環(huán)狀RNA hsa_circ_0032664抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移

周律，史俊豪，蒲俊霞，單杰，鄧益斌

(1.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣西百色 533000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西百色 533000；3.廣西高校桂西高發(fā)病臨床分子診斷研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西百色 533000;4.百色市高發(fā)病臨床分子診斷與研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西百色 533000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)生存期短，致死率高，早期診斷困難，治療效果不佳，是一種高侵襲性和高復(fù)發(fā)性的惡性腫瘤[1]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)研究表明，2020年全世界發(fā)病人數(shù)最多的10種癌癥中肝癌列第六位，死亡人數(shù)列第三位，中國肝癌發(fā)病人數(shù)超過世界45%，肝癌死亡人數(shù)占世界肝癌死亡人數(shù)的47%以上，中國肝癌疾病負(fù)擔(dān)非常重[2]。肝癌發(fā)生隱匿、迅速，確診時患者往往錯過最佳治療時間，死亡率高[3]。因此，尋找早期診斷方法和有效治療方法迫在眉睫。

環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是環(huán)狀結(jié)構(gòu)的明星分子，它是真核細(xì)胞中穩(wěn)定且普遍存在的RNA，大多數(shù)由前體mRNA外顯子反向剪接產(chǎn)生，與線狀RNA相比，具有更高的穩(wěn)定性、表達(dá)豐度和保守性[4-5]。過去認(rèn)為circRNA是錯誤剪切的產(chǎn)物，隨著高通量測序的發(fā)展，大量circRNA被研究發(fā)現(xiàn)，而且circRNAs可以積累到超過mRNAs的水平并顯示出組織特異性和發(fā)育特異性的特征[6-7]。circRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用，ZANG等人[8]研究發(fā)現(xiàn)circEIF4G3通過調(diào)節(jié)δ-catenin穩(wěn)定性和miR-4449/SIK1軸，在胃癌中發(fā)揮抑制作用。有文獻(xiàn)報道circVAPA通過調(diào)節(jié)miR-377-3p和miR-494-3p/IGF1R/AKT軸促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展[9]。circ-EIF6通過編碼肽段EIF6-224aa，促進(jìn)TNBC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[10]。由于體內(nèi)circRNA數(shù)量龐大，作用途徑又復(fù)雜多樣，調(diào)控肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不十分明確，所以深入研究circRNA調(diào)控肝癌的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)肝癌早期診斷分子標(biāo)志物和治療新靶點(diǎn)，具有重要研究價值。我們通過生物信息學(xué)分析和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0032664在肝癌中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而從circBase(http://www.circbase.org/)中發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0032664來源于線性RNA NEK9 chr14:75563802-75590926。目前尚未有關(guān)于hsa_circ_0032664在疾病中生物學(xué)功能的報道，本研究探討hsa_circ_0032664在肝癌中的差異表達(dá)和生物學(xué)功能，為肝癌早期診斷和治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

1.1.1 生物信息學(xué)分析從 GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取兩個與肝癌相關(guān)的 circRNA數(shù)據(jù)集：GSE164803(含有6個肝癌組織和 6個癌旁組織)和GSE97332(含有7個肝癌組織和7個癌旁組織)。

1.1.2 組織來源31對肝癌及其配對的癌旁組織標(biāo)本為2020年12月至2022年6月在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科手術(shù)切取獲得?；颊咝g(shù)前未接受任何治療并且簽署知情同意書，所有標(biāo)本均經(jīng)病理科診斷為原發(fā)性肝癌。標(biāo)本切取后立刻放入液氮凍存并移至-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：YYFY-LL-2022-13)。

1.2 細(xì)胞正常肝細(xì)胞系LO2，肝癌細(xì)胞系Huh7、HepG2、MHCC97H、Hep3B購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.3 主要試劑胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、青/鏈霉素、胰酶(北京Solarbio有限公司)、SYBR Master Mix試劑盒(翌圣生物科技有限公司)、Trizol、qRT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Lipofectamine 3000(美國賽默飛公司)、Matrigel基質(zhì)膠(美國Corning公司)、CCK8試劑(美國MCE生物科技公司)。

1.4 方法

1.4.1 生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)的circRNA利用limma R軟件包對GSE164803和GSE97332數(shù)據(jù)集做差異分析，運(yùn)用adj.P.Val<0.05且∣LogFC(fold change)∣>2.0的篩選標(biāo)準(zhǔn)來篩選差異 circRNA，根據(jù)adj.P.Val和LogFC繪制火山圖(volcano plot)。取GSE164803和GSE97332數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)的circRNA繪制韋恩圖。用Pheatmap R包對GSE164803和GSE97332兩個數(shù)據(jù)集取交集后的差異circRNA進(jìn)行聚類分析，并繪制熱圖(heat map)。

1.4.2 qRT-PCR用Trizol提取細(xì)胞和組織RNA，檢測RNA濃度和純度。使用賽默飛逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，用SYBR試劑進(jìn)行qRT-PCR，qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)，GAPDH為內(nèi)參。hsa_circ_0032664上游引物：5’-TCATCGTTGGATGACTCACTGG-3’，下游引物：5’-GGCATCACGACGTTCCTTCT-3’。hsa_circ_0032664引物設(shè)計(jì)采用背靠背設(shè)計(jì)原則，引物由廣州生工生物科技有限公司合成，引物特異性經(jīng)circPrimer 2.0軟件和NCBI的Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)驗(yàn)證。GAPDH上游引物：5’-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3’，下游引物：5’-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3’。結(jié)果使用2-△△Ct法來分析[△Ct=Ct(hsa_circ_0032664)-Ct(GAPDH)]。

1.4.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)時使用含有10%的胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于5%CO2，37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時加入適量的opti-MEM培養(yǎng)基饑餓2小時后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine 3000。hsa_circ_0032664的干擾片段(si-circ)及陰性對照(NC)為漢恒生物科技(上海)有限公司設(shè)計(jì)。hsa_circ_0032664的干擾片段(si-circ)的正義鏈：5’-CAUCGUUGGAUGACUCACUTT-3’，反義鏈為：5’-AGUGAGUCAUCCAACGAUGTT-3’。陰性對照(NC)的正義鏈為：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反義鏈為：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4.4 CCK8實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時后，消化離心后棄上清，吸取適量的完全培養(yǎng)基混勻，使細(xì)胞濃度約為3×104個/mL，往4個96孔板加入100 μL含有3000個細(xì)胞的細(xì)胞懸液，每組5個復(fù)孔。6小時后取出一個96孔板，每孔加入10 μL的CCK8試劑，放入培養(yǎng)箱孵育2 h，用VICTOR Nivo多功能酶標(biāo)儀450 nm波長檢測細(xì)胞OD值，接下來在24 h、48 h、72 h按上述方法檢測細(xì)胞OD值，并記錄數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)在六孔板外表底部畫三條等距的黑色直線做標(biāo)記，往六孔板種入適量的細(xì)胞，使培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞融合度為95%左右，用100 μL無菌槍頭在細(xì)胞中劃痕，用PBS小心清洗后加入2 mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在顯微鏡下測0 h的細(xì)胞劃痕寬度。培養(yǎng)24 h后，在顯微鏡下測24 h的細(xì)胞劃痕寬度，并統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞24 h遷移率。

1.4.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，消化離心后棄上清，用PBS洗3遍，加入適量的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻，使細(xì)胞稀釋到濃度約為2×105個/mL。在Transwell小室底部加入650 μL完全培養(yǎng)基。用預(yù)冷的100 μL槍頭吸取60 μL Matrigel基質(zhì)膠與預(yù)冷的540 μL的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合均勻，吸取100 μL混合液到Transwell小室，將Transwell小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱1 h。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有兩組，為 si-circ和NC兩組，每組設(shè)3個復(fù)孔。吸200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室后，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)基小心吸出后沿著小室內(nèi)壁加入PBS緩沖液洗兩遍，吸干后沿小室內(nèi)壁小心加入100 μL多聚甲醛固定15 min，再沿壁小心加入結(jié)晶紫染色15 min，最后加PBS洗3遍，在顯微鏡下觀察，并統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 生物信息學(xué)篩選差異的circRNA為了篩選在肝癌中差異表達(dá)的circRNA，我們從 GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取兩個數(shù)據(jù)集：GSE164803和GSE97332，利用limma R軟件包對數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析。從GSE164803(含有6個肝癌組織和6個癌旁組織)得到262個差異的circRNA，其中144個是上調(diào)，118個是下調(diào)(圖1A為GSE164803火山圖)。從GSE97332(包含7個肝癌組織和7個癌旁組織)得到149個差異表達(dá)的circRNA，上調(diào)的有91個，下調(diào)的有58個(圖1B為GSE97332火山圖)。GSE164803和GSE97332兩個數(shù)據(jù)集取交集得到26個circRNA(圖1C為韋恩圖)。26個circRNA中有6個下調(diào)，20個上調(diào)(圖1D、E分別為GSE164803和GSE97332熱圖)。6個下調(diào)的circRNA中hsa_circ_0007874、hsa_circ_0032683、hsa_circ_0032664下調(diào)最顯著。hsa_circ_0032664在肝癌中生物學(xué)功能尚不清楚，因此我們選擇hsa_circ_0032664做進(jìn)一步的研究。

注：A為GSE164803數(shù)據(jù)集的火山圖；B為GSE97332數(shù)據(jù)集的火山圖；C為韋恩圖；D為GSE164803數(shù)據(jù)集的熱圖；E為GSE97332數(shù)據(jù)集的熱圖?；鹕綀D中紅色表示高表達(dá)，綠色表示低表達(dá)，黑色表示差異不顯著或變化倍數(shù)小的circRNA；韋恩圖中藍(lán)色部分為GSE164803中差異circRNA，黃色部分為GSE97332中差異 circRNA；熱圖中紅色代表表達(dá)上調(diào)，綠色代表表達(dá)下調(diào)

2.2 hsa_circ_0032664在肝癌組織和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)我們在右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集了31對肝癌組織及其配對的癌旁組織。通過qRT-PCR檢測hsa_circ_0032664在肝癌組織中的表達(dá)量，結(jié)果顯示22例上調(diào)，9例下調(diào)。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析，hsa_circ_0032664在肝癌組織中的表達(dá)量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A)。

我們通過qRT-PCR檢測肝癌細(xì)胞系HepG2、MHCC97H、Huh7、Hep3B和正常肝細(xì)胞株LO2中hsa_circ_0032664的表達(dá)量，結(jié)果顯示，與正常肝細(xì)胞株LO2相比，hsa_circ_0032664在肝癌細(xì)胞系HepG2、MHCC97H、Huh7、Hep3B中表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)。

注：A為hsa_circ_0032664在31對肝癌及其配對的癌旁組織中表達(dá)下調(diào)；B為與正常肝細(xì)胞系LO2相比，hsa_circ_0032664在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)

2.3 干擾hsa_circ_0032664對肝癌細(xì)胞(HepG2、MHCC97H)增殖、侵襲、遷移的影響hsa_circ_0032664可以抑制HepG2、MHCC97H細(xì)胞的增殖，我們用干擾片段干擾hsa_circ_0032664的表達(dá)，干擾片段敲低效率見圖3A。通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞0 d(6 h)、1 d、2 d、3 d的OD值。與陰性對照組(NC)相比，敲低組(si-circ)的OD值顯著增高(P<0.01)。因此，敲低組(si-circ)細(xì)胞的活性比NC組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。hsa_circ_0032664可以抑制HepG2、MHCC97H細(xì)胞的遷移，我們用干擾片段敲低hsa_circ_0032664的表達(dá)，通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞24 h的遷移率，與陰性對照組(NC)相比，敲低組(si-circ)遷移率顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3C)。hsa_circ_0032664可以抑制HepG2、MHCC97H細(xì)胞的侵襲，通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測肝癌細(xì)胞(HepG2、MHCC97H)的侵襲，低倍鏡下隨機(jī)尋找5個視野，發(fā)現(xiàn)與陰性對照組(NC)相比，敲低組(si-circ)侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.01)，因此敲低組(si-circ)細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖3D)。

注：A為qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hsa_circ_0032664干擾片段siRNA在肝癌細(xì)胞中的敲低效率；B為CCK8實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證干擾hsa_circ_0032664對肝癌細(xì)胞增殖能力的影響；C為劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證干擾hsa_circ_0032664對肝癌細(xì)胞遷移能力的影響；D為Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證干擾hsa_circ_0032664對肝癌細(xì)胞侵襲能力的影響

3 討 論

肝細(xì)胞癌(HCC)是世界上最常發(fā)生的惡性疾病之一，風(fēng)險因素有肝硬化、酒精中毒、乙肝病毒感染、肝纖維化等[11-12]。很多肝細(xì)胞癌患者被確診時已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去了治療的意義。因此，要做到早診斷是一件緊急的、具有挑戰(zhàn)性的難題，尋找早期診斷標(biāo)志物迫在眉睫。YANG等人[13]研究發(fā)現(xiàn)circLIFR競爭性吸附miR-624-5p和抑制GSK-3β-連環(huán)蛋白信號通路抑制肝癌進(jìn)展。DU等[14]的研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)m6A介導(dǎo)的circMDK上調(diào)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生。有研究報道circRPN2抑制肝細(xì)胞癌的有氧糖酵解和轉(zhuǎn)移[15]。然而人體內(nèi)存在大量的circRNAs，它們在肝癌中的生物學(xué)功能在很大程度上是未知的。

本研究我們通過GEO數(shù)據(jù)庫獲取GSE164803和GSE97332兩個數(shù)據(jù)集并利用limma R軟件包進(jìn)行差異分析，發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0032664在兩個數(shù)據(jù)庫中下調(diào)顯著。我們從circbase數(shù)據(jù)庫得知hsa_circ_0032664來源于線性RNA NEK9。有研究表明hsa_circ_0032664在橋本氏甲狀腺炎患者血清外泌體中差異表達(dá)[16]。有文獻(xiàn)報道hsa_circ_0032664在尿毒癥患者血漿及外周血單個核細(xì)胞中存在差異表達(dá)[17]。然而尚未有研究表明hsa_circ_0032664在癌癥中的生物學(xué)功能。我們從右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收集31對肝癌組織及其配對的癌旁組織，通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0032664在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，接著我們通過qRT-PCR驗(yàn)證hsa_circ_0032664在肝癌細(xì)胞系的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與正常肝細(xì)胞系LO2相比，hsa_circ_0032664在肝癌細(xì)胞系HepG2、MHCC97H、Huh7、Hep3B均表達(dá)下調(diào)，表明hsa_circ_0032664可能在肝癌的增殖、侵襲、遷移等惡性行為發(fā)揮重要的調(diào)控作用。我們用干擾片段siRNA干擾HepG2和MHCC97H中hsa_circ_0032664的表達(dá)量后，發(fā)現(xiàn)HepG2和MHCC97H的增殖、侵襲、遷移能力增強(qiáng)，所以通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證hsa_circ_0032664在肝癌中起到抑制作用，hsa_circ_0032664可望成為早期肝癌診斷和治療的生物標(biāo)志物。

綜上所述，hsa_circ_0032664在肝癌組織和細(xì)胞系中低表達(dá)，且可以抑制肝癌細(xì)胞的生長、侵襲和遷移，為早期肝癌診斷提供新的思路。