新疆部分焉耆馬場(chǎng)馬梨形蟲病病原學(xué)檢測(cè)及序列分析

諾明達(dá)來，甘 露，李 麗，劉 燕，呼爾查，3，巴音查汗

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.和靜縣畜牧獸醫(yī)站，新疆和靜 841300；3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)博士后流動(dòng)站，新疆烏魯木齊 830052）

馬梨形蟲?。╡quine piroplasmosis，EP）是經(jīng)硬蜱傳播，由馬泰勒蟲（Theileriae-qui，T.equi）和馬駑巴貝斯蟲（Babesia caballi，B.caballi）寄生于馬屬動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)引發(fā)一系列臨床癥狀的血液原蟲病，其主要臨床特征是急性溶血、高熱、呼吸困難和黃疸，急性感染時(shí)，易造成感染馬匹死亡[1-4]。

EP 流行的惡性循環(huán)由“馬匹-媒介蜱蟲-梨形蟲”等三要素構(gòu)成[5]。硬蜱是本病傳播媒介，對(duì)該病流行起著至關(guān)重要的作用[6]。據(jù)報(bào)道[7]，共有3 屬17 種媒介蜱可傳播此病，其中在我國(guó)可以傳播EP 的媒介蜱包括草原革蜱（Dermacentor nuttalli）、銀盾革蜱（Dermacentor niveus）、中華革蜱（Dermacentor sinicus）、邊緣革蜱（Dermacentor marginatus）等。由于新疆傳播EP 的媒介蜱銀盾革蜱和邊緣革蜱數(shù)量多、分布廣，馬匹存欄數(shù)居我國(guó)之首[8]，馬匹又以自然放牧為主，非常適于該病傳播，因此該病在新疆發(fā)生率較高，且呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)新疆馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展影響極大[9]。

焉耆馬是新疆特色品種，主要飼養(yǎng)于巴音郭楞蒙古自治州的和靜、和碩、焉耆縣等地。該品種馬匹的存欄量因多種原因在逐年減少，其中馬梨形蟲病是重要因素之一。為了解新疆地區(qū)焉耆馬場(chǎng)馬梨形蟲病流行情況，通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增的方法，2022 年在蜱蟲活躍季節(jié)（3—5月）對(duì)和靜縣某鄉(xiāng)村5 個(gè)焉耆馬場(chǎng)（1～5 號(hào)）采集全血樣品進(jìn)行EP 病原DNA 檢測(cè)，以獲得該地焉耆馬EP 流行資料，為制定有效的EP 防治措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 從新疆和靜縣1～5 號(hào)焉耆馬場(chǎng)，以隨機(jī)抽樣方式分別采集56、39、14、10、37 份，共156 份全血樣品置于EDTA 抗凝管中。其中，2～4、5～12、13～18 歲年齡段馬匹分別采集血液樣品12、105、39 份，公馬、母馬分別采集96、60 份。將全血樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，-20 ℃保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑：瓊脂糖、溴化乙錠，購(gòu)自Sigma 公司；賽百盛血液基因組DNA 提取試劑盒、AxyGEN DNA 凝膠回收試劑盒，均購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL 2 000 DNA Marker、2×EsTaqMaster Mix，購(gòu)自晶美有限公司。主要儀器：RADILAD20 臺(tái)式高速離心機(jī)，西班牙ORTOALRESA 公司生產(chǎn)；DK-600A 型電熱恒溫水浴鍋，上海恒溫科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；DYY-III-5 型電泳儀，北京六一公司生產(chǎn)；PCR 儀，美國(guó)Bio-Rad 公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取及PCR 擴(kuò)增 從EDTA 抗凝管中吸出200 μL 新鮮血液，加入Proteinase K 混勻，后續(xù)操作按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒步驟進(jìn)行。馬泰勒蟲、馬駑巴貝斯蟲18S rRNA 特異性引物擴(kuò)增，分別參照Kumar 等[10]、羅金等[11]提供的方法，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。PCR 反應(yīng)體系：2×EcoTaqPCR Super Mix 6.5 μL，上下游引物各1.0 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足至13.0 μL。馬泰勒蟲反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)。馬駑巴貝斯蟲反應(yīng)條件：除56 ℃ 退火45 s 外，其他條件與馬泰勒蟲反應(yīng)條件一致。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳，置于凝膠成像儀中拍照觀察。

表1 引物名稱及片段大小

1.2.2 克隆載體構(gòu)建及測(cè)序 將PCR 擴(kuò)增出現(xiàn)與目的片段一致的條帶，按照AxyGEN DNA 凝膠回收試劑盒說明書回收目的片段，膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體連接。連接體系為10 μL：pMD19-T載體1 μL、PCR 產(chǎn)物4 μL、solutionI 5 μL。冰浴30 min 后，再加入感受態(tài)細(xì)胞50 μL，熱激42 ℃、45 s，冰浴2 min，加入無抗性液體培養(yǎng)基900 μL，搖1 h；出現(xiàn)絮狀物后，10 000 r/min 離心4 min，棄掉850 μL上清，將剩余的150 μL吹打混勻，并把液體加入到含氨芐青霉素的普通固體培養(yǎng)基上涂布均勻，放入37 ℃恒溫箱，前30 min 正放，后倒放過夜；至普通固體培養(yǎng)基上長(zhǎng)出單菌落時(shí)進(jìn)行菌液PCR 檢測(cè)，將出現(xiàn)陽(yáng)性條帶的進(jìn)行保菌，保存至-80 ℃，然后送上海生工生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS Statistics 17.0 軟件分析血源性馬梨形蟲病病原不同地區(qū)、年齡、性別的分布差異，測(cè)序結(jié)果使用NCBI BLAST 進(jìn)行在線比對(duì)后，利用Megalign 與Mega11.0 生物學(xué)軟件中的鄰接法（NJ）進(jìn)行同源性比較及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建。分析模型為Tamura 3-parameter，進(jìn)行1 000次自主復(fù)制，以確定模型的穩(wěn)定性，最終獲得系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬梨形蟲病病原PCR 檢測(cè)

2.1.1 馬泰勒蟲PCR 擴(kuò)增 以18S rRNA 作為靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果在431 bp 處出現(xiàn)目的條帶，條帶大小與預(yù)期片段大小一致。

圖1 馬泰勒蟲PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.1.2 馬駑巴貝斯蟲PCR 擴(kuò)增 以BC-18S rRNA作為靶基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)12 g/L 瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果在452 bp 處出現(xiàn)目的條帶，條帶大小與預(yù)期片段大小一致。

圖2 馬駑巴貝斯蟲PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 三間分布分析

2.2.1 不同馬場(chǎng) 不同馬場(chǎng)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表2）顯示，5 個(gè)馬場(chǎng)的馬泰勒蟲總感染率為33.3%（52/156），馬駑巴貝斯蟲感染率為26.9%（42/156），兩者混合感染率為7.7%（12/156）。經(jīng)SPSS 17.0軟件分析，不同馬場(chǎng)的EP 病原感染率無顯著差異（P＞0.05），95%CI 為1.7%～88.0%。

表2 5 個(gè)焉耆馬場(chǎng)EP 病原感染情況

2.2.2 不同年齡馬匹 不同年齡馬匹的統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表3）顯示，各年齡段馬匹均有EP 病原感染，其中13～18 歲馬匹馬泰勒蟲感染率最高，2～4 歲馬匹馬駑巴貝斯蟲感染率最高。經(jīng)SPSS 17.0 分析，不同年齡段馬匹EP 病原感染率無顯著差異（P＞0.05），95%CI 為2.5%～72.7%。

表3 不同年齡焉耆馬場(chǎng)EP 病原感染情況

2.2.3 不同性別馬匹 不同性別馬匹統(tǒng)計(jì)結(jié)果（表4）顯示，公馬和母馬均有EP 病原感染，其中母馬感染率比公馬略高。經(jīng)SPSS17.0 分析，不同性別馬匹EP 病原感染率無顯著差異（P＞0.05），95%CI 為4.3%～38.9%。

表4 不同性別焉耆馬場(chǎng)EP 病原感染情況

2.3 病原核酸同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

2.3.1 核酸同源性比較 經(jīng)同源性比較，測(cè)序得到的馬泰勒蟲18S rRNA 基因序列與參考蟲株同源性為95.5%～100%（圖3），測(cè)序得到的馬駑巴貝斯蟲BC-18S rRNA 基因序列與參考蟲株同源性為98.6%～99.6%（圖4）。

圖3 馬泰勒蟲18S rRNA 基因同源性比對(duì)結(jié)果

圖4 馬駑巴貝斯蟲BC-18S rRNA 基因同源性比對(duì)結(jié)果

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，馬泰勒蟲18S rRNA 基因與馬泰勒蟲伊犁株（OL589505.1）位于同一分支上，進(jìn)化關(guān)系較近，與其他地區(qū)馬泰勒蟲株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。馬駑巴貝斯蟲BC-18S rRNA 與馬駑巴貝斯蟲新疆株（MT563457.1）聚于同一分支，進(jìn)化關(guān)系較近，與其他地區(qū)馬駑巴貝斯蟲株關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

圖5 馬泰勒蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖6 馬駑巴貝斯蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

EP 流行與馬匹自身免疫力、蜱帶蟲率以及環(huán)境密切相關(guān)，特別是攜帶EP 病原的硬蜱對(duì)該病傳播起著至關(guān)重要的作用，蜱蟲數(shù)量越多其攜帶EP病原的概率就越高[12]。EP 必須通過硬蜱傳播，而硬蜱主要在4—5 月活動(dòng)，因此本病的流行具有一定的季節(jié)性[13]。研究[14]發(fā)現(xiàn)，EP 主要集中發(fā)生于2—6 月和9—11 月兩個(gè)時(shí)間段，3—6 月為高發(fā)期，其中4—5 月為高峰期。而本次樣品采集時(shí)間在3—5 月，主要在5 月份，處于媒介蜱蟲活動(dòng)高發(fā)期，故EP 發(fā)生率較高。

本次檢測(cè)從新疆5 個(gè)焉耆馬場(chǎng)檢出EP 病原核酸陽(yáng)性82 份，總感染率為52.6%（82/156），其中馬泰勒蟲感染率為33.3%，馬駑巴貝斯蟲感染率為26.9%，兩者混合感染率為7.7%。新疆這5 個(gè)馬場(chǎng)的馬泰勒蟲感染率高于同地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬陽(yáng)性率（14.7%），而馬駑巴貝斯蟲感染率低于同地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬陽(yáng)性率（58.8%），這可能與圈養(yǎng)、散養(yǎng)的管理模式、飼養(yǎng)方式有一定的聯(lián)系[15]。新疆這5 個(gè)馬場(chǎng)的馬駑巴貝斯蟲感染率稍低于伊犁昭蘇地區(qū)的27.23%，馬泰勒蟲感染率略高于伊犁昭蘇地區(qū)的19.25%，這可能與氣候條件、飼養(yǎng)管理、預(yù)防措施等有關(guān)[16]。

綜上所述，新疆地區(qū)EP 流行較嚴(yán)重，因此要高度重視該病預(yù)防。首先要改變飼養(yǎng)方式，由自然放牧改為輪牧飼養(yǎng)，以減少馬匹與媒介蜱接觸的概率；其次要消滅媒介蜱，定期進(jìn)行季節(jié)性驅(qū)蜱，使用驅(qū)蜱劑對(duì)馬匹進(jìn)行藥物預(yù)防，以降低媒介蜱數(shù)量，阻斷病原傳播途徑；最后要加強(qiáng)對(duì)馬匹的EP 病原檢測(cè)及監(jiān)控，隨時(shí)反饋和分析數(shù)據(jù)，及時(shí)調(diào)整EP預(yù)防控制策略。

本研究選取新疆5 個(gè)焉耆馬場(chǎng)作為試驗(yàn)點(diǎn)，調(diào)查馬梨形蟲病病原感染情況。通過測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn)，馬泰勒蟲、馬駑巴貝斯蟲與各自參考蟲株的基因序列同源性分別為95.5%～100%、98.6%～99.6%；進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，馬泰勒蟲18S rRNA 基因與馬泰勒蟲伊犁株（OL589505.1）位于同一分支上，進(jìn)化關(guān)系較近，與其他地區(qū)馬泰勒蟲株進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。馬駑巴貝斯蟲BC-18S rRNA 與馬駑巴貝斯蟲新疆株（MT563457.1）聚于同一分支，進(jìn)化關(guān)系較近，與其他地區(qū)馬駑巴貝斯蟲株關(guān)系較遠(yuǎn)。由此表明，本地焉耆馬場(chǎng)的EP 主要通過當(dāng)?shù)仳缍Ｒ鞑?。本研究為地方蜱及蜱傳馬梨形蟲病防控提供了數(shù)據(jù)支持。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)：新疆地區(qū)焉耆馬場(chǎng)普遍存在不同程度的EP 病原感染，感染蟲株與本地蟲株進(jìn)化關(guān)系最近，表明本地焉耆馬場(chǎng)EP 主要通過當(dāng)?shù)仳缍Ｒ鞑?。因此，要高度重視該病預(yù)防，將馬匹由自然放牧改為輪牧飼養(yǎng)，定期進(jìn)行季節(jié)性驅(qū)蜱，同時(shí)加強(qiáng)EP 監(jiān)測(cè)，及時(shí)調(diào)整預(yù)防控制策略。