)作用于槲皮素、木犀草素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇上，分子對(duì)接結(jié)果顯示以豆甾醇尤其突出，而豆甾醇同時(shí)存在于敗醬草、蒲公英、延胡索中。多篇文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示敗醬草中發(fā)現(xiàn)的槲皮素、木犀草素、山奈酚均具有抗炎、抗病毒的生物活性[13-15]。同時(shí)有多項(xiàng)研究證實(shí)，木犀草素可以通過NF-kB等多個(gè)信號(hào)通路發(fā)揮其藥理作用，有效改善IL6的生成[16-20]。β-谷甾醇、豆甾醇作為甾醇類化合物，具有抗腫瘤、抗炎的作用[21]。

總結(jié)研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，紫英抗炎合劑的關(guān)鍵靶點(diǎn)有TNF、IL6等。IL6、TNF被視為促炎因子，能刺激炎癥介質(zhì)的釋放，引起組織損傷[22]。IL6不僅能激活中性粒細(xì)胞，還能加劇炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[23]。TNF是慢性盆腔炎炎癥反應(yīng)中的重要影響因子，細(xì)菌感染后TNF迅速升高，逐漸演變成慢性盆腔炎[24,25]。由于傳統(tǒng)中藥研究思路的影響，雖然臨床已證實(shí)慢性盆腔炎是促炎和抗炎雙因子共同作用的過程，但紫英抗炎合劑仍局限于最初的臨床案例研究，后期停滯在只使用而未再挖掘的層面，致使文獻(xiàn)中也沒有紫英抗炎合劑對(duì)慢性盆腔炎患者血清影響的進(jìn)一步深入研究。

KEGG分析發(fā)現(xiàn)富集程度較高的有PI3K-Akt信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化、NF-kB信號(hào)通路等多條與癌癥、炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。其中TNF、IL6在以上幾條通路中均有參與，后期將通過其他實(shí)驗(yàn)途徑對(duì)紫英抗炎合劑治療濕熱瘀結(jié)型慢性盆腔炎的主要信號(hào)通路進(jìn)行分析和驗(yàn)證。

分子對(duì)接技術(shù)起源于20世紀(jì)80年代，可以從微觀水平來分析結(jié)構(gòu)，從而確定藥物的生物利用度[26,27]。研究人員應(yīng)用分子對(duì)接技術(shù)，將紫英抗炎合劑配體和慢性盆腔炎受體進(jìn)行模擬對(duì)接，同構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)每一項(xiàng)對(duì)接的結(jié)合能均小于-5.0kcal/mol，一定程度上能說明紫英抗炎合劑與慢性盆腔炎作用靶點(diǎn)受體在結(jié)合蛋白方面較好；比較中西藥組間結(jié)合能后發(fā)現(xiàn)，紫英抗炎合劑組結(jié)合能均低于頭孢西丁組，絕大部分低于阿奇霉素組，因此，就此3個(gè)受體而言，紫英抗炎合劑同它們的對(duì)接結(jié)合程度要優(yōu)于頭孢西丁和阿奇霉素。

選擇出結(jié)合能低并且結(jié)合狀態(tài)佳的結(jié)構(gòu)Stigmasterol-IL6留待做進(jìn)一步的驗(yàn)證研究。

綜上，紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎（濕熱瘀結(jié)型）的靶點(diǎn)主要以消除炎癥為主，即IL6與TNF。涉及的通路包括PI3K-Akt及Th17細(xì)胞分化等。其生物過程主要涉及調(diào)節(jié)炎癥、蛋白磷酸化的積極調(diào)控等。本次研究通過分子對(duì)接方法、生物信息分析并結(jié)合中藥復(fù)方網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，從復(fù)方制劑的成分出發(fā)，由靶點(diǎn)到通路到對(duì)接模擬，逐步闡明了紫英抗炎合劑治療慢性盆腔炎是通過多成分協(xié)作、多靶點(diǎn)結(jié)合、多通路調(diào)控而產(chǎn)生作用，為后續(xù)紫英抗炎合劑的繼續(xù)研究帶來了新的角度和方向，奠定深入研究的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為醫(yī)院未來新制劑的開發(fā)提供了新的方法和路徑。

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Analysis of bioinformatics and molecular docking Ziying anti-inflammatory mixture in the treatment of chronic pelvic inflammatory disease

Department of Pharmacy, Huzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, University of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang, Huzhou 313000, China

To explore the mechanism of Ziying anti-inflammatory mixture in the treatment of damp-heat stasis chronic pelvic inflammatory disease.The active components and target genes of Ziying anti- inflammatory mixture were screened in TCMSP database by self-developed Python script, and the target genes of chronic pelvic inflammatory disease of damp-heat stasis type were obtained from the human gene database GeneCards. “Component-target” and “Component-pathway” networks. The screened key target genes were imported into the STRING online platform, a protein-protein interaction network was established, and bioinformatics analysis was performed to study its mechanism. Finally, the molecular docking analysis was carried out by AutoDockTools and AutoDock vina, and the binding degree of the existing western medicine in the hospital was compared with PyMol for visualization.A total of 59 active ingredients of traditional Chinese medicine such as stigmasterol, 72 key genes such as interleukin-6 and tumor necrosis factor were screened out from Ziying anti-inflammatory mixture; The functions focus on regulating inflammatory response, cytokine activity, etc.; Bioinformatics analysis of signaling pathways showed that the treatment of chronic pelvic inflammatory disease with Ziying anti-inflammatory mixture mainly involves PI3K-Akt signaling pathway, NF-kappa B signaling pathway, etc.; The important active components in Ziying anti-inflammatory mixture bind well to the core targets of chronic pelvic inflammatory disease, even better than azithromycin and cefoxitin. The conformational relationship IL6-Stigmasterol with good binding degree and hydrogen bond formation was screened out for visualization.The above research provides new ideas for further exploration of the preparation, and also provides a new research approach for the development of new preparations in hospitals through network pharmacology, bioinformatics analysis and molecular docking methods.

Chronic pelvic inflammatory disease of damp-heat stasis type; Traditional Chinese medicine compound; Ziying anti-inflammatory mixture; Bioinformatics analysis; Molecular docking

R285

A

1673-9701(2022)36-0006-08

朱潔，電子信箱：ZJ13819231548@163.com

（2022–07–04）

（2022–09–06）