苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌氮素轉(zhuǎn)化的影響機(jī)制*

李睿琦 張新星 高志嶺 廖文華 劉春敬

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河北 保定 071000)

反硝化作用是推動(dòng)自然界中氮素循環(huán)的重要環(huán)節(jié),既可用于治理水體污染[1],減少環(huán)境中的硝酸鹽累積,又可能造成農(nóng)田氮肥的流失[2]。反硝化作用產(chǎn)生的N2O是一種重要的溫室氣體,對(duì)臭氧層有破壞作用[3-4],其作用機(jī)制及所涉及酶和微生物的研究越來(lái)越引起廣泛重視。隨著對(duì)根系分泌物-微生物-土壤氮循環(huán)研究的深入了解,發(fā)現(xiàn)某些植物根系分泌物或代謝產(chǎn)物具有抑制土壤硝化及反硝化過(guò)程的作用[5-6]。基于此,研究者將從自然界中植物根系分泌的或從植物組織中提取的對(duì)硝化或反硝化作用有特定抑制效果的化合物命名為“生物硝化抑制劑(BNI)”和“生物反硝化抑制劑(BDI)”。

生物抑制劑的研究起初大多集中在土壤硝化過(guò)程方面[7-9],少數(shù)早期研究者雖然提出一些植物具有較低的反硝化能力[10],通常認(rèn)為是非生物因素導(dǎo)致這種結(jié)果[11]。近年來(lái),隨著一些學(xué)者對(duì)原產(chǎn)于東亞的入侵植物Fallopiaspp.的進(jìn)一步研究,本應(yīng)非常適合在低肥力土壤中生長(zhǎng)的植物,并能大幅度提高土壤肥力、增加氮累積量的富集植物[12-15],其入侵土壤的反硝化潛勢(shì)卻出現(xiàn)降低的趨勢(shì),但影響反硝化的非生物因素卻沒(méi)有發(fā)生變化[16]。研究人員從Fallopiaspp.根系提取物中發(fā)現(xiàn)B型原花青素(PC)可以通過(guò)誘導(dǎo)酶的構(gòu)象變化,特異性地抑制與膜結(jié)合的硝酸還原酶活性,并首次提出了BDI的概念[17-21]。PC的應(yīng)用雖然可以提高氮素利用率、降低環(huán)境效應(yīng),但由于其價(jià)格較高,并不適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

苯甲酸廣泛存在于植物組織及其根際分泌物中,研究發(fā)現(xiàn)牧場(chǎng)中牛的尿斑成分會(huì)影響溫室氣體N2O的排放,3.9 mmol/L的馬尿酸可明顯抑制土壤N2O的排放,并推測(cè)其原因是水解產(chǎn)物苯甲酸對(duì)反硝化過(guò)程的抑制導(dǎo)致的[22-24],但尚未得到證實(shí)。因此,本研究通過(guò)選取來(lái)源于土壤中性能不同的反硝化細(xì)菌為研究對(duì)象,探索土壤反硝化細(xì)菌對(duì)苯甲酸濃度變化的響應(yīng),為深入理解植物與土壤微生物交互作用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌種：銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC13985),脫氮副球菌(Paracoccusdenitrificans)(ATCC19367)。

供試藥品：苯甲酸(純度99.5%)。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L。

LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L瓊脂粉。

DM培養(yǎng)基：硝酸鉀0.72 g/L,磷酸二氫鉀1.0 g/L,七水合硫酸鎂0.2 g/L,六水合丁二酸鈉2.8 g/L,pH=7.0。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同濃度苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌氮素轉(zhuǎn)化的影響

(1) 設(shè)置4個(gè)苯甲酸摩爾濃度,分別為1、2、3、4 mmol/L,以不加苯甲酸為空白對(duì)照,編號(hào)分別為B1、B2、B3、B4、CK,所有處理重復(fù)3次。

(2) 菌株的培養(yǎng)：試驗(yàn)選取了土壤中常見(jiàn)的兩種不同屬的反硝化細(xì)菌：脫氮副球菌和缺乏N2O還原酶活性的反硝化細(xì)菌——銅綠假單胞菌。試驗(yàn)期間,首先對(duì)兩種細(xì)菌進(jìn)行活化,將2 mL含有20%(體積分?jǐn)?shù))甘油的銅綠假單胞菌和脫氮副球菌菌液接種至25 mL LB液體培養(yǎng)基中,在搖床上(30 ℃、160 r/min)培養(yǎng)24 h,在其對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)轉(zhuǎn)接至LB固體培養(yǎng)基上,30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)挑取單菌落接種至100 mL LB液體培養(yǎng)基中,恒溫振蕩24 h,將100 mL菌液離心后(3 500 r/min,10 min),將菌體用0.9%(體積分?jǐn)?shù))的生理鹽水沖洗3次,重新懸浮于200 mL 0.9%的生理鹽水中,放入搖床培養(yǎng)2 h后,將菌液離心(3 500 r/min,10 min),懸浮于DM培養(yǎng)基中,并調(diào)整培養(yǎng)液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光值(OD600)等于0.2待用。

1.2.2 單一碳源苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌的影響

(1) 設(shè)置4個(gè)苯甲酸摩爾濃度,分別為1、2、3、4 mmol/L。

(2) 菌株的培養(yǎng)：同1.2.1中的步驟,其中將DM培養(yǎng)基中的碳源六水合丁二酸鈉去除。

(3) 將不同濃度的苯甲酸與菌液等體積加入?yún)捬跗恐?每隔12 h抽取2 mL氣體樣品用于N2O含量的測(cè)定。測(cè)定72 h后的菌液中苯甲酸的含量。

1.3 測(cè)定方法及計(jì)算

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析,采用單因素方差分析(LSD)、鄧肯多重比較對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一碳源苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌的影響

為了驗(yàn)證銅綠假單胞菌和脫氮副球菌是否具有轉(zhuǎn)化和利用苯甲酸作為碳源的能力,設(shè)置了用苯甲酸作為單一碳源的試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn),與初始時(shí)刻菌液中苯甲酸濃度相比,72 h時(shí)兩個(gè)反硝化細(xì)菌的菌液中苯甲酸含量均無(wú)顯著變化,兩種細(xì)菌均沒(méi)有分解苯甲酸。試驗(yàn)過(guò)程中OD600無(wú)顯著提高,72 h內(nèi)無(wú)N2O明顯排放,表明苯甲酸不能被兩種細(xì)菌所分解,即在后續(xù)細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)中苯甲酸不會(huì)作為碳源被細(xì)菌利用。

2.2 不同濃度苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌OD600的影響

如圖2(a)所示,CK、B1、B2、B3處理的銅綠假單胞菌OD600在6 h之后開(kāi)始不同程度的增長(zhǎng),其中CK處理的銅綠假單胞菌數(shù)量增長(zhǎng)得最為迅速,在18 h時(shí)已經(jīng)到達(dá)峰值;B1處理下的銅綠假單胞菌在試驗(yàn)期間一直處于上升趨勢(shì),在72 h時(shí)到達(dá)峰值,且與CK處理的峰值相比差異不顯著;B2、B3處理下銅綠假單胞菌的OD600增長(zhǎng)緩慢,在72 h到達(dá)峰值,而B(niǎo)4處理下的銅綠假單胞菌OD600無(wú)明顯增長(zhǎng)。

如圖2(b)所示,CK、B1、B2處理的脫氮副球菌OD600在前18 h內(nèi)迅速增長(zhǎng),之后趨于平穩(wěn),分別達(dá)到最大值為0.326、0.329、0.300,B1、B2處理的OD600最大值與CK相比并無(wú)顯著差異,表明1、2 mmol/L的苯甲酸對(duì)脫氮副球菌生長(zhǎng)并無(wú)明顯抑制效果,僅在前18 h抑制其生長(zhǎng)速率;B3處理的OD600在30 h時(shí)開(kāi)始上升,42 h時(shí)到達(dá)峰值0.208,在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)OD600降至0.147,顯著低于CK;B4處理的OD600一直保持初始值,并無(wú)明顯變化,說(shuō)明高濃度的苯甲酸可有效抑制脫氮副球菌的生長(zhǎng),且濃度越高抑制效果越好。

2.3 不同濃度苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌氮素轉(zhuǎn)化的影響

2.3.1 N2O動(dòng)態(tài)變化

如圖3(a)所示,CK、B1、B2、B3處理下的N2O質(zhì)量濃度在前50 h均有不同程度上升,之后趨于穩(wěn)定,于72 h時(shí)達(dá)到最高值,分別為2 259.27、3 667.47、2 901.53、1 588.06 mg/m3。B4處理在前50 h未檢測(cè)到N2O的排放,在72 h時(shí)N2O質(zhì)量濃度達(dá)到最高值僅為166.69 mg/m3。B1、B2與CK相比,兩者均顯著促進(jìn)了反硝化過(guò)程中N2O的排放,72 h時(shí)N2O累積排放質(zhì)量濃度較CK分別增加了62.3%、28.4%;與之相反,B3、B4則均顯著抑制了反硝化過(guò)程中N2O的排放,72 h內(nèi)N2O累積排放質(zhì)量濃度較CK分別降低了29.7%、92.6%,其中B4幾乎完全抑制了銅綠假單胞菌的反硝化過(guò)程。由此可知,苯甲酸對(duì)銅綠假單胞菌反硝化作用表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制N2O產(chǎn)生的特征。

如圖3(b)所示,CK處理下的N2O質(zhì)量濃度在前42 h內(nèi)一直呈上升趨勢(shì),之后趨于穩(wěn)定。B1、B2處理下的N2O質(zhì)量濃度在72 h內(nèi)亦呈上升趨勢(shì),但顯著低于CK處理,B3、B4處理則未檢測(cè)到顯著的N2O排放。由此可知,苯甲酸可顯著抑制脫氮副球菌反硝化作用產(chǎn)生的N2O排放,且影響強(qiáng)度隨著濃度增加而逐漸增強(qiáng)。

圖1 72 h菌液中苯甲酸摩爾濃度Fig.1 The molar concentration of benzoic acid in the bacteria liquid at 72 h

圖2 不同濃度苯甲酸對(duì)細(xì)菌OD600的影響Fig.2 Effects of different concentrations of benzoic acid on bacteria OD600

圖4 不同濃度苯甲酸對(duì)的影響Fig.4 Effects of different concentrations of benzoic acid on

圖5 不同濃度苯甲酸對(duì)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of benzoic acid on

2.4 不同濃度苯甲酸下反硝化細(xì)菌pH的動(dòng)態(tài)變化

由圖6可知,銅綠假單胞菌和脫氮副球菌菌液的初始pH均隨著苯甲酸濃度的升高而逐漸降低,從6.5左右下降至5.5左右。由圖6(a)還可以發(fā)現(xiàn),盡管不同處理的銅綠假單胞菌菌液pH均隨著時(shí)間逐漸升高,但B2、B3和B4處理的pH遠(yuǎn)低于CK和B1處理,尤其是B4處理的pH在試驗(yàn)期間變化甚微,始終保持在5.5左右。根據(jù)圖6(b),B1、B2處理的pH與CK的動(dòng)態(tài)特征基本一致,而B(niǎo)3和B4處理的pH遠(yuǎn)低于上述3個(gè)處理。由此可知,添加苯甲酸引起的菌液pH的變化可能也是影響反硝化過(guò)程的因素之一。

2.5 不同濃度苯甲酸對(duì)反硝化細(xì)菌關(guān)鍵酶活性的影響

本研究測(cè)定了72 h時(shí)不同處理的NR和NiR,以進(jìn)一步分析添加苯甲酸對(duì)兩種菌液反硝化過(guò)程的影響。由圖7可知,銅綠假單胞菌菌液CK的NR要顯著高于脫氮副球菌菌液CK,其N(xiāo)iR活性也顯著低于脫氮副球菌菌液,表明前者的反硝化效率可能要高于后者。

圖6 不同濃度苯甲酸對(duì)菌液pH的影響Fig.6 Effect of different concentration benzoic acid on pH of bacterial solution

注：不同小寫(xiě)字母間表示差異顯著,相同小寫(xiě)字母間表示差異不顯著。圖7 72 h時(shí)不同濃度苯甲酸對(duì)細(xì)菌NR、NiR的影響Fig.7 Effects of different concentrations of benzoic acid on bacterial NR and NiR at 72 h

3 討 論

研究表明,土壤中能降解苯甲酸的反硝化微生物種類(lèi)較多[26],外源可溶性碳的添加可能間接增強(qiáng)土壤微生物反硝化作用,從而促進(jìn)土壤N2O排放[27-30],而本試驗(yàn)證實(shí)選取的兩種反硝化細(xì)菌在厭氧條件下均不能分解苯甲酸,因此在試驗(yàn)中苯甲酸不會(huì)作為碳源來(lái)干擾細(xì)菌的反硝化過(guò)程。

本研究中,銅綠假單胞菌和脫氮副球菌的OD600均隨著苯甲酸的增加、菌液pH下降而下降。這與前人研究結(jié)果一致,即苯甲酸抑菌效果與pH密切相關(guān),這是由于苯甲酸的抑菌作用主要是以酸化細(xì)胞體內(nèi)儲(chǔ)堿的方式使細(xì)胞的呼吸酶系失去活性[31-32]。

綜上,銅綠假單胞菌和脫氮副球菌反硝化過(guò)程不僅對(duì)苯甲酸添加量的響應(yīng)存在明顯差異,且其主要受制環(huán)節(jié)上也存在一定程度的不同,因此還需要開(kāi)展更多的研究,進(jìn)一步探討苯甲酸對(duì)其他類(lèi)型反硝化細(xì)菌的氮轉(zhuǎn)化過(guò)程的影響,摸索其抑制反硝化過(guò)程的主要條件,為苯甲酸的田間應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

(1) 不同苯甲酸濃度均可抑制脫氮副球菌的N2O生成,但僅高濃度苯甲酸抑制了銅綠假單胞菌的N2O生成。

(2) 苯甲酸對(duì)銅綠假單胞菌的生長(zhǎng)和反硝化過(guò)程影響具有低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的特征,而對(duì)脫氮副球菌的生長(zhǎng)和反硝化過(guò)程均為抑制作用。