腸道病毒71型特異性核酸適配體的SELEX篩選

茅凌翔，鄒欣然，吳靜，顧佳奇

(江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院暨昆山市第一人民醫(yī)院檢驗科，江蘇昆山215300)

核酸適配體(aptamer)是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術(shù)(systemematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)篩選獲得的、長度為10～100 nt的、能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)的單鏈寡核苷酸(ssDNA或RNA)，可以通過其自身形成的三級結(jié)構(gòu)特異性的識別并結(jié)合靶分子。SELEX技術(shù)是利用人工合成的寡核苷酸文庫，進行核苷酸和靶分子的結(jié)合、分離、富集、擴增的多輪循環(huán)。這個寡核苷酸文庫包括1014～1017條隨機的ssDNA或RNA，每條寡核苷酸的中間部分是長度為30～100 nt、可與靶分子結(jié)合的隨機序列，兩端是18～30 nt的、用于PCR擴增的固定序列[1]。適配體由于具有類似于抗體的特性而被稱為“化學(xué)抗體”，可以很好地特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)靶物質(zhì)；同時，適配體還有一些優(yōu)于抗體的特性，比如免疫原性低、穩(wěn)定性高、靶分子范圍廣泛、易于制備與修飾等。因此，核酸適配體可以被廣泛用于臨床診斷[2]與治療[3]、食品安全檢測[4]和環(huán)境監(jiān)測[5-6]等眾多領(lǐng)域。

腸道病毒71型(enterovirus A71，EV-A71)屬于小RNA病毒科，腸道病毒屬A組，是丙類傳染病手足口病(HFMD)的主要病原體。在手足口病的多種病原體中，EV-A71和柯薩奇病毒A16(Coxsackie virus A16，CV-A16)是其最主要的病原體，兩者感染的比例分別占大約43.3%和24.8%[7]；由于EV-A71獨特的嗜神經(jīng)性，其相較其他病原體更容易感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)重癥手足口病，甚至危及患兒生命，嚴(yán)重危害嬰幼兒的健康[8]。因此，對EV-A71早期準(zhǔn)確的診斷顯得尤為重要。目前，針對EV-A71的臨床檢測方法主要為熒光定量PCR法，但由于對實驗儀器和實驗室的要求較高，難以在基層開展。為了今后進一步開發(fā)基于適配體的EV-A71檢測方法，本研究擬通過SELEX技術(shù)篩選對EV-A71衣殼蛋白VP1的適配體。

在本實驗部分中，我們將重組質(zhì)粒pET-32a-VP1導(dǎo)入大腸桿菌中成功表達了EV-A71病毒的VP1衣殼蛋白，考慮到CV-A16和EV-A71結(jié)構(gòu)蛋白存在相似性，為避免假陽性，盡可能地排除相似物質(zhì)帶來的干擾，我們選取EV-A71的VP1蛋白為正向選擇蛋白，以CV-A16的VP1為反向選擇蛋白，利用SELEX技術(shù)進行了EV-A71的適配體篩選，并成功篩選得到了3條EV-A71衣殼蛋白VP1的特異性適配體。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器普通PCR儀(德國Eppendorf公司)、電泳槽(美國Bio-Rad公司)、NanoDrop核酸蛋白檢測儀(美國賽默飛公司)、定量PCR擴增儀CFX96(美國Bio-Rad公司)。EV-A71的VP1蛋白表達質(zhì)粒pET-32a-VP1為本室自行構(gòu)建；分子生物學(xué)相關(guān)試劑購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；化學(xué)試劑購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。SELEX結(jié)合緩沖液主要成分：1*PBS，5 mM MgCl2，1%BSA，1 g/mL tRNA，0.02% tween-20，5 mM咪唑；SELEX洗滌緩沖液主要成分：1*PBS，5 mM MgCl2，0.02% tween-20。適配體篩選的單鏈DNA文庫序列為：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-N40-TGGACACG GTGGCTTAGT-3’(5’生物素修飾)，其中間為40個堿基的隨機序列，兩端為固定序列。以該文庫兩端的固定序列作為SELEX篩選過程中的上下游引物，擴增上游引物為：5’-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3’(5’磷酸修飾)；擴增下游引物為：5’-ACTAAGCCACCGTGTCCA-3’(5’生物素修飾)。DNA合成和測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。蛋白復(fù)性工作委托德泰生物科技(南京)有限公司進行。

1.2 方法

1.2.1 EV-A71衣殼蛋白VP1的表達與純化將構(gòu)建好的EV-A71衣殼蛋白VP1表達質(zhì)粒pET-32a-VP1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌落PCR選出轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆菌。取轉(zhuǎn)化成功的單個菌落接種LB液體培養(yǎng)基，利用不同濃度的誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactoside，IPTG)、按照不同的誘導(dǎo)時間、培養(yǎng)溫度分別誘導(dǎo)目標(biāo)蛋白的表達。選取最佳誘導(dǎo)劑濃度，以最佳誘導(dǎo)時間、溫度培養(yǎng)菌液，提取總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測目標(biāo)蛋白的表達情況。

以最優(yōu)誘導(dǎo)條件擴大培養(yǎng)陽性菌液，培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃ 5000 rpm離心菌液5 min，PBS洗滌后用LE緩沖液重懸菌體沉淀，利用超聲細(xì)胞破碎儀冰浴超聲裂解菌體40 min(超聲3 s，停6 s)；4 ℃ 12 000 rpm離心15 min，分別收集上清和沉淀，處理后用鎳離子親和層析柱(Ni-NTA)進行VP1蛋白的純化，利用SDS-PAGE電泳檢測純化處理后各個組分中的目標(biāo)蛋白。

1.2.2 隨機ssDNA文庫的構(gòu)建及第1輪SELEX篩選將ssDNA文庫進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：10×Buffer 25 L，2 mM的dA、dG、dC各10 L，10 mM的5-IAA-dUTP 2 L，100 M的引物24 L，5 U/L的KOD DNA聚合酶10 L，20 M隨機文庫100 L，加水至250 L。擴增程序：95 ℃ 60 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s。產(chǎn)物加入親和素標(biāo)記的瓊脂糖微球室溫孵育10 min，洗去未結(jié)合序列。加入150 mM的氫氧化鈉室溫孵育5 min，吸取上清，加入300 mM的鹽酸進行中和，得到空磁珠富集的DNA文庫。

將上述文庫95 ℃變性5 min、冰浴10 min后，加入結(jié)合緩沖液和體外表達的EV-A71衣殼蛋白VP1 50 pmol，室溫結(jié)合30 min。加入帶His標(biāo)簽的磁珠50 L，室溫結(jié)合30 min。磁力架分離，充分洗滌后棄上清。加入500 mM咪唑50 L解離出能夠結(jié)合EV-A71衣殼蛋白VP1的DNA。利用梯度PCR，設(shè)置五個不同的循環(huán)數(shù)：6、8、10、12、14個循環(huán)擴增，選取最佳擴增循環(huán)數(shù)，對DNA庫進行PCR擴增。純化柱回收PCR產(chǎn)物，NanoDrop微量紫外-可見分光光度計測定產(chǎn)物的核酸濃度。

1.2.3 第2～9輪SELEX取第1輪篩選得到的dsDNA產(chǎn)物，用Lambda核酸外切酶消化，酶切產(chǎn)物用純化回收后作為下一輪篩選的次級文庫，繼續(xù)進行下一輪的SELEX篩選。為了獲得高特異性的適配體，自第3輪開始加入與靶蛋白的結(jié)構(gòu)最為相似的蛋白：CV-A16病毒的衣殼蛋白VP1進行反篩，以去除與CV-A16衣殼蛋白VP1結(jié)合的DNA。反向篩選的步驟與正向篩選基本一致，但在靶分子與寡核苷酸結(jié)合后，需要收集的是不與反篩蛋白結(jié)合的核酸，將其作為模板進行后續(xù)PCR擴增。每輪PCR對擴增條件，如退火溫度和循環(huán)輪數(shù)進行篩選優(yōu)化。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測和硅膠層析柱純化。

1.2.4 TA克隆與測序?qū)⒑Y選得到的最終PCR產(chǎn)物純化后，16 ℃ 3 h連接至pUC-T質(zhì)粒載體，將連接成功的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21中，冰上放置30 min。42 ℃熱激60 s后，再在冰上放置3 min。加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)60 min。離心濃縮菌液后，均勻涂布于含有Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基，正面放置待其完全吸收后，37 ℃孵箱倒置培養(yǎng)過夜。隨機挑選單個菌落，分別轉(zhuǎn)種于1 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)8 h。菌液直接PCR法鑒定陽性克隆，電泳確認(rèn)質(zhì)粒中插入片段的大小，挑選片段大小為232 bp左右的陽性克隆，送生物公司測序。測序獲得的序列用Vector NTI進行比對分析。

2 結(jié) 果

2.1 EV-A71 VP1蛋白的原核表達純化將PCR鑒定及測序正確的pET-32a-VP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)后，以優(yōu)化條件(IPTG濃度1 mmol/L、誘導(dǎo)時間6 h、誘導(dǎo)溫度30 ℃)進行IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，SDS-PAGE電泳分別檢測裂解菌體沉淀和上清中VP1蛋白的表達情況。電泳結(jié)果(圖1)表明，重組蛋白表達產(chǎn)物的沉淀在55 Kd處有明顯的蛋白條帶，而在上清中無相應(yīng)的蛋白條帶，提示目的蛋白存在于包涵體中。包涵體蛋白由生物公司進行復(fù)性后，用于后續(xù)的SELEX篩選試驗。

圖1 SDS-PAGE檢測原核表達蛋白的沉淀和上清

2.2 適配體的第1輪SELEX篩選將DNA文庫與偶聯(lián)靶蛋白EV-A71 VP1的免疫磁珠結(jié)合，再通過磁性分離去除未結(jié)合靶蛋白的核酸；隨后將結(jié)合的核酸片段從免疫磁珠上解離，對其進行不同循環(huán)數(shù)的PCR擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果(圖2)顯示，PCR擴增產(chǎn)物條帶單一、無明顯的非特異性擴增條帶，且擴增循環(huán)數(shù)為10的PCR產(chǎn)物條帶最亮，而其他循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物條帶略為彌散。因此，選擇最佳循環(huán)數(shù)10進行大量PCR擴增，將PCR擴增產(chǎn)物作為下一輪SELEX篩選的次級文庫。

注：1～5泳道分別為循環(huán)數(shù)6、8、10、12、14的擴增產(chǎn)物

2.3 適配體的第2～9輪SELEX隨著SELEX篩選輪次的增加，與靶分子結(jié)合的寡核苷酸會不斷富集，次級文庫的序列多樣性不斷降低，正篩組的核酸信號明顯大于反篩組的核酸信號。結(jié)果(圖3)顯示，SELEX篩選進行到第8輪時，結(jié)合正篩蛋白的信號與反篩組有60倍左右的差異，而在SELEX第9輪正向篩選的富集信號不再增加。因此，選擇SELEX第8輪產(chǎn)物進行下一步測序篩選。

注：左圖為SELEX篩選第8輪的電泳結(jié)果，右圖為SELEX篩選第9輪的電泳。Marker左側(cè)為結(jié)合反篩蛋白CV-16蛋白VP1的DNA，右側(cè)為結(jié)合正篩蛋白EV-A71蛋白VP1的DNA。1～5泳道分別為循環(huán)數(shù)6、8、10、12、14的擴增產(chǎn)物

2.4 適配體篩選結(jié)果將第8輪篩選得到的ssDNA文庫連接質(zhì)粒，導(dǎo)入細(xì)菌后鑒定出陽性克隆進行測序，共獲得47條序列。將這47條序列用分子生物學(xué)軟件Vector NTI進行分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)11組重復(fù)序列；挑選出其中重復(fù)性高且檢測信號最強的序列共3條，將其作為篩選出的候選適配體。3條適配體的序列為V7、V11、V21，V7序列為ACTAAGCCACCGTGTCCAUCAAUGGUGUGUGCA UUCGUGUGUUGUGU-UGUUU GUUGUUUGCUGCGUCACUCUGGAU，V11序列為ACTAAGCCACCGTGTCCA CCCUCGCCGAG-UUUUCGUAAC UAUAUCUUGUGGUUCCUAUUGCU-GCGUCACUCUGGAU，V21序列為ACTA AGCCA-CCGTGTCCAUUCGAUUCGAUCUAAUUUGGUUCUU-UCCUCACUUUUCAGUGCUGCGUCACUCUGGAU，這三條序列對于反篩蛋白VP1(CV-A16)以及牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合能力較弱，而與VP1(EV-A71)都有較好的結(jié)合，親和力達到nM級別，達到了篩選成功的標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 SELEX最終篩選序列的序列分析

3 討 論

現(xiàn)階段的EV-A71實驗室檢測方案基本以實時熒光定量RT-PCR(QRT-PCR)方法為主。針對EV-A71檢測方法的相關(guān)研究包括：TaqMan-LNA實時熒光定量PCR方法[9]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法[10]等，雖然有的方法降低了對實驗設(shè)備要求，可用恒溫設(shè)備取代熒光定量PCR儀，但是實驗流程仍然需要先提取樣本核酸，樣本的檢測仍然相對繁瑣復(fù)雜。阮美生等建立了熱處理標(biāo)本后直接RT-LAMP方法檢測 EV-A71的方法[11]，雖然省略了RNA提取步驟，但檢測的靈敏度會有所降低。XIONG等[12]利用EV-A71多克隆抗體偶聯(lián)磁珠捕獲病毒后，利用酶聯(lián)二抗改變底物中膠體金的顏色進行目視檢測，該方法雖然簡便，但由于多克隆抗體造價較貴,成分復(fù)雜，且檢測靈敏度較低，容易漏檢。因此，探尋精確、簡便、快速、經(jīng)濟的EV-A71檢測方法具有重要的意義。

核酸適配體是一類通過SELEX篩選獲得的，能以較高的親和力與各類靶物質(zhì)特異性結(jié)合的小分子單鏈DNA或RNA。核酸適配體可通過空間構(gòu)象變化和構(gòu)型互補，實現(xiàn)對靶分子的特異性識別與結(jié)合，并且其結(jié)合的靶標(biāo)物質(zhì)種類不受限制，包括蛋白質(zhì)、小分子物質(zhì)、細(xì)菌毒素、金屬離子、寄生蟲，甚至是完整的細(xì)胞、病毒等。適配體可以作為捕獲探針，結(jié)合各種生物檢測技術(shù)，應(yīng)用于各種臨床病原體的檢測。目前，已有學(xué)者成功篩選獲得多種病原體的核酸適配體[13]，并且在此基礎(chǔ)上開發(fā)了針對各種病原體的檢測方法[14]。其中，細(xì)菌性病原包括痢疾志賀氏菌[15]、金黃色葡萄球菌[16-17]、費舍爾弧菌[18]等；病毒性病原包括人皰疹病毒5型[19-20]、流感病毒H1N1[20]、禽流感病毒[21]等。然而，針對EV-A71的核酸適配體序列迄今未見其他報道。今后，在成功篩選EV-A71核酸適配體的基礎(chǔ)上，可結(jié)合熒光、比色、電化學(xué)發(fā)光、光電化學(xué)、表面增強拉曼散射等生物傳感技術(shù)，構(gòu)建EV-A71的適配體生物傳感器。其中，比色法由于操作相對簡單且可以肉眼觀察，可用于現(xiàn)場的快速檢測。電化學(xué)發(fā)光法可以進一步開發(fā)，應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光全自動檢測儀器，在臨床上實現(xiàn)自動化、批量化的檢測。

核酸適配體具有特異性強、親和性高、合成成本低、易標(biāo)記及化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于各類檢測方法。核酸適配體的篩選可以通過SELEX技術(shù)在體外甚至在體內(nèi)以多種方式進行。然而，與體內(nèi)抗體生成相比，SELEX的成功率普遍較低，需要不斷優(yōu)化篩選的每個環(huán)節(jié)，并做好質(zhì)量控制工作[22]。本研究主要詳細(xì)描述了SELEX技術(shù)的體外篩選步驟，可為相關(guān)病原體SELEX篩選提供參考。本研究篩選得到的EV-A71核酸適配體，可為進一步研究和開發(fā)EV-A71的分析檢測方法提供實驗基礎(chǔ)。