不同糖源發(fā)酵藍莓酒的品質

唐梅霖，張愛華，曾令文*

（1.常州大學石油化工學院，江蘇 常州 213164；2.常州大學城鄉(xiāng)礦山研究院，江蘇 常州 213164）

蜂蜜含有豐富的營養(yǎng)物質，其糖類成分含量高，以葡萄糖、蔗糖和果糖為主，是天然的糖源，還含有各種酶類、蛋白質和維生素等活性成分，具有殺菌、促進傷口愈合、促進腸胃消化的作用[1]。目前蜂蜜產業(yè)趨勢供大于求，一部分蜂蜜被釀造成蜂蜜酒，飲用蜂蜜酒能起到健脾通腸、養(yǎng)顏美容等保健功效，但是蜂蜜酒口味單一，不符合年輕人的市場需求，因而蜂蜜在創(chuàng)新性開發(fā)方面有待深入研究[2]。藍莓果實富含花青素、氨基酸、維生素、礦物質等活性成分，具有延緩衰老和保護視力的功效，得到消費者青睞[3]。由于藍莓上市時間比較集中，保鮮儲存的成本較高，將其釀造成果酒可以極大改善浪費現(xiàn)象，并且藍莓酒富含的多酚類、黃酮類物質能夠清除人體自由基，達到抗氧化的效果[4]。

目前人們研究藍莓酒的熱潮持續(xù)高漲，張楊等[5]的試驗表明藍莓酒經(jīng)過發(fā)酵之后仍存在許多花色苷物質；趙慧芳等[6]將黑莓和藍莓進行復合發(fā)酵，提高花色苷的穩(wěn)定性，改善褐變現(xiàn)象，有利于多酚物質的浸出；屈嬡等[7]通過響應面試驗得到高酒精度藍莓酒的最佳發(fā)酵工藝條件，延長了藍莓酒的貯藏期。然而，尚未見有關不同糖源發(fā)酵藍莓酒的相關報道。

本文制備3種不同糖源（蜂蜜、黃冰糖、不添加糖源）的發(fā)酵藍莓酒，發(fā)酵過程中檢測可溶性固形物、pH值、酒精度、總酸4個理化指標的變化趨勢，通過測定抗氧化物質（總酚、總黃酮、花青素）含量比較不同藍莓酒的抗氧化性能，將發(fā)酵果酒所測指標進行相關性分析和主成分分析，綜合評價出最佳發(fā)酵工藝，為蜂蜜和藍莓的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂蜜、新鮮藍莓、黃冰糖：市售；釀酒酵母RB2、焦亞硫酸鉀（potassium metabisulfite，PMS）、果膠酶（3 280 U/g，以半乳糖醛酸計）、碳酸氫鉀、酵母營養(yǎng)助劑（均為食品級）：法國Laffort公司；沒食子酸標準品、蘆丁標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）標準品、三吡啶基三嗪[1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine，TPTZ]標準品：上海晶純生化科技股份有限公司；福林酚、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、醋酸、醋酸鈉、濃鹽酸、三氯化鋁、無水乙醇、甲醇、氯化鐵、硫酸亞鐵、乙酸鈉、無水碳酸鈉、酚酞指示劑（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

801B型破碎機：中天炊事機械廠；HV-02型壓榨機：川泰機械廠；PAL-1手持糖度計：日本ATAGO公司；DMATM 35便攜式密度濃度計：奧地利安帕公司；雷磁PHS-3E型pH計、ZDJ-4B自動電位滴定儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀：美國安捷倫公司；UV-2600紫外可見分光光度計：日本島津儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藍莓酒發(fā)酵工藝流程

圖1為藍莓酒發(fā)酵工藝流程。

圖1 藍莓酒發(fā)酵工藝流程Fig.1 The fermentation process of blueberry wine

具體流程：用稀釋的100 mg/L PMS溶液清洗藍莓果實，挑除有瑕疵的爛果，用破碎機將果實切片，放入充有二氧化碳的發(fā)酵桶，果膠酶按照0.03 g/L的用量、PMS按照100mg/L的用量添加，攪拌均勻后放入14℃～16℃環(huán)境下靜置12 h，釀酒酵母RB2按照3 g/L的用量添加，加入2 mL藍莓果汁進行水浴加熱（30℃）活化30 min之后再接入發(fā)酵桶中，酵母營養(yǎng)助劑按照3 g/L的用量同時添加，之后在14℃～16℃環(huán)境下進行發(fā)酵。定期測定可溶性固形物、pH值、酒精度、總酸等變化直至主發(fā)酵結束，當殘?zhí)呛亢途凭茸兓骄彆r表明主發(fā)酵結束。主發(fā)酵結束后，將不同的發(fā)酵藍莓酒經(jīng)壓榨機和濾網(wǎng)過濾澄清，裝入新的發(fā)酵罐中4℃低溫陳釀1個月，陳釀結束后于60℃條件下巴氏殺菌30 min裝瓶儲存。

1.3.2 藍莓酒理化指標的測定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[8]中的方法測定樣品可溶性固形物、pH值、總酸、揮發(fā)酸、SO2含量并進行感官評分；參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》中的方法測定酒精度[9]；參照GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》中的方法測定甲醇[10]。

1.3.3 藍莓酒花青素含量的測定

采用pH示差法[11]測定波長519 nm和700 nm處吸光度。含量以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計，花青素含量計算公式如下。

花青素含量/（mg/L）=（A×449.2×n）×1 000/26 900

式中：A為不同pH值下吸光度差值，A=[（A519-A700）pH1.0-（A519-A700）pH4.5]；n 為稀釋倍數(shù)；449.2 為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質量，g/mol；26 900為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，mol/cm。

1.3.4 藍莓酒總多酚含量的測定

采用福林酚法測定樣品中總多酚含量[12]，將沒食子酸標準品配制成不同濃度（0.017、0.034、0.068、0.012、0.136、0.170 mg/mL），以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。每個樣品需要平行測定3次，標準曲線方程為y=5.201 1x-0.015 7，R2=0.999 3。

1.3.5 藍莓酒總黃酮含量的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法，測定樣品中總黃酮含量[13]，將蘆丁標準品配制成不同濃度，以濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。每個樣品需要平行測定3次，標準曲線方程為y=7.928 5x+0.026 2，R2=0.999 1。

1.3.6 藍莓酒DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基清除率的測定根據(jù)Carmona-Jiménez等[14]和王純等[15]的方法測定。采用分光光度計測定波長517 nm處吸光度Ai，對照組以甲醇溶液代替樣品，測其吸光度A0。DPPH自由基清除率計算公式如下。

DPPH自由基清除率/%=[A0-（Ai-Aj）]/A0×100

式中：A0為DPPH溶液與甲醇混合的吸光度；Ai為DPPH溶液與樣品溶液混合的吸光度；Aj為樣品溶液與甲醇混合的本底吸光度。

1.3.7 藍莓酒鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）的測定

鐵離子還原能力的測定參照文獻[16]的方法，以硫酸亞鐵溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。每個樣品需要平行測定3次，標準曲線方程為y=0.664 5x-0.037 5，R2=0.999 6。樣品最終的總抗氧化能力以硫酸亞鐵當量濃度（mmol/L）表示。

1.3.8 藍莓酒色度的測定

以樣品在波長420、520、620 nm處的吸光度之和[17]表示色度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件Origin 2018作圖，SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)處理，結果用平均值±標準差表示。應用單因素方差分析（One-way ANOVA）、鄧肯氏新復極差法和皮爾遜相關性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵過程中可溶性固形物、酒精度、pH值和總酸的變化

圖2為發(fā)酵過程中可溶性固形物、酒精度、pH值和總酸的變化曲線。

圖2 不同發(fā)酵體系中可溶性固形物、酒精度、pH值、總酸的變化Fig.2 Changes of soluble solids，alcohol，pH，total acid in different fermentation systems

由圖2A可知，不同糖源發(fā)酵藍莓酒中可溶性固形物含量隨著發(fā)酵時間的延長均逐漸降低，其中，添加蜂蜜和黃冰糖藍莓酒的可溶性固形物含量在發(fā)酵前10 d有著明顯的下降趨勢，之后逐漸趨于平穩(wěn)，而未添加糖的藍莓酒在發(fā)酵5 d后無明顯變化。在發(fā)酵初期，蜂蜜藍莓酒可溶性固形物含量較黃冰糖藍莓酒下降明顯，這是由于蜂蜜中所含的糖類為葡萄糖和果糖等單糖，能夠直接被酵母利用轉換成酒精[18]，而黃冰糖需要經(jīng)過酵母中的轉換酶將其分解為葡萄糖和果糖后，再繼續(xù)轉換為酒精，其發(fā)酵速度沒有蜂蜜體系快。對比發(fā)酵后期的可溶性固形物含量，蜂蜜藍莓酒高于黃冰糖藍莓酒，其原因是蜂蜜除含有糖類這些主要物質外，還含有其他非糖類的可溶性成分，也使得酒體更加醇厚[19]。

酒精是酵母利用糖分轉換而得，由圖2B可知，不同藍莓酒的酒精度隨著發(fā)酵時間延長逐漸升高，酒精度的變化總體呈現(xiàn)上升的趨勢且前期酒精度上升速度比后期快，這與圖2A中可溶性固形物的含量變化一致，說明前期的酵母菌活力與后期相比發(fā)生了改變，前期酵母菌的活力高、代謝旺盛，而后期酵母菌的活力降低、代謝能力減弱[20]。隨后，由于酸度的增加，發(fā)酵的環(huán)境變差，酵母發(fā)酵受到影響，導致發(fā)酵速度降低，酒精含量的增加幅度變得緩慢。在發(fā)酵前5 d，蜂蜜體系的酒精度明顯高于黃冰糖體系，這是由于蜂蜜中的單糖直接被酵母利用，而黃冰糖中的單糖需要時間轉換。在發(fā)酵5 d～10 d時，2個體系的酒精度趨于一致，這可能是由于黃冰糖中的單糖被酵母轉換成酒精，蜂蜜體系中單糖的利用接近尾聲。發(fā)酵后期，蜂蜜體系的酒精度依然高于黃冰糖體系，是因為酵母對蜂蜜中碳水化合物的利用率高于黃冰糖，最終得到的酒精度較高。不添加糖的藍莓酒由于沒有足夠糖分，酵母所轉換的酒精度只能維持在4%vol以內。

合適的pH值有利于酵母菌的生存[21]，因此在對比蜂蜜和黃冰糖體系的發(fā)酵性能時，均將其調整為3.4，由圖2C可知，3個體系的pH值在發(fā)酵初期均呈現(xiàn)下降趨勢，蜂蜜體系在第4天出現(xiàn)上升，而其他2個在第5天發(fā)生變化，這是因為發(fā)酵前期糖分可以為酵母提供生長繁殖的能源，發(fā)酵體系內部的微生物能夠促進有機酸的生成，有機酸的含量逐漸變多，因此前期的pH值呈現(xiàn)出下降的趨勢。發(fā)酵5 d后，pH值開始逐漸上升，這是因為前期生成的酒精和有機酸在發(fā)酵體系內部發(fā)生了酯化反應，生成了新的酯類物質，給藍莓酒增添風味。在發(fā)酵后期pH值略有波動，這可能與發(fā)酵體系內部微生物的作用相關。在第15天蜂蜜藍莓酒的pH值處于最低水平，這是因為有機酸含量高于其他2個體系。

由圖2D可知，總酸在發(fā)酵過程中對酵母的生長和酒體的風味起著重要作用[22]，在發(fā)酵初期會產生乙酸、琥珀酸、蘋果酸和丙酮酸等，導致藍莓酒總酸升高。到發(fā)酵后期，部分乙酸被酵母還原成乙醇，蘋果酸也可能在適溫條件下被酵母降解，其中一部分酸進行乳酸發(fā)酵，多元酸轉變成一元酸；同時部分酸與醇形成酯類物質，使得到的總酸含量降低[23]。3種藍莓酒的產酸趨勢相似，蜂蜜藍莓酒總酸含量在第4天開始有下降的趨勢，而黃冰糖藍莓酒和不加糖藍莓酒在第5天開始有下降的趨勢，這與pH值的變化規(guī)律一致。發(fā)酵期間總酸含量有波動，這可能是因為發(fā)生蘋果酸-乳酸反應。在第15天蜂蜜藍莓酒的總酸含量處于最高水平，這與pH值結果相一致。

2.2 藍莓酒考察指標測定結果

對3種發(fā)酵藍莓酒第15天的各項參數(shù)進行整合，結果見表1。

表1 不同糖源藍莓酒的考察指標Table 1 Examine indicators for blueberry wine of different sugar source

由表1可知，不同處理所得到的藍莓酒可溶性固形物、酒精度、甲醇、pH值、揮發(fā)酸、總酸、游離SO2和總SO2等指標均符合GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》、GB 5009.225—2016《食品安全國家標準酒中乙醇濃度的測定》以及GB 5009.266—2016《食品安全國家標準食品中甲醇的測定》中的要求。

蜂蜜藍莓酒的可溶性固形物含量較高，表明其酒體更加飽滿醇厚；調整發(fā)酵液糖度一致，蜂蜜藍莓酒的酒精度高于黃冰糖藍莓酒，這是由于酵母充分利用蜂蜜中的糖源，得到較高的轉換率，而不加糖藍莓酒由于糖分稀缺只得到了4%vol以內的酒精度；3種藍莓酒的甲醇含量均符合國標要求，其中蜂蜜藍莓酒的含量低于黃冰糖藍莓酒；蜂蜜藍莓酒的pH值處于最低水平，這可能是因為蜂蜜中含有的有機酸向發(fā)酵液中轉移，導致?lián)]發(fā)酸、總酸均處于較高水平，增加了酒的醇厚感；酒中揮發(fā)酸的含量可以檢測藍莓酒的發(fā)酵過程是否得當[24]，3種藍莓酒所測得的揮發(fā)酸含量均符合國標要求，表明發(fā)酵過程正常；游離SO2、總SO2指標在蜂蜜藍莓酒與黃冰糖藍莓酒中并無顯著差異（P>0.05）。蜂蜜藍莓酒色度值高于其他2個體系，這可能是因為蜂蜜中的類黃酮物質得到有效浸提，穩(wěn)固藍莓酒的色澤度，且蜂蜜藍莓酒的感官評分處于最高水平，能夠帶來良好的風味體驗。

2.3 不同糖源藍莓酒抗氧化物質及抗氧化性測定結果比較

圖3為不同糖源藍莓酒抗氧化物質及抗氧化性對比結果。

圖3 不同糖源藍莓酒抗氧化物質及抗氧化性對比Fig.3 Antioxidant substance and antioxidant comparison of different sugar source of blueberry wine

酚類化合物是影響藍莓酒質量的重要因素，賦予了藍莓酒獨特的感官品質，其組成含量也與藍莓酒品質密切相關。由圖3A可知，蜂蜜藍莓酒的總多酚、總黃酮、花青素含量最高，具有抗氧化作用，賦予果酒特殊的營養(yǎng)價值。蜂蜜藍莓酒中的酒精含量高，有利于酚類物質的浸提[25]，因此蜂蜜藍莓酒的總多酚含量最高；總黃酮與酒體的感官品質密切相關，能夠與花青素中花色苷物質發(fā)生反應形成輻色效應[26]，蜂蜜藍莓酒中的總黃酮含量最高，進而提高藍莓酒色澤的穩(wěn)定性；花青素主要存在于深色品種的藍莓果皮中，是藍莓酒呈色的主要化合物[27]，3種藍莓酒中蜂蜜藍莓酒的花青素含量最高。由圖3B可知，蜂蜜藍莓酒的抗氧化能力顯著高于其他2組（P＜0.05），這與其抗氧化物質含量高有極大關聯(lián)。

2.4 不同藍莓酒指標的相關性分析

3種藍莓酒考察指標的相關系數(shù)見表2。

由表2可知，藍莓酒的可溶性固形物與酒精度、DPPH自由基清除率、感官評分呈顯著正相關（P＜0.05）；甲醇與游離SO2呈極顯著負相關（P＜0.01）；pH值與揮發(fā)酸、總酸、總多酚、鐵離子還原能力、色度呈顯著負相關（P＜0.05），與總黃酮呈極顯著負相關（P＜0.05）；揮發(fā)酸與總酸、DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力呈顯著正相關（P＜0.05）；總酸與總多酚、總黃酮、鐵離子還原能力呈顯著正相關（P＜0.05）；總多酚與總黃酮、鐵離子還原能力、色度呈顯著正相關（P＜0.05）；總黃酮與鐵離子還原能力、色度呈顯著正相關（P＜0.05）；DPPH自由基清除率與感官評分呈顯著正相關（P＜0.05）。經(jīng)過相關性分析，藍莓酒各項考察指標之間存在獨立性也有著密切的相關性[28]，不同信息之間有著一定程度的重疊，為了提高對藍莓酒品質指標評價的準確性，有必要通過主成分分析將其相關性指標歸類簡化。

2.5 主成分分析

通過主成分分析對不同發(fā)酵工藝所測指標進行降維，以特征值λ＞1為依據(jù)進行因子抽提，主成分特征值及其貢獻率見表3。圖4為不同發(fā)酵體系考察指標主成分分析。

表3 主成分特征值及其貢獻率Table 3 Eigenvalues of principal components and their contribution to total variance

圖4 不同發(fā)酵體系考察指標主成分分析Fig.4 Analysis of main components of different fermentation systems

由表3可知，得到最優(yōu)的主成分數(shù)為2個，第一主成分的貢獻率為82.523%，第二主成分的貢獻率為14.317%，累計方差貢獻率達到96.840%，能夠有效地反映原數(shù)據(jù)的變異信息。

由圖4A可知，花青素、總多酚、總黃酮、色度、DPPH自由基清除率、鐵離子還原能力、總酸、揮發(fā)酸、可溶性固形物、酒精度與主成分 1（principal component 1，PC1）呈正相關，pH值與PC1呈負相關。游離SO2和總SO2與主成分 2（principal component 2，PC2）呈正相關。圖4B的得分圖可以發(fā)現(xiàn)其分布分散，說明這3種藍莓酒的各指標有較大差異，且同種糖源在同區(qū)域[29-30]。結合圖4A可知蜂蜜和藍莓組合發(fā)酵與總多酚、總黃酮、花青素、色度、總酸、揮發(fā)酸有較大聯(lián)系，表明該組合酚類物質多，含有豐富有機酸，抗氧化性能更好。

為了更直觀地得出藍莓酒的綜合評價[31]，對兩個主成分所表達的信息進行數(shù)據(jù)化處理，計算公式如下，根據(jù)下式得到表4。

表4 不同藍莓酒成分得分及綜合排名Table 4 Scores and rankings of different blueberry wine

式中：Z為綜合得分；Y1、Y2為對應主成分得分；X1～X15為各指標原始變量的標準變量。

由表4可知，蜂蜜藍莓酒3個樣品得分高，排在前3名，再結合主成分分析圖可知蜂蜜藍莓酒的酚類物質及抗氧化性都很突出，整體呈色好，感官評分也最高，即品質最好。

3 結論

本試驗以藍莓為原料，通過添加蜂蜜、黃冰糖和不加糖的3種工藝進行發(fā)酵處理，考察其理化指標，對比抗氧化物質含量和抗氧化性能。研究結果發(fā)現(xiàn)：3種工藝中蜂蜜和藍莓組合發(fā)酵方式最好，能夠得到11.60%vol的酒精度且適當?shù)目扇苄怨绦挝锟梢愿纳凭企w單薄現(xiàn)象，使其更加醇厚；蜂蜜藍莓酒的總酸、揮發(fā)酸含量最高且3種不同工藝之間表現(xiàn)出明顯差異，其中有機酸成分能夠為酒體帶來酸甜可口的典型風味；蜂蜜藍莓酒的色澤品質高于其他2種，是因為蜂蜜中的酚酸類物質能夠增強顏色的穩(wěn)定性；總多酚、總黃酮、花青素含量均高于其他2種，DPPH自由基清除率和鐵離子還原能力測定的抗氧化性能均顯著高于其他2種。通過相關性分析和主成分分析可知各個指標之間存在相關性，其中酚類物質和抗氧化性能參數(shù)密切相關，有效保證蜂蜜藍莓酒的營養(yǎng)物質。綜上，蜂蜜和藍莓組合發(fā)酵能夠提升藍莓酒中酚類物質的含量，提高其抗氧化性能，改善酒體色澤，且感官評分處于較高水平。本研究為今后推廣蜂蜜和藍莓的深加工提供新思路，為后續(xù)進一步優(yōu)化組合發(fā)酵工藝提供參考。