板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵工藝優(yōu)化及輔料對其多酚含量影響

劉桃，梁建蘭，李潤峰，楊曉寬，2，3*

（1.河北科技師范學院食品科技學院，河北 秦皇島 066600；2.板栗產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心，河北 秦皇島 066000；3.河北省板栗產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 秦皇島 066000）

近年來，隨著時代的發(fā)展，人們越來越關注食品對健康的影響，消費者對食品的關注從最初的美味轉(zhuǎn)向食品對健康的影響。近代研究表明，食品中生物活性成分如多酚、黃酮等在預防疾病方面可以發(fā)揮重要作用[1]。因此，關于食品中多酚、黃酮等活性成分的研究已成為熱點?，F(xiàn)在已經(jīng)證明酚類化合物在抗氧化功能中起著非常重要的作用[2]?？梢杂行宄梭w內(nèi)自由基、具有預防動脈粥樣硬化、延緩衰老、抗炎及抗癌等功效[3-5]，對維護人體健康具有重要意義。莫凡等[6]以糯米為主料，蓮子為輔料，釀造蓮子糯米酒，表明得到的蓮子糯米酒各項指標都符合國家標準且風味獨特，多酚含量為0.864 mg/L，總黃酮含量為0.135 mg/L，生物活性成分得到了提高。趙文凈等[7]以糯米為主料，紅茶為輔料，采用正交試驗研究紅茶糯米酒的生產(chǎn)工藝配方，既有糯米酒的香醇又有紅茶的芳香且生物活性茶多酚達56.36 mg/kg。趙謀明等[8]以糙米、糯米為主料，青蘋果、番石榴、臍橙、芒果為輔料，采用多菌種發(fā)酵，表明優(yōu)化工藝條件下的功能性水果飲料的總酚質(zhì)量濃度為1 420.14 mg/L，DPPH自由基清除能力為10.14 mmol/L，氧自由基吸收能力為16.65 mmol/L，制備出一種酸甜可口、帶水果香味，且酒精度低、富含多酚類化合物，具有強抗氧化活性的水果發(fā)酵飲料。魏勁松等[9]以糯米為主料，蕨根為輔料，采用響應面分析法優(yōu)化蕨根米酒發(fā)酵工藝條件，在此條件下總黃酮含量達43.88 mg/L、感官評分85、酒精度為12.65%vol，得到的蕨根米酒是一種富含黃酮類物質(zhì)、有機酸、氨基酸等多種成分，具有一定養(yǎng)生功能的飲品。

板栗中富含蛋白質(zhì)、氨基酸、微量元素以及較多的多酚、黃酮類等生物活性成分[10-12]，其中板栗仁多酚類物質(zhì)含量較高，主要有沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素、山奈酚等，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化作用[13]。生姜是一種集營養(yǎng)、保健、調(diào)味于一體的經(jīng)濟作物[14]。具有多種生物活性物質(zhì)如黃酮、多酚、多糖等，其中多酚化合物（如姜酚、沙果醇和姜烯酚）含量最高，具有較強的抗氧化、抗炎和抗癌活性[15-16]。中國板栗和生姜的產(chǎn)量在全球均名列前茅，二者在貯藏過程中容易發(fā)生腐敗，造成嚴重資源浪費且深加工產(chǎn)品較少，亟需開展深加工技術研究；同時，對食品中多酚、黃酮等生物活性成分研究，雖已深入開展但通過輔料調(diào)配定向增加產(chǎn)品中多酚含量，以期改善其功能性的系統(tǒng)研究尚未開展。因此本文以糯米為主料，板栗、生姜為輔料，建立板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵工藝，以多酚含量和感官評分為評價指標，并通過對比糯米黃酒、市售糯米黃酒、板栗糯米黃酒、板栗生姜糯米黃酒的多酚含量，探討板栗生姜等輔料對黃酒中多酚含量的影響。為通過輔料調(diào)配開發(fā)高多酚含量黃酒初步奠定了理論基礎，在此基礎上進一步深入研究將有利于改善其功能性；同時明確提出將板栗、生姜等果蔬類農(nóng)產(chǎn)品作為加工輔料和多酚來源納入食品配方的研究新方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

板栗、糯米、生姜：市售；紅曲：浙江麗水生物科技公司；小曲：湖南華偉銘化工科技有限公司；無水碳酸鈉、沒食子酸（均為分析純）：天津歐博凱化工有限公司；福林酚（分析純）：上海源葉科技有限公司；糯米黃酒：市售。

1.2 儀器與設備

HL-10D蒸飯柜：浙江寧波趙記電器有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技有限公司；雷磁PHS-25指示計：上海儀電科學儀器股份有限公司；酒精計：河北省武強縣華歐儀表配件廠；L530臺式低速離心機：湖南湘儀設備有限公司；UV2600A型紫外可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司。

1.3 試驗方法

板栗生姜糯米黃酒制備工藝流程如下。

生姜汁的制?。哼x用出汁率高、香味濃、淀粉少的鮮姜；清洗時，應將泥土、須根和爛姜在自來水中徹底清洗干凈，然后放進有孔的筐中瀝干。先將生姜切成小塊，再加3倍的水，用打漿機將其打碎。打碎的姜汁過濾2次，然后高速離心（4 500 r/min離心15 min），取上清液。在20℃～22℃下將紅曲和小曲活化2 h。然后將蒸熟的板栗和糯米、過濾后的姜汁與浸泡好的曲混合均勻，放陶罐中搭窩并培菌4 d。然后加入1.5倍體積的水沖缸進行主發(fā)酵，每8 h攪拌一次。經(jīng)過主發(fā)酵的板栗生姜糯米黃酒，用無菌紗布進行粗濾，然后在15℃下進行陳釀。最后將陳釀后的板栗生姜糯米黃酒在65℃的條件下煎酒20 min再進行裝瓶。

1.4 單因素試驗

選擇板栗添加量、生姜汁添加量、紅曲添加量、小曲添加量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度進行單因素試驗，以產(chǎn)品的多酚含量和感官評分為指標確定最佳發(fā)酵工藝參數(shù)。發(fā)酵初始工藝：板栗添加量為25%、生姜汁添加量為0.6%、小曲添加量為0.8%、紅曲添加量為13%、發(fā)酵溫度為22℃、主發(fā)酵時間為8 d。表1為單因素的試驗設計。

表1 單因素試驗水平Table 1 Single factor experiment level

1.5 正交優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇板栗添加量、生姜汁添加量、小曲添加量、發(fā)酵時間4個影響明顯因素進行L9（34）正交試驗，每個因素設3個水平，并以多酚含量和感官評分為指標獲得最佳發(fā)酵條件。正交試驗因素與水平見表2。

表2 正交試驗因素與水平Table 2 Orthogonal test factors and levels

1.6 感官評價

對黃酒的每個指標分別進行評價，選10名感官評定人員對其各項指標進行打分，平均值作為感官評分。具體評分標準見表3。

表3 板栗生姜糯米黃酒的感官評分標準Table 3 Sensory scoring standards of chestnut ginger glutinous rice wine

1.7 理化指標測定

酒精度、總糖、總酸、氨基酸態(tài)氮含量分別參照GB/T 13662—2018《黃酒》中的蒸餾法、亞鐵氰化鉀滴定法、電位滴定法、甲醛滴定法進行測定[17]。

1.8 多酚含量的測定

1.8.1 沒食子酸丙酯標準曲線繪制

準確稱取250 mg沒食子酸丙酯，定容至250 mL；準確取上述對照品溶液 0.025、0.050、0.100、0.200、0.400、0.600 mL于25 mL比色管中，再加1.25 mL福林酚試劑，搖勻后再加入3.75 mL 20%Na2CO3溶液，定容至刻度，于30℃反應2 h。同時用不加對照品溶液扣除空白。繪制標準曲線，回歸方程為y=3.123 2x-0.037 2，R2=0.999 1在0.025 mg/mL～0.600 mg/mL范圍內(nèi)對照品沒食子酸丙酯的量與吸光度呈良好的線性關系。

1.8.2 多酚含量的測定

準確量取板栗生姜糯米黃酒1 mL于25 mL比色管中，再加1.25 mL福林酚試劑，搖勻后再加入3.75 mL 20%Na2CO3溶液，于30℃反應2 h，配制相應空白試劑，在760 nm波長處測定吸光度，從標準曲線得出相當于板栗生姜糯米黃酒中多酚物質(zhì)含量[18]。

1.9 數(shù)據(jù)處理

每個試驗3次重復，用Origin2017軟件和Excel對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 板栗添加量對板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵的影響

不同板栗添加量對多酚含量和感官評分的影響見圖1。

圖1 不同板栗添加量對多酚含量和感官評分的影響Fig.1 The effect of different additions of chestnut on polyphenol content and sensory score

由圖1可知，板栗添加量在20%～40%時，隨著板栗添加量的增加，板栗生姜糯米黃酒多酚含量不斷增大，當板栗添加量為30%時，板栗生姜糯米黃酒的感官評分為87.43達到最大值，多酚含量為2.43 g/L，制得的黃酒口感飽滿、醇香濃郁。當板栗添加量超過30%時，多酚含量增速變緩，感官評分呈明顯下降趨勢。可能是板栗自身有較多的酚類物質(zhì)，板栗的添加雖會提高黃酒的多酚含量和風味，但超過一定范圍時，不但會掩蓋板栗本身的栗香，而且會影響黃酒的口感。因此，確定板栗最佳添加量為30%。

2.1.2 生姜汁添加量對板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵的影響

不同生姜汁添加量對多酚含量和感官評分的影響見圖2。

圖2 不同生姜汁添加量對多酚含量和感官評分的影響Fig.2 The effect of different ginger juice additions on the content of polyphenols and sensory scores

由圖2可知，生姜汁添加量在0.2%～0.8%時，隨著生姜汁添加量的增加，板栗生姜糯米黃酒多酚含量和感官評分均不斷增加，生姜汁添加量在0.8%時，多酚含量為2.43 g/L，感官評分為88.33，均達到最大值，明顯高于其他的生姜汁添加量。當生姜汁添加量超過0.8%時，多酚含量和感官評分隨之下降。可能是由于生姜汁中含有的姜辣素會對風味產(chǎn)生負面影響，生姜汁添加量過高時，會影響酵母的生長和發(fā)酵，酒精度會降低。而且添加過多也會導致多酚含量偏高，帶來苦味，影響感官評分。因此，確定生姜汁最佳添加量為0.8%。

2.1.3 小曲添加量對板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵的影響

不同小曲添加量對多酚含量和感官評分的影響見圖3。

圖3 不同小曲添加量對多酚含量和感官評分的影響Fig.3 The effect of different Xiaoqu addition amount on polyphenol content and sensory score

由圖3可知，小曲添加量在0.2%～0.8%時，隨著小曲添加量的增加，板栗生姜糯米黃酒多酚含量和感官評分均不斷增加，當小曲添加量為0.8%時，板栗生姜糯米黃酒的多酚含量為2.98 g/L，感官評分為85.48，均達到最大值，明顯高于其他的小曲添加量。當小曲添加量超過0.8%時，板栗生姜糯米黃酒多酚含量和感官評分隨之降低。說明添加適量小曲有利于板栗生姜糯米黃酒風味的形成，曲是將原料中蛋白質(zhì)和碳水化合物轉(zhuǎn)化為發(fā)酵過程中微生物生長所需的肽、礦物質(zhì)和糖的酶來源[19]。適量的曲能將醪液中大量可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為酒精，多酚類化合物溶于乙醇，在一定范圍內(nèi)，發(fā)酵液中的多酚含量會隨著乙醇含量的增加而增加。加入過量的曲，發(fā)酵過于迅速，糖化不完全，酒的異味會變重，影響口感。因此，確定小曲最佳添加量為0.8%。

2.1.4 紅曲添加量對板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵的影響

不同紅曲添加量對多酚含量和感官評分的影響見圖4。

圖4 不同紅曲添加量對多酚含量和感官評分的影響Fig.4 The effect of different amounts of red yeast rice on the content of polyphenols and sensory scores

紅曲具有豐富的酶系、獨特的風味和產(chǎn)紅曲色素能力，使其酒體色澤鮮艷，甜味濃郁[20]。在釀造過程中，由于微生物生命活動，原料中原有的不溶性多酚，經(jīng)過酶的作用不斷釋放出來，增加了酒體中可溶性多酚的含量[21]。由圖4可知，當紅曲添加量為13%時，板栗生姜糯米黃酒的多酚含量為2.10 g/L，感官評分達到87.72，均達到最大值。當紅曲添加量超過13%時，板栗生姜糯米黃酒的多酚含量和感官評分隨之下降。紅曲的添加量對于板栗生姜糯米黃酒的品質(zhì)有著直接的影響。紅曲添加過少，菌體生長慢，發(fā)酵速度慢，糖化不徹底，酒精生成少，多酚含量低。添加過量，發(fā)酵速度快，會抑制酵母的生長和發(fā)酵，酒體渾濁。不同紅曲添加量對多酚含量和感官評分沒有明顯影響。因此，確定紅曲最佳添加量為13%。

2.1.5 發(fā)酵時間對板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵時間對多酚含量和感官評分的影響見圖5。

圖5 不同發(fā)酵時間對多酚含量和感官評分的影響Fig.5 The effect of different fermentation time on polyphenol content and sensory score

由圖5可知，發(fā)酵時間在6 d～9 d時，隨著發(fā)酵時間的延長，板栗生姜糯米黃酒多酚含量和感官評分均不斷增加，發(fā)酵第9天時，板栗生姜糯米黃酒的多酚含量為2.04 g/L，感官評分達到86.56，均達到最大值，明顯高于其他的發(fā)酵時間。當發(fā)酵時間超過9 d時，隨著發(fā)酵時間的不斷延長，板栗生姜糯米黃酒感官評分和多酚含量均隨之降低。原因可能是酒中大部分物質(zhì)都是在主酵期間形成的，主發(fā)酵進行的好壞是決定釀造酒質(zhì)量的關鍵。發(fā)酵第9天時，原料中的多酚類物質(zhì)被釋放，發(fā)酵過程中酒精含量增加，使多酚類物質(zhì)溶解量增加。隨著發(fā)酵時間的延長，酵母在生長代謝過程中會產(chǎn)生一些次生代謝產(chǎn)物，導致總多酚發(fā)生氧化、聚合或沉淀等反應。也可能是酒利用總多酚發(fā)生褐變反應，導致總多酚含量下降[22-23]。因此，確定最佳發(fā)酵時間為9 d。

2.1.6 發(fā)酵溫度對板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵的影響

不同發(fā)酵溫度對多酚含量和感官評分影響見圖6。

圖6 不同發(fā)酵溫度對多酚含量和感官評分的影響Fig.6 The effect of different fermentation temperatures on the content of polyphenols and sensory scores

由圖6可知，發(fā)酵溫度在22℃時，板栗生姜糯米黃酒的多酚含量為2.04 g/L，感官評分達到87.08，均達到最大值，而且在此溫度下發(fā)酵效果最好，出酒率最高。當發(fā)酵溫度超過22℃時，板栗生姜糯米黃酒的感官評分和多酚含量隨著溫度的升高而下降，原因可能是溫度太高，酵母容易老化，發(fā)酵時間短，容易導致酒精含量低，多酚容易發(fā)生自身的氧化反應，影響板栗生姜糯米黃酒的口感。低溫可以抑制一些酶（主要是多酚氧化酶和花青素脫色酶）的活性，減弱氧化作用，有效延緩多酚的氧化、聚合和降解，將多酚保留在酒中[24]，從而提高板栗生姜糯米黃酒的風味。在相同的試驗條件下，發(fā)酵溫度對板栗生姜糯米黃酒的感官評分和多酚含量無明顯影響，因此，確定最佳發(fā)酵溫度為22℃。

2.2 正交優(yōu)化試驗結(jié)果及分析

考察板栗添加量、生姜汁添加量、小曲添加量、發(fā)酵時間4個因素對感官評分和多酚含量的影響，試驗結(jié)果見表4。

表4 L9（34）正交試驗結(jié)果Table 4L9（34）orthogonal experiment results

續(xù)表4 L9（34）正交試驗結(jié)果Continue table 4L9（34）orthogonal experiment results

由表4可知，根據(jù)極差大小得出影響板栗生姜糯米黃酒多酚含量和感官評分的主次因素順序為A＞C＞D＞B，即板栗添加量＞小曲添加量＞發(fā)酵時間＞生姜汁添加量。

由表4可知，以感官評分為指標，得出最佳組合為A3B3C3D2，此時得到的板栗生姜糯米黃酒多酚含量為2.44 g/L、感官評分為82.63；以多酚含量為目標，得出最佳組合為A2B1C2D2，此時得到的板栗生姜糯米黃酒多酚含量為3.37 g/L、感官評分為93.28。經(jīng)對比，A2B1C2D2的多酚含量及感官評分均高于A3B3C3D2，因此得出最佳組合為A2B1C2D2，即板栗添加量30%，生姜汁添加量0.6%，小曲添加量0.8%，發(fā)酵時間9 d。

2.3 驗證試驗

在糯米添加量70%、板栗添加量30%、生姜汁添加量0.6%，紅曲添加量13%，小曲添加量0.8%，發(fā)酵溫度22℃，發(fā)酵時間9 d的工藝條件下，經(jīng)過3次重復驗證試驗，結(jié)果見表5。

表5 驗證試驗結(jié)果Table 5 Verification test results

由表5可知，測得板栗生姜糯米黃酒的感官評分為94.58，明顯優(yōu)于初始工藝，與預測值相差不足5%，說明具有可靠性。其感官評分也高于胡美怡等[25]研究的板栗黃酒中感官評分92.53。所得板栗生姜糯米黃酒酒香濃郁、色澤呈橙紅色、口感飽和、風味醇香、具有板栗獨特風味。在此基礎上，測定多酚含量為3.45 g/L。

2.4 理化指標測定結(jié)果

板栗生姜糯米黃酒的理化指標測定結(jié)果見表6。

表6 板栗生姜糯米黃酒的理化指標Table 6 The physical and chemical indexes of chestnut ginger glutinous rice wine

由表6可知，根據(jù)板栗生姜糯米黃酒的最佳發(fā)酵條件釀造出的黃酒，各項理化指標均符合國家標準。

2.5 多酚含量測定

按照建立的板栗生姜糯米黃酒工藝以及正交試驗結(jié)果，以優(yōu)化工藝條件下板栗生姜糯米黃酒為樣品，以糯米黃酒、板栗糯米黃酒和市售糯米黃酒為對照樣，進行多酚含量測定，結(jié)果見圖7。

圖7 板栗生姜糯米黃酒中多酚含量對比結(jié)果Fig.7 Comparison results of polyphenol content in chestnut ginger glutinous rice wine

不同風味黃酒的多酚含量存在差異，酚類物質(zhì)對黃酒的品質(zhì)和風味有重要影響。黃酒中的酚類物質(zhì)一般來源于原料及微生物的轉(zhuǎn)換，經(jīng)過長時間發(fā)酵，使原料中多酚類物質(zhì)溶于黃酒中[26]。除了發(fā)酵工藝和酒曲的影響，添加不同的輔料對黃酒的品質(zhì)參數(shù)有顯著影響。由圖7可知，糯米黃酒和板栗糯米黃酒中分別含有1.05 g/L和2.99 g/L多酚，板栗糯米黃酒的多酚含量顯著高于糯米黃酒（P＜0.05），這可能是板栗糯米黃酒中加入釀造輔料板栗所致，板栗中多酚物質(zhì)含量遠比糯米中高[27-28]。經(jīng)過發(fā)酵，已全部吸收到酒液，大大提高了多酚含量。板栗生姜糯米黃酒多酚含量為3.45 g/L，遠遠高于其他3種黃酒含量，多酚含量是糯米黃酒的3倍，是市售糯米黃酒的2倍，是板栗糯米黃酒的1.15倍；這可能是由于添加復方輔料板栗和生姜所致。雖然生姜汁僅添加0.6%，但由于生姜中多酚含量[29]遠遠高于板栗和糯米中的多酚含量，仍顯著增加了板栗生姜糯米黃酒的多酚含量。因此富含多酚類化合物發(fā)酵輔料搭配對黃酒中多酚含量具有重要調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)論

以糯米為主料，板栗、生姜為輔料，確立了板栗生姜糯米黃酒發(fā)酵工藝，并對其工藝參數(shù)進行優(yōu)化，最佳的工藝條件：板栗添加量30%、生姜汁添加量0.6%、小曲添加量0.8%，紅曲添加量13%、主發(fā)酵時間9 d、發(fā)酵溫度22℃，在此條件下釀制得的黃酒多酚含量為3.45 g/L，感官評分94.58，其各項理化指標均符合國家標準。

優(yōu)化條件下板栗生姜糯米黃酒不僅口感飽滿、風味獨特、營養(yǎng)豐富，而且其生理活性物質(zhì)多酚含量顯著高于板栗糯米黃酒、糯米黃酒、市售糯米黃酒，釀造輔料板栗和生姜是板栗生姜糯米黃酒中多酚的重要來源之一。板栗生姜糯米黃酒工藝簡單、操作便利，為板栗深加工提供新的思路，同時開辟了將板栗、生姜等作為釀造輔料和多酚來源納入黃酒配方的研究新方向。