高溫花生粕功能肽的酶法制備

韓杰，趙路蘋，王丹，劉瑩，周莉，馬彩紅，丁秀臻

（山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東省糧食加工技術工程技術研究中心，山東 泰安 271018）

花生粕是花生制油后的主要副產(chǎn)品[1]，其蛋白質 含量高達40%～50%[2-4]，是一種豐富的蛋白質資源。目前我國市場上的花生粕主要為高溫花生粕，壓榨過程中溫度可達100℃～150℃，高溫高壓使得蛋白質變性嚴重、溶解性差、回收率低，其營養(yǎng)價值和功能特性也受到影響。另外，在高溫高壓條件下發(fā)生的化學反應使花生粕呈色較深，多數(shù)高溫花生粕被用作飼料，附加值較低。因此，對高溫花生粕進行加工，提高回收率的同時制備功能性蛋白或肽，提高高溫花生粕的附加值，具有重要意義。

酶水解是一種條件溫和、不破壞食品中蛋白質營養(yǎng)價值、可以獲得良好蛋白質功能性質并有效提高蛋白質回收率的方法。經(jīng)過酶解后的水解產(chǎn)物易被人體消化吸收，更能促進人體健康，研究表明花生蛋白水解物具有乳化性、起泡性及保水性等功能特性[5]。王越等[6]發(fā)現(xiàn)采用堿性蛋白酶和中性蛋白酶對花生蛋白進行水解可以明顯提高花生蛋白的一氧化氮自由基清除能力，為花生免疫活性肽的開發(fā)提供了依據(jù)。趙謀明等[7]利用不同蛋白酶水解高溫花生粕和低溫花生粕，對比其功能性質和抗氧化活性，結果發(fā)現(xiàn)用生物酶解的方式能夠有效利用高溫花生粕中的蛋白質，但并未關注酶解物界面活性。

本文用不同蛋白酶水解高溫花生粕，測定酶解物的功能性質和抗氧化活性，篩選出最合適的蛋白酶，以期得到具有良好界面活性和抗氧化活性的酶解物，為高溫花生粕蛋白在食品行業(yè)中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高溫花生粕：山東金勝糧油食品有限公司。

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、復合蛋白酶、風味蛋白酶：北京諾維信生物科技有限公司；木瓜蛋白酶（2 000 L/mg）：生工生物工程（上海）股份有限公司；乙腈（色譜純）：美國Sigma-Aldrich公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海華藍化學科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

FE28 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TDZ5-WS離心機：湘儀離心機儀器有限公司；K9840自動凱氏定氮儀：山東海能科學儀器有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；T25高速分散機：德國IKA公司；800Y粉碎機：永康市鉑歐五金制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶水解

預處理：將高溫花生粕置于粉碎機中，粉碎后過80目篩除去大顆粒和雜質。采用鹽酸溶液洗滌的方式對高溫花生粕進行脫色，脫色條件為料液比為1∶5（g/mL）、pH3.0、50 ℃、120 min。

酶水解：取適量高溫花生粕粉末，以1∶10（g/mL）料液比加入去離子水，并將其調節(jié)至酶的最適pH值和最適溫度，隨后向上述溶液中分別加入質量分數(shù)為1%（按底物計）的酶，酶解360 min。酶解結束后，將酶解混合物在100℃下加熱10 min滅酶活，4 000 r/min下離心30 min，取上清液冷凍干燥，-20℃保存?zhèn)溆肹7-8]。不同蛋白酶的最適溫度和pH值見表1。

表1 不同蛋白酶的最適溫度和最適pH值Table 1 Optimum temperature and pH of proteases

1.3.2 水解度的測定

水解度（degree of hydrolysis，DH）的測定采用pH-stat法[9]，按公式（1）計算水解度。

式中：B為NaOH溶液的消耗體積，mL；c為NaOH濃度，mol/L；M為被水解蛋白質的質量，g；α為蛋白質水解時的氨基解離度；htot為每克蛋白質中肽鍵的毫摩爾數(shù)，7.13 mmol/g。

1.3.3 蛋白質提取率的測定

蛋白質含量的測定采用凱氏定氮法進行，按照公式（2）計算蛋白質提取率。

1.3.4 分子量分布的測定

采用高效液相色譜（high performance liquid，chromatography，HPLC）測定水解物的分子量分布[10]，檢測條件為色譜柱：TSKgel2000 SWXL（300 mm×7.8 mm）；流動相：乙腈∶水∶三氟乙酸=45∶55∶0.1（體積比）；流速：0.5 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：30℃；標準物質子質量分別為肌紅蛋白（16951Da）、抑肽酶（6511Da）、血管緊張素（1 045 Da）、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸（451 Da）、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸（189 Da）。

1.3.5 起泡性及泡沫穩(wěn)定性的測定

起泡性（forming capacity，F(xiàn)C）和泡沫穩(wěn)定性（forming stability，F(xiàn)S）的測定方法參考Jia等[11]的方法。按照下列公式計算FC和FS。

式中：V1為均質0 min后的泡沫體積，mL；V0為均質前的樣品體積，mL。

式中：V1為均質0 min后的泡沫體積，mL；V2為均質30 min后的泡沫體積，mL。

1.3.6 乳化活性及乳化穩(wěn)定性的測定

參考Zhang等[12]的方法并加以修改。用20 mmol/L pH7的磷酸鹽緩沖溶液配制濃度為0.2%的樣品溶液12 mL，加入4 mL大豆油混勻，于10 000 r/min均質2min。均質后0min和10min分別從乳化層吸取100μL樣品，與5 mL濃度為0.1%十二烷基硫酸鈉溶液混合，在500 nm處測定吸光度。按照公式（5）和（6）計算乳化活性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）、乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）。

式中：A0為均質后稀釋樣品的吸光度；N為樣品稀釋的倍數(shù)；ρ為樣品的質量濃度，g/mL；I為比色皿厚度，cm；φ為乳化液中油的體積分數(shù)，0.25。

式中：Δt為兩次測量之間的間隔時間，min；A0為均質后稀釋樣品的吸光度；A10為均質10 min后的吸光度。

1.3.7 DPPH自由基清除率的測定

參考楊珊珊等[13]的方法測定DPPH自由基清除率。水解產(chǎn)物的濃度為0.2 mg/mL～2.0 mg/mL，其余操作與參考文獻相同。按公式（7）計算DPPH自由基清除率。

式中：A1為對照組的吸光度；As為試驗組的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.8 酶水解動力模型的構建過程

在建設少數(shù)民族幼兒音樂教育資源庫的過程中，一定要充分發(fā)掘民間音樂固有的特性，發(fā)揮音樂教師的帶動作用，以教師為主體，使少數(shù)民族幼兒音樂教育更加有針對性，更加符合幼兒的學習需求。讓幼兒產(chǎn)生學習民族歌曲的濃厚興趣，提高學習民間音樂的動力，更好地了解、學習民間音樂。

以經(jīng)典的米氏方程為基礎，用數(shù)學推導結合試驗研究的方法，構建蛋白酶水解高溫花生粕動力學模型。根據(jù)相關數(shù)據(jù)確定模型參數(shù)，并對試驗模型進行驗證。

E代表酶、S代表底物、ES代表兩者結合物、P代表酶解產(chǎn)物，蛋白酶酶解蛋白質的反應過程為E+S?ES→E+P[14]。

根據(jù)Wu等[15]和石寧蕙等[16]的方法，蛋白酶有限水解動力學模型用公式（8）表示。

式中：a、b為動力學參數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗平行測定3次，采用IBM SPSS Statistics 25.0、Origin 2016和Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 水解度測定結果

酶解法是制備多肽常用的方法，不同種類的蛋白酶有不同的酶切位點，從而導致蛋白酶水解物具有不同的理化特性和功能特性[17]。不同蛋白酶水解高溫花生粕的水解曲線如圖1所示。

圖1 不同蛋白酶水解高溫花生粕的水解曲線Fig.1 Hydrolysis curves of hot-pressed peanut meal with different proteases

由圖1可知，所有蛋白酶水解高溫花生粕的水解曲線隨著水解時間的延長呈先快速上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。水解30 min后，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和風味蛋白酶的水解進程開始變慢，逐漸達到穩(wěn)定狀態(tài)，而復合蛋白酶、堿性蛋白酶的DH一直保持上升趨勢。水解360 min后，高溫花生粕經(jīng)復合蛋白酶水解的DH為11.70%，經(jīng)堿性蛋白酶水解的DH為24.87%。木瓜蛋白酶的水解度在120 min時達到最大值，達到最大水解度時間最短，因此水解效率最大。

2.2 蛋白質提取率測定結果

高溫花生粕經(jīng)不同蛋白酶水解后的蛋白質提取率結果見圖2。

圖2 不同蛋白酶水解后的蛋白質提取率Fig.2 Protein extraction rates after hydrolysis with different proteases

由圖2可知，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物的蛋白質提取率最高，為82.53%，其次為復合蛋白酶（75.62%），木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的蛋白質提取率為63.77%。堿性蛋白酶、復合蛋白酶、木瓜蛋白酶的蛋白質提取率均高于用蒸汽爆破輔助堿溶酸沉法[18]提取高溫花生粕中的蛋白質提取率（52.6%），高于趙謀明等[7]酶解提取高溫花生粕中的蛋白質提取率（60.61%～67.86%）。由此可見，酶水解的方式可以有效地將高溫花生粕中的不溶性蛋白[19]轉變?yōu)榭扇苄缘碾?，從而將蛋白提取出來?/p>

2.3 分子量分布

分子量大小是影響肽段功能性質和生物活性的重要因素。根據(jù)分子量的大小，將色譜峰分為I～V 5個區(qū)段，分別對應分子量＞10 kDa、3 kDa～10 kDa、1 kDa～3 kDa、500 Da～1 kDa及＜500 Da。酶解產(chǎn)物的分子量分布如表2所示。

表2 不同蛋白酶水解物的分子量區(qū)段百分比Table 2 Percentages of protease hydrolysates in different molecular weight ranges

由表2可知，堿性蛋白酶水解物中小分子量組分（＜500 Da及500 Da～1 kDa）含量最多，大分子量組分（＞10 kDa及3 kDa～10 kDa）含量最少，而風味蛋白酶水解物中小分子組分含量最少，大分子量組分最多，說明小分子組分含量與DH呈正相關，大分子組分含量與DH呈負相關。木瓜蛋白酶水解物中＞1 kDa組分含量和＜1 kDa組分含量相當。

2.4 起泡性和泡沫穩(wěn)定性測定結果

不同蛋白酶水解產(chǎn)物的起泡特性如圖3所示。

圖3 不同蛋白酶水解物的起泡性和泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Foaming ability and foam stability of protease hydrolysates

由圖3可知，中性蛋白酶水解產(chǎn)物的起泡性最高，優(yōu)于復合蛋白酶、堿性蛋白酶和風味蛋白酶水解產(chǎn)物。木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物起泡性與中性蛋白酶水解產(chǎn)物無顯著差異。木瓜蛋白酶水解產(chǎn)物有較高的起泡性，可能是因為蛋白質在木瓜蛋白酶的水解作用下肽鍵斷裂、水解成大量肽段、蛋白質分子的總面積變大、溶解性增強，使肽在空氣-水界面形成膜的能力增強。這與木瓜蛋白酶改性蛋清蛋白，提高了蛋清蛋白的起泡性和泡沫穩(wěn)定性的結果一致[20]。為了測定高溫花生粕水解物的泡沫穩(wěn)定性，對攪拌后的泡沫進行30 min的觀察。由圖3可知，木瓜蛋白酶水解物的泡沫穩(wěn)定性最高，可達67.19%。堿性、復合蛋白酶水解物的泡沫穩(wěn)定性較低，原因可能是水解過程中產(chǎn)生很多小分子的肽，吸附到界面上后界面膜強度不足以支撐泡沫的穩(wěn)定[21]。

2.5 乳化活性和乳化穩(wěn)定性測定結果

乳化性用于反映蛋白質在油水界面處的吸附能力與穩(wěn)定能力，分別用乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）來表示。不同蛋白酶水解物的EAI和ESI見圖 4。

圖4 不同蛋白酶水解物的乳化活性和乳化穩(wěn)定性Fig.4 Emulsifying activity and stability of protease hydrolysates

由圖4可知，不同蛋白酶水解物的乳化性不同，木瓜蛋白酶酶解物的乳化活性指數(shù)最強，其次是中性蛋白酶水解物，堿性蛋白酶水解物的乳化活性最差。木瓜蛋白酶水解物的乳化活性指數(shù)最強，原因可能是蛋白酶的水解作用把花生蛋白的疏水基團暴露出來，從而使油水界面的張力變小，經(jīng)水解作用產(chǎn)生的肽更易作用于油水界面并有序排列，這些變化使木瓜蛋白酶水解物有較高的乳化活性指數(shù)[22]。在用不同蛋白酶酶解棗仁蛋白時，木瓜蛋白酶水解物的乳化活性指數(shù)較高[23]。復合蛋白酶水解產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性指數(shù)最大，中性蛋白酶水解物的乳化穩(wěn)定性指數(shù)最小。木瓜蛋白酶水解物的乳化穩(wěn)定性較差可能是因為水解過度導致油水界面分布的短肽減少、流動性減弱、蛋白質的聚集能力減弱，使乳化穩(wěn)定性降低[23]。

2.6 DPPH自由基清除率測定結果

不同蛋白酶的水解物均具有一定的DPPH自由基清除活性，且在一定濃度范圍內(nèi)DPPH自由基清除率與樣品濃度呈正相關。用IC50代表DPPH自由基清除率為50%時的樣品濃度，IC50越小，DPPH自由基清除能力越強。各酶解產(chǎn)物DPPH自由基的IC50見表3。

表3 不同蛋白酶水解物DPPH自由基的IC50Table 3 IC50of DPPH radicals of proteases hydrolysates

由表3可知，由木瓜蛋白酶水解得到的水解物DPPH自由基清除能力最強（IC50=0.72 mg/mL），其次分別為復合蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶水解物，中性蛋白酶水解物DPPH自由基清除能力最差，說明木瓜蛋白酶釋放高溫花生粕中抗氧化肽段的能力最強。這與草菇蛋白木瓜蛋白酶水解物清除DPPH自由基的結果一致[24]。

2.7 酶解動力學模型構建的結果

2.7.1 模型的擬合

鑒于木瓜蛋白酶水解效率最高，蛋白質提取率較高，起泡性、乳化活性和DPPH自由基清除活性最高，因此木瓜蛋白酶為最適用酶。采用方程DH=[ln（1+abt）]/b 對不同酶濃度（E0）、不同底物濃度（S0）下水解度與水解時間進行回歸分析，求出參數(shù)a、b，構建酶水解動力模型，結果見圖5和表4。

表4 不同E0/S0條件下木瓜酶解花生蛋白動力學特征參數(shù)Table 4 Kinetic characteristics of enzyme hydrolysis of peanut protein by papain under different E0/S0conditions

圖5 不同酶濃度、不同底物濃度與水解度關系的非線性擬合Fig.5 Nonlinear fitting of the relationship between enzyme concentrations，substrate concentrations，and degree of hydrolysis

由圖5可知，DH=[ln（1+abt）]/b數(shù)據(jù)的擬合度較高，說明該方程可以用來描述酶水解過程。

由表4可知，b值在不同水解過程中變化不大，趨向于定值1.192。參數(shù)a與E0/S0存在一定線性關系，對a和E0/S0進行線性關系擬合，結果如圖6所示。

圖6 a值隨著不同的E0/S0值的變化趨勢Fig.6 Variation trend of a with E0/S0values

由圖6可知，a和E0/S0的線性關系可表示為a=1 532.6E0/S0-66.084。

把上述試驗中所得動力學參數(shù)a值和b值分別代入方程，得到木瓜蛋白酶可控酶解高溫花生粕的動力學模型，即 DH=0.839ln[1+（1 826.859E0/S0-78.772）t]。從該方程可以看出水解度隨著初始酶濃度的增大而增大，隨初始底物濃度的增大而減小，隨著水解時間的延長，水解的反應速率逐漸降低，這與前面的試驗結果一致，說明該動力模型具有一定的可靠性。

2.7.2 模型的驗證

為了驗證動力學模型的可靠性，把水解動力學模型的計算結果與實際測定值進行比較。在水解溫度為55℃、pH7.0、初始底物濃度100 g/L、酶濃度0.6 g/L條件下，得到相應水解條件下的理論酶解曲線，結果如圖7所示。

圖7 實際水解度與模型預測水解度Fig.7 Actual degree of hydrolysis and model-predicted degree of hydrolysis

由圖7可知，水解度的理論值與實際值相比，相對平均誤差值為7.6%，小于10%，證明所建動力學模型能較好地模擬酶解過程，具有一定的實際應用價值，可以用來描述水解條件與水解度之間的關系。

3 結論

本文研究了蛋白酶種類對高溫花生粕酶解過程和酶解物性質的影響，篩選制備兼具功能性和抗氧化性肽的最適用酶，并對其酶解過程進行動力學分析。結果表明，酶水解是提取高溫花生粕蛋白的有效手段，最適用酶為木瓜蛋白酶，其水解120 min時，水解度達最大值，為4.87%，蛋白質提取率為63.77%，起泡性為216.24%，泡沫穩(wěn)定性為 67.19%，EAI為 39.70 m2/g，ESI為14.88 min，木瓜蛋白酶水解高溫花生粕的動力學模型為 DH=0.839ln[1+（1 826.859 E0/S0-78.772）t]。本研究為高溫花生粕的高值化利用提供了方向。但是木瓜蛋白酶水解物的蛋白質回收率與堿性蛋白酶水解物的回收率還有一定差距，需要對木瓜蛋白酶的水解過程進一步優(yōu)化以提高蛋白質回收率。