滌痰解毒方對急性有機磷農藥中毒大鼠阿托品化后血清炎癥因子水平和重要臟器超微結構的影響▲

劉 玲 邵 良 凌 峰 黃 磊 甘 露

(湖南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院急危重癥醫(yī)學科，湖南省株洲市 412000)

有機磷農藥中毒是我國農村最常見的農藥中毒類型，其病情兇險，死亡率高[1]。急性有機磷農藥中毒(acute organophosphorus pesticide poisoning，AOPP)患者經洗胃及靜脈推注阿托品等急救處理后仍然存在極大的生命危險，常需轉入重癥監(jiān)護室繼續(xù)治療。中醫(yī)無AOPP病名，但存在與AOPP臨床表現(xiàn)相似的中醫(yī)癥候群。在AOPP的急救治療達到阿托品化且可進行后續(xù)治療時，患者證型以痰濕內阻型最為常見，臨床表現(xiàn)為呼吸氣促、喉間少痰、汗出、腹脹、煩悶不安、頭暈目眩、舌苔白膩等癥狀，查體肺部聽診有濕啰音。對于此證型，中醫(yī)治療采用解毒祛痰利濕法進行治療，臨床實踐表明我科室自擬滌痰解毒方對改善此類患者的預后有較好效果。本研究從降低炎癥因子，保護肺、大腦等重要臟器功能的角度，探討滌痰解毒方治療中期AOPP(即AOPP阿托品化后)的作用機制，為推廣中醫(yī)藥在急危重癥中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SD大鼠18只，雄性，6周齡，180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司[許可證號：SCXK(湘)2019-0004)]，均給予常規(guī)飼料飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20 ℃～26 ℃，濕度為40%～70%。

1.2 藥物 用生理鹽水將77.5%的敵敵畏(山東大成生物化工有限公司，產品標準編號：GB 2548-2008)配置成濃度為0.65%敵敵畏溶液，按65 mg/kg的劑量造模。阿托品(安徽長江藥業(yè)有限公司，批準文號：國家準字H34021900)，解磷定(成都力思特制藥股份有限公司，CAS：19032801)，長托寧(成都力思特制藥股份有限公司，批準文號：國家準字H20020606)。滌痰解毒方的組方包括陳皮15 g、半夏10 g、茯苓20 g、膽南星10 g、竹茹10 g、川芎15 g、枳實10 g、厚樸15 g、瓜蔞15 g、黨參15 g、桔梗15 g、生甘草10 g；取5劑，由湖南中醫(yī)藥大學第三附屬醫(yī)院藥劑科制劑室制備，水提醇沉法制備濃縮液，調整至相當于含生藥材2 g/mL，將pH值調整至6.5～7.0，4 ℃保存。

1.3 主要試劑 蘇木素染液(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9610)，伊紅染色液、Scott藍化液(Solarbio公司，批號：G1100、G1865)，超凈高級封片膠(珠海貝索生物技術有限公司，批號：YZB)，大鼠白細胞介素(interleukin,IL)-1β檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒(江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：MM-0047R1、MM-0190R1)。

1.4 主要儀器 WD-2012B型全自動酶標儀(北京六一生物科技有限公司)，BD/BC-415DKEM型冷藏冷凍箱(美的集團股份有限公司)，DHP-9054型電熱恒溫培養(yǎng)箱(山東博科生物產業(yè)有限公司)，BL-420S型生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)，JEM-1230型透射電鏡(80KV，JEOL Ltd.)。

1.5 實驗方法

1.5.1 建立中期AOPP模型：采用隨機數(shù)字表法將18只大鼠分成6組，即正常組、模型組、西藥組、等劑量滌痰解毒方組、高劑量滌痰解毒方組、西藥+等劑量滌痰解毒方組，每組3只。根據(jù)預實驗的結果，除正常組外，其他組均按照65 mg/kg的劑量給予敵敵畏溶液灌胃(每100 g體重灌1 mL敵敵畏溶液)，然后觀察大鼠的癥狀，大鼠一般在10 min內均會出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為全身震顫、四肢僵直、流涎、針尖樣瞳孔，嚴重者會出現(xiàn)眼鼻出血癥狀。在老鼠四肢僵直無法挪步時，給予大鼠臀部肌內注射0.5 mg阿托品+3 mg解磷定解救，以后每隔15 min肌內注射0.5 mg阿托品+1.5 mg解磷定，直至阿托品化(瞳孔散大、心率加快等)[2]。

1.5.2 分組及給藥：模型制備成功后，西藥組大鼠給予0.1 mg/kg的長托寧臀部肌內注射，等劑量滌痰解毒方組、高劑量滌痰解毒方組大鼠分別按生藥14 g/kg、28 g/kg體重的劑量給予滌痰解毒方灌胃，西藥+等劑量滌痰解毒方組大鼠給予0.1 mg/kg的長托寧臀部肌內注射和14 g/kg滌痰解毒方灌胃。所有大鼠的中藥灌胃2次/d，長托寧肌內注射2次/d。模型組按照每100 g體重1 mL給予溫開水灌胃，2次/d。

1.5.3 觀察指標：治療24 h后處死所有大鼠，心臟采血10 mL，采用低溫離心機以3 000 r/min離心10 min，常規(guī)分離血清，于-70 ℃冰箱內凍存，采用ELISA檢測血清IL-1β、IL-6水平。采血后取大鼠大腦皮層組織、海馬組織及肺組織，進行固定、脫水、包埋、固化處理后在電鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用Graphpad Prism 7軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示，采用單因素方差分析進行組間比較，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血清IL-1β和IL-6水平的比較 與正常組相比，模型組血清IL-1β水平升高(P<0.05)；與模型組相比，西藥+等劑量滌痰解毒方組、等劑量滌痰解毒方組、高劑量滌痰解毒方組的血清IL-1β水平降低(均P<0.05)，但各藥物干預組之間比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。6組間血清IL-6水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 6組大鼠血清IL-1β和IL-6水平的比較(x±s，pg/mL)

2.2 各組大鼠肺組織、海馬、大腦皮質組織的超微結構 經治療后，各個藥物干預組大鼠的肺組織、海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)神經組織、腦皮質細胞損傷程度均較模型組有所改善。見圖1、圖2、圖3。

圖1 6組大鼠肺組織電鏡下的超微結構(×18 500)

圖2 6組大鼠海馬組織電鏡下的超微結構(×18 500)

圖3 6組大鼠腦皮質組織電鏡下的超微結構(×18 500)

3 討 論

AOPP病情兇險，病死率高，全球范圍內每年約有100萬人發(fā)生有機磷中毒，嚴重危及患者的生命安全[3-5]。AOPP常用的治療方案為阿托品與血液灌流聯(lián)合治療，及時、足量、重復給藥直至達到阿托品化，該方案可在一定程度上可緩解AOPP患者的癥狀[6-7]，但阿托品化后患者常出現(xiàn)頭痛眩暈、心煩失眠、多夢、胸悶納呆、倦怠無力等后遺癥。中期AOPP患者常表現(xiàn)為呼吸氣促、喉間少痰、汗出、腹脹、煩悶不安、頭暈目眩、舌苔白膩等癥狀，查體肺部聽診可有濕啰音，中醫(yī)辨證應為痰濕內阻，根據(jù)這些證型，可以采用祛痰利濕法治療，我科自擬滌痰解毒方治療中期AOPP，重在宣肺祛痰，改善患者的呼吸功能。滌痰解毒方的組方為陳皮15 g、半夏10 g、茯苓20 g、膽南星10 g、竹茹10 g、川芎15 g、枳實10 g、厚樸15 g、瓜蔞15 g、黨參15 g、桔梗15 g、生甘草10 g。其中陳皮、膽南星、半夏、瓜蔞清熱袪痰，枳實破痰利膈，竹茹清化熱痰解郁，桔梗宣肺化痰，厚樸行氣化痰消腹脹，川芎補益氣血、活血化瘀，人參、茯苓、甘草補心益脾、益氣固表。綜合全方，即祛痰宣肺，兼補氣血，驅邪固本，標本兼顧，結合西醫(yī)治療，可用于AOPP阿托品化后的治療，改善患者預后。

研究表明，當大量有機磷農藥進入機體后，機體免疫系統(tǒng)啟動應激反應，生成大量促炎癥細胞因子，導致患者發(fā)生全身炎癥反應綜合征，進一步發(fā)展至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[8-9]。另有研究顯示，AOPP激活單核巨噬細胞系統(tǒng)，使 IL-1β、IL-6等炎癥因子水平升高，引起瀑布效應，進而引起全身炎癥反應綜合征，甚至臟器功能衰竭[10]。所以，早期清除AOPP患者體內的炎癥細胞因子是阻止MODS發(fā)生的關鍵。本研究中，AOPP大鼠阿托品化后血清中炎癥因子IL-1β水平升高(P<0.05)，符合有機磷農藥中毒后炎癥因子爆發(fā)的病理反應；西藥+等劑量滌痰解毒方、等劑量滌痰解毒方、高劑量滌痰解毒方治療均能降低AOPP阿托品化后大鼠血清炎癥IL-1β水平(P<0.05)，說明滌痰解毒方單獨或聯(lián)合長托寧在緩解AOPP大鼠阿托品化后的炎癥反應均有較好效果。雖然各藥物干預組的血清IL-6水平也有所降低，但差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，考慮與樣本量小有關。

AOPP最常見且最為嚴重的并發(fā)癥為呼吸衰竭， 包括中樞性呼吸衰竭與周圍性呼吸衰竭[11]。其中，中樞性呼吸衰竭主要是由呼吸中樞被有機磷直接或間接抑制而導致，多發(fā)生在中毒24 h以內。有機磷農藥可引起嚴重的腦干損傷，病理表現(xiàn)主要為腦干水腫、出血，神經細胞凋亡、壞死，這些腦干呼吸中樞的損傷可直接引起呼吸衰竭。本研究的電鏡結果顯示，模型組中大鼠出現(xiàn)肺泡間隔水腫，肺泡間質中膠原沉積較多，肺泡腔有滲出，海馬的結構破壞嚴重、神經細胞核嚴重固縮、線粒體腫脹，且腦膠質細胞腫脹，核內染色質溶解，符合AOPP后肺部和中樞神經損傷的表現(xiàn)。滌痰解毒湯單獨或聯(lián)合長托寧均可減少大鼠肺組織膠原蛋白沉積，減輕肺組織纖維化，從而達到延緩呼吸衰竭進程效果；可阻滯神經細胞核固縮，減輕線粒體腫脹及血管周圍足突腫脹，防止腦干水腫、神經細胞凋亡，避免因腦干呼吸中樞損傷致呼吸衰竭。

綜上所述，滌痰解毒方可通過抑制炎癥因子釋放、延緩肺纖維化進程、減輕腦組織損傷，促進AOPP大鼠阿托品化后機體的恢復。