豬鏈球菌2型HNB-LAMP檢測方法的建立

席小燕，陳家享，梁嘉雯，林 蝶，伍嘉慧，段昌平，陳家苑， 彭 凌

（1.韶關(guān)學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512026；2.韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院，廣東 韶關(guān) 512005）

豬鏈球菌（Streptococcus suis）是一種重要的人畜共患病病原體，可引起豬和人的腦膜炎、敗血癥、肺炎等嚴(yán)重的臨床疾?。?-2］. 豬鏈球菌病成了養(yǎng)豬業(yè)及豬肉行業(yè)中的一種職業(yè)病，在東南亞國家，普通人群面臨的風(fēng)險主要是由于與動物的密切接觸或食用生豬肉產(chǎn)品［3-5］. 到目前為止，已鑒定出33個豬鏈球菌血清型（1~31、1/2和33）［6-8］，最常見的是從全世界豬和人的臨床病例中分離出來血清型2型［9-11］.

快速準(zhǔn)確檢測豬鏈球菌2型對于這種感染的早期診斷和治療非常重要，但常用的細(xì)菌培養(yǎng)方法分離和鑒定耗時；基于PCR的檢測方法表現(xiàn)出對豬鏈球菌的高度敏感和特異，但需要昂貴的儀器、復(fù)雜的技術(shù)和煩瑣的操作，不適合現(xiàn)場檢測和基層推廣［12-14］. 因此，迫切需要建立一種簡便、快速、經(jīng)濟(jì)的檢測豬鏈球菌2型的方法. 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）法是Notomi等人開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法［15］，不需要進(jìn)行煩瑣的變性、延伸、退火等溫度變化的過程，只需恒溫操作，無需借助PCR儀，擴(kuò)增產(chǎn)物可以經(jīng)過直接觀察沉淀量或者加入染料觀察顏色改變等進(jìn)行檢測，很適合基層使用.

筆者選擇2型豬鏈球菌cps2J基因序列設(shè)計篩選LAMP引物組，通過體系優(yōu)化建立檢測方法，同時考慮到LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測方法多樣且檢測的結(jié)果可能受到各種因素的影響［16］，在豬鏈球菌2型LAMP方法建立中比較了肉眼觀察沉淀、瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ以及羥基萘酚藍(lán)（HNB）等檢測方法的敏感性，建立了豬鏈球菌2型“量身定制”的快速LAMP檢測方法.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用菌株均為實驗室保存. 12株經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)血清和血清型特異PCR鑒定的豬鏈球菌血清型1、2、7和9型（2型9株，其它血清型各1株）. 另有5株陰性對照菌株：豬丹毒絲菌、副豬嗜血桿菌、豬鼻支原體、胸膜肺炎放線桿菌、肺炎鏈球菌. Taq PCR Master Mix、dNTPs、細(xì)菌基因組DNA快速抽提試劑盒（B518225）、8 U Bst DNA聚合酶等均購自生工生物工程（上海）股份有限公司.

1.2 引物的設(shè)計和合成

根據(jù)GenBank公布的豬鏈球菌2型的cps2J基因的保守序列，采用在線引物設(shè)計 軟 件（https：//LAMP.neb.com）設(shè) 計LAMP引 物，另外，根據(jù)cps2J基因的保守序列設(shè)計特異的PCR檢測引物，序列見表1，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成.

表1 引物序列設(shè)計

1.3 DNA提取

過夜培養(yǎng)的菌液取1 mL，離心收集菌體按照“1.1”試劑盒的說明書提取各樣品基因組DNA.

1.4 LAMP 反應(yīng)體系條件的優(yōu)化

25 μL初 始 反 應(yīng) 體 系：10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL，100 mmol·L-1的MgSO41.5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 3.5 μL，40 μmol·L-1內(nèi)引物（FIP/ BIP）各1 μL，5 μmol·L-1外引物（F3/B3）各1 μL（引物濃度比8∶1），20 μmol·L-1環(huán)引物（LF/LB）1 μL，8 U Bst DNA 聚合酶1 μL，3 mmol·L-1的HNB 1 μL，剩余用水補(bǔ)足，混勻. 65 ℃恒溫反應(yīng)1 h，80 ℃滅活10 min. 同時以無核酸水作為陰性對照. 在此反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上優(yōu)化LAMP反應(yīng)條件，使用從豬鏈球菌2型菌株提取的DNA作為模板，對孵育溫度（60~65 ℃）、反應(yīng)時間（20~80 min）、鎂離子濃度（2~10 mmol·L-1）、dNTPs 濃度（1~5 mmol·L-1）和引物濃度比（FIP/BIP∶F3/B3）等條件進(jìn)行優(yōu)化.

1.5 LAMP產(chǎn)物分析

（1）肉眼觀察沉淀. LAMP反應(yīng)結(jié)束后，5 000 r·min-1離心數(shù)秒后，若出現(xiàn)白色沉淀則被認(rèn)為是陽性.

（2）瓊脂糖凝膠電泳. LAMP反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶，如果樣本顯示出典型的階梯狀帶型，則被認(rèn)為是陽性.

（3）SYBR Green Ⅰ檢測. LAMP反應(yīng)后，加入1 μL SYBR Green Ⅰ，如果溶液變成綠色，則為陽性；如果溶液變成橙色，則為陰性［16］.

（4）HNB檢測. HNB被預(yù)先加入LAMP系統(tǒng)（終濃度120 μmol·L-1），觀測顏色，天藍(lán)色為陽性，紫色為陰性［16］.

1.6 LAMP敏感性

豬鏈球菌2型菌株的培養(yǎng)菌液經(jīng)計數(shù)后進(jìn)行10倍梯度稀釋至10-7（原始濃度為8×106CFU·μL-1），稀釋菌液煮沸10 min后各取1 μL上清作為模板按優(yōu)化體系和條件進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，分別采用肉眼觀察沉淀、瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ 和HNB等對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，比較它們的檢測敏感性，同時以無核酸水作為陰性對照. 為評估LAMP的敏感性，同時采用普通PCR檢測上述梯度的模板（即用普通PCR檢測法來進(jìn)行比較），PCR反應(yīng)體系25 μL：Taq PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol·L-1的引物各1 μL；擴(kuò)增程序：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；54 ℃，30 s；72 ℃，60 s，循環(huán)30次；最后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.7 LAMP特異性

采用優(yōu)化好的LAMP體系，對12株豬鏈球菌和5株陰性對照菌株的基因組DNA，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗證該方法鑒定出豬鏈球2型菌株的特異性.

1.8 臨床樣本檢測

采集豬的組織作為檢測樣品. 樣品預(yù)處理：剪成小塊后加入少量PBS緩沖液經(jīng)研缽研碎，加PBS稀釋，煮沸 10 min，靜置或離心后，上清液可以作為檢測模板.

2 結(jié)果

2.1 LAMP最優(yōu)反應(yīng)體系條件

在不同 條件下 進(jìn)行了 實 驗，最 終確 定 最優(yōu) 反 應(yīng)體 系 條件為：100 mmol·L-1的MgSO42.5 μL， 10 mmol·L-1dNTPs 4.0 μL，10×Thermo-Pol buffer 2.5 μL，30 μmol·L-1內(nèi)引物（FIP/BIP）各1 μL， 5 μmol·L-1外引物（F3/B3）各1 μL（引物濃度比6∶1），20 μmol·L-1環(huán)引物（LF/LB）1 μL，8 U Bst DNA 聚合酶 1 μL，3 mmol·L-1的HNB 1 μL，剩余用水補(bǔ)足，混勻. 61 ℃恒溫反應(yīng)50 min，80 ℃滅活10 min.

2.2 4種LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物檢測方法的敏感性

各稀釋度模板經(jīng)LAMP擴(kuò)增后，各管經(jīng)離心，在100~10-5稀釋度可見明顯沉淀，在10-6~10-7稀釋度未見肉眼可以沉淀. 各稀釋度LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在100~10-6稀釋度均可以看到典型的梯度條帶，在10-7稀釋度未見條帶. LAMP擴(kuò)增完成后加入SYBR Green Ⅰ顯色，在100~10-6稀釋度顯出綠色，在10-7稀釋度顯橙色. 在HNB檢測中，預(yù)先在各稀釋度檢測管加入3 mmol·L-1HNB 1 μL，反應(yīng)結(jié)束后在100~10-6稀釋度顯天藍(lán)色，在10-7稀釋度顯紫色（圖1 A~D）. 由此可見采用瓊脂糖凝膠電泳、SYBR Green Ⅰ、HNB對產(chǎn)物進(jìn)行檢測的敏感性相當(dāng)，均為8 copies/反應(yīng)，而肉眼觀察沉淀的敏感性為80 copies/反應(yīng). 圖1 E為普通PCR檢測的敏感性，僅100~10-4稀釋度可見目的條帶，而10-5~10-7稀釋度未擴(kuò)增，可見其敏感性為800 copies/反應(yīng).

圖1 LAMP不同檢測方法及普通PCR檢測的敏感性比較

2.3 LAMP特異性

為評估LAMP的特異性，用優(yōu)化的HNB-LAMP檢測系統(tǒng)來擴(kuò)增菌株提取的DNA. 所有9株豬鏈球菌2型菌株均呈天藍(lán)色，而其他豬鏈球菌血清型菌株和陰性對照菌均呈紫色，見圖2，表明實驗建立的cps2J-HNB-LAMP對豬鏈球菌2型具有高度特異性.

圖2 LAMP特異性檢測

2.4 臨床樣品檢測

對10份臨床樣品進(jìn)行檢測， 結(jié)果表明其中5份樣品LAMP檢測為陽性，而普通PCR檢測全為陰性.

3 討論

近年來，基于PCR技術(shù)的分子檢測可用于檢測豬鏈球菌2型，但不適合基層推廣使用. 而LAMP檢測有優(yōu)勢，已被廣泛用于病原檢測，筆者建立了豬鏈球菌2型HNB-LAMP檢測方法，并比較了4種方法對LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測敏感性.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種方法檢測敏感性均高于普通PCR檢測，其中肉眼觀察沉淀法敏感性最低，其它3種方法敏感性相當(dāng)，但瓊脂糖凝膠電泳法需借助昂貴的電泳及成像系統(tǒng)，不利于基層推廣，同時電泳檢測需開蓋進(jìn)行，產(chǎn)物會在空氣中產(chǎn)生氣溶膠，在之后的檢測中產(chǎn)生假陽性［16］. SYBR GreenⅠ法不需要任何設(shè)備，但同樣要開蓋進(jìn)行，容易導(dǎo)致檢測假陽性. HNB法反應(yīng)不需開蓋，不會有氣溶膠溢出，可以減少假陽性，且反應(yīng)顏色穩(wěn)定，所以最終選擇HNB法對產(chǎn)物進(jìn)行檢測. 采用HNBLAMP檢測敏感性可達(dá)8 copies/反應(yīng)，與先前熒光定量PCR檢測豬鏈球菌2型方法相當(dāng)［14］，比普通PCR檢測的敏感性高了100倍，表明該法特異性好.

把建立的HNB-LAMP檢測方法應(yīng)用于臨床樣品檢測，結(jié)果表明10份臨床樣品，采用LAMP檢測出5份陽性，而采用普通PCR檢測全為陰性，說明LAMP比普通PCR檢測更適合于豬鏈球菌感染的檢測，究其原因是因為LAMP檢測敏感性遠(yuǎn)高于普通PCR檢測.同時考慮到臨床樣品檢測如需使用試劑盒提取DNA后進(jìn)行檢測將會提高費用，并延長檢測時間，實驗中樣品未經(jīng)試劑盒提取DNA來獲取較純DNA模板，而是僅經(jīng)過簡單預(yù)處理后煮沸10 min取上清液作為檢測模板，表明此方案可行. 該法50 min完成檢測，檢測結(jié)果可肉眼觀察，在檢測豬鏈球菌2型方面具有良好的臨床潛力，適合基層單位使用.