反轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)等溫擴增（RT-RAA）快速檢測基因2 型豬繁殖與呼吸綜合征病毒

陳 耀，仲欣雨，吳陳雨，丁 雪，黃 璟，王歡莉，2，范忠軍，2，孫 靜，陳星逸，余樹培，夏文龍，2

（1.鹽城師范學(xué)院海洋與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城 224007；2.鹽城市動物生物制劑工程技術(shù)研究中心，江蘇鹽城 224007；3.鹽城市畜牧獸醫(yī)站，江蘇鹽城 224001）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）隸屬套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，為有囊膜的單股正鏈RNA 病毒，基因組長約15 kb，由至少11 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）和兩端的非編碼區(qū)（untranslated region，UTR）構(gòu)成[1-2]。PRRSV 能夠引起以母豬繁殖障礙，仔豬死亡率升高，以及各年齡段豬呼吸障礙為主要癥狀的豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）[3]。自1987 年美國首次發(fā)現(xiàn)PRRSV 以來，該病毒迅速在世界范圍內(nèi)傳播，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失[4]。我國于1995 年首次成功分離到PRRSV，2006 年出現(xiàn)高致病性PRRSV（HP-PRRSV）。該毒株很快成為國內(nèi)主要流行株。2012 年，我國發(fā)現(xiàn)與美國NADC30 毒株高度同源的類NADC30 毒株（NADC30-like PRRSV）。這類亞型毒株致病性差異較大，并且自2016 年以來逐漸替代HP-PRRSV成為我國的主要流行株[5]。PRRSV 根據(jù)基因組差異可劃分為基因1 型（歐洲型）和基因2 型（美洲型）。目前國內(nèi)流行毒株以基因2 型為主，包括經(jīng)典毒株（C-PRRSV）、HP-PRRSV、NADC30-like PRRSV、類NADC34 毒株（NADC34-like PRRSV）等亞型[2]。PRRSV 易變異重組，毒株眾多，具有復(fù)雜的感染和免疫逃逸機制，現(xiàn)有疫苗保護效果欠佳，而且尚無有效的治療藥物[6]，因此難以根除、凈化，其防控須依靠疫苗免疫、早期監(jiān)測、生物安全管理等綜合措施，而快速、準確的檢測對PRRS 診斷和防控具有重要意義。

重組酶介導(dǎo)等溫擴增（recombinase-aided isothermal amplification，RAA）是一種新型核酸擴增技術(shù)，其核心組分包括重組酶、單鏈結(jié)合蛋白（single-strand DNA binding protein，SSB）和DNA聚合酶[7]。RAA 反應(yīng)首先由重組酶結(jié)合引物形成復(fù)合物，并在雙鏈DNA 模板中尋找靶序列；待復(fù)合物定位靶序列后，引發(fā)鏈置換反應(yīng)，引物結(jié)合到對應(yīng)模板上，被替換的DNA 鏈與SSB 結(jié)合，形成穩(wěn)定的D 狀環(huán)型（D-Loop）結(jié)構(gòu)；最后，由DNA聚合酶從引物3'端啟動DNA 合成，對靶序列進行指數(shù)性擴增[8]。反轉(zhuǎn)錄-重組酶介導(dǎo)等溫擴增（reverse transcription recombinase-aided isothermal amplification，RT-RAA）可實現(xiàn)對RNA 核酸模板的擴增[9]。該技術(shù)不需經(jīng)歷常規(guī)PCR 的變性、退火、延伸等程序，可在37～42 ℃恒溫條件下于20～30 min 內(nèi)完成擴增反應(yīng)，擴增結(jié)果可通過瓊脂糖凝膠電泳觀察；在反應(yīng)液中加入特制熒光探針后，還可通過熒光信號監(jiān)測儀、側(cè)流層析試紙條等方式判讀結(jié)果[10]。鑒于該技術(shù)具備快速、簡便，不依賴昂貴的熱循環(huán)擴增設(shè)備等優(yōu)勢，近年來被廣泛應(yīng)用于各種病原檢測，如非洲豬瘟病毒[11]、副溶血弧菌[12]、新城疫病毒[10]等。

PRRSV ORF6 基因負責(zé)編碼PRRSV 的主要結(jié)構(gòu)蛋白——囊膜蛋白M 蛋白。該基因序列保守度高，常被用于PRRSV 檢測[13]。本研究根據(jù)PRRSV ORF6 基因的保守序列，設(shè)計并篩選了特異性引物，建立了基因2 型PRRSV RT-RAA 檢測方法，以期為PRRS 快速診斷提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 毒株

基因2 型PRRSV JXA1 株、CH-1R 株、JS07株、SH1705 株，由江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室提供；豬偽狂犬病毒活疫苗（PRV Bartha-K61株）、豬細小病毒滅活疫苗（PPV S-1株）、豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗（PCV2 DBN-SX07 株）、豬傳染性胃腸炎病毒滅活疫苗（TGEV WH-1 株）、豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗（PEDV AJ1102 株），購自山東華宏生物工程有限公司。

1.2 主要試劑

RNA 恒溫擴增試劑盒-基礎(chǔ)型（RT-RAA 反應(yīng)試劑盒），購自濰坊安普未來生物科技有限公司；MiniBest Viral DNA/RNA Extraction Kit（病毒核酸提取試劑盒）、PrimeScript RT Master Mix（反轉(zhuǎn)錄試劑盒），購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（DNA片段純化試劑盒）、2×RapidTaqMaster Mix（PCR試劑盒）、DL 2 000 Plus DNA Marker，購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 核酸提取

根據(jù)MiniBest Viral DNA/RNA Extraction Kit提供的操作說明，分別提取PRRSV JXA1 株、CH-1R 株、JS07 株、SH1705 株，TGEV WH-1 株和PEDV AJ1102 株的RNA，以及PRV Bartha-K61株、PPV S-1 株、PCV2 DBN-SX07 株的DNA。所有病毒核酸樣品置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計

從NCBI 數(shù)據(jù)庫中下載基因2 型PRRSV 不同毒株的ORF6 基因序列，利用Lasergene 軟件中的MegAlign 程序分析其保守區(qū)域，根據(jù)RAA 反應(yīng)試劑盒提供的引物設(shè)計原則，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3 對特異性引物（表1），送至上海生工生物工程有限公司合成。

表1 RT-RAA 引物序列

1.5 反應(yīng)體系建立及引物篩選

根據(jù)RT-RAA 反應(yīng)試劑盒操作說明，分別利用上述3 對引物，在含凍干酶粉的反應(yīng)管中配置50.0 μL 反應(yīng)體系：Buffer A 29.4 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，無菌水13.1 μL，PRRSV JXA1 株RNA 模板1.0 μL（陰性對照以無菌水代替），Buffer B 2.5 μL。參考試劑盒推薦的反應(yīng)條件，將反應(yīng)管置于42 ℃水浴鍋中恒溫孵育30 min；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)DNA 片段純化試劑盒純化后，進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察并比較3 對引物的擴增結(jié)果。

1.6 反應(yīng)條件優(yōu)化

利用篩選出的最佳引物，按上述方法配置反應(yīng)體系，分別在34、36、38、40、42 ℃恒溫條件下反應(yīng)30 min，將擴增產(chǎn)物純化后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，篩選最佳反應(yīng)溫度；在最佳溫度條件下，將反應(yīng)時間分別設(shè)置為10、15、20、25、30 min，將擴增產(chǎn)物純化后通過瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，篩選最佳反應(yīng)時間。

1.7 特異性試驗

分別以PRRSV、TGEV 和PEDV 的RNA，以及PRV、PPV 和PCV2 的DNA 為模板，在上述最佳條件下進行RT-RAA/RAA 反應(yīng)，評價該方法的特異性。

1.8 靈敏度試驗

取5×105TCID50/mL PRRSV JXA1 株病毒液200 μL 用于RNA 提取，以50 μL 無核酸酶水洗脫重懸RNA 后，按10 倍倍比稀釋，獲得2×103～2×10-2TCID50/μL 共6 個梯度的PRRSV RNA，每個梯度分別取1 μL 作為模板，進行RT-RAA 反應(yīng)。此外，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒的操作說明，將PRRSV RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用相同引物進行常規(guī)RT-PCR 方法檢測，比較兩種方法的靈敏度。

1.9 臨床樣品檢測

2019—2021 年在江蘇省采集疑似PRRSV 感染的臨床樣品（血清、肺臟、脾臟、肝臟、死胎組織）共計39 份，將其提取RNA 后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，凍存于-20 ℃；分別用RT-RAA 方法和本實驗室前期建立的熒光定量RT-PCR 方法[14]，對39 份臨床樣品核酸進行檢測，比較兩種方法的一致性。

2 結(jié)果

2.1 引物篩選

分別利用3 對引物進行RT-RAA 反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）顯示：3 對引物均能擴增出較亮的、預(yù)期大小的目的條帶（分別為161、165、174 bp），陰性對照均無條帶。其中引物ORF6 F1/R1 的擴增產(chǎn)物條帶單一，而ORF6 F2/R2和ORF6 F3/R3 均出現(xiàn)了明顯的雜條帶，故選擇ORF6 F1/R1 作為最佳引物用于后續(xù)試驗。

圖1 不同引物的RT-RAA 擴增結(jié)果

2.2 反應(yīng)溫度優(yōu)化

以PRRSV RNA 為陽性模板，利用最佳引物，分別在不同溫度下進行RT-RAA 反應(yīng)。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖2）顯示，34～42 ℃均能擴增出目的條帶，并且40～42 ℃時條帶較亮，故選擇溫度較低的40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。

圖2 不同溫度下的RT-RAA 擴增結(jié)果

2.3 反應(yīng)時間優(yōu)化

在40 ℃下進行RT-RAA 反應(yīng)，分別反應(yīng)不同時間。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖3）顯示：15～30 min均可擴增出目的條帶，并且25～30 min 時條帶較亮，故選擇時間較短的25 min 作為最佳反應(yīng)時間。

圖3 不同反應(yīng)時間的RT-RAA 擴增結(jié)果

2.4 特異性評價

分別以不同豬源病毒核酸作為模板，在上述最佳條件下進行RT-RAA/RAA 反應(yīng)。結(jié)果（圖4）顯示：4 株P(guān)RRSV RNA 作為模板時，均可擴增出目的條帶，而其他病毒核酸檢測結(jié)果均為陰性，說明該方法和PRRSV 外的常見豬源病毒無交叉反應(yīng)，特異性強。

圖4 RT-RAA 特異性試驗結(jié)果

2.5 靈敏度評價

分別以2×103～2×10-2TCID50/μL 梯度的PRRSV RNA 作為模板，利用本研究建立的RT-RAA 方法進行靈敏度檢測。結(jié)果（圖5）顯示：該方法的最低檢出限為2×100TCID50/μL；而用相同引物進行的常規(guī)RT-PCR 最低檢出限為2×101TCID50/μL（圖6），說明RT-RAA 方法的靈敏度較高，是常規(guī)RT-PCR 方法的10 倍。

圖5 RT-RAA 靈敏度試驗結(jié)果

圖6 RT-PCR 靈敏度試驗結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測

利用本研究建立的RT-RAA 方法，對39 份疑似PRRSV 感染的臨床樣品進行檢測。結(jié)果顯示，共檢出陽性樣品25 份；同時用實驗室前期建立的熒光定量RT-PCR 方法對相同樣品進行檢測，結(jié)果與RT-RAA 方法完全一致。

3 討論

PRRSV 的準確檢測是快速診斷和有效防控PRRS 的前提。實驗室常規(guī)檢測方法包括病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA）、RT-PCR、熒光定量RT-PCR 等[13]。病毒分離和IFA 方法須培養(yǎng)PAM或Marc-145 細胞，耗時較長，并且有研究[5]表明，2016 年以來許多PRRSV 毒株不再適應(yīng)PAM 或Marc-145 細胞；ELISA 方法在PRRSV 感染早期未產(chǎn)生抗體的階段難以檢出；RT-PCR、熒光RTPCR 這類核酸檢測方法特異性強、靈敏度高，但需要昂貴的熱循環(huán)擴增設(shè)備。近年來，許多研究人員開發(fā)出了基于等溫擴增技術(shù)的PRRSV 快速檢測方法。浦靜等[15]建立了PRRSV 的反轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（RT-LAMP）檢測方法，在60 ℃恒溫作用2 h 即可完成基因2 型PRRSV 的特異性檢測；Tian 等[4]基于重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）和側(cè)流層析試紙條，建立了基因2 型PRRSV 的快速檢測方法，在42 ℃恒溫作用30 min 即可完成擴增反應(yīng)。這些等溫擴增檢測方法具有操作簡便、耗時短、不依賴昂貴儀器設(shè)備等優(yōu)勢，能夠滿足資源貧乏的基層實驗室或現(xiàn)場快速診斷需求。RAA 作為一種新型等溫擴增技術(shù)，由RPA 發(fā)展而來，二者基本原理相似，區(qū)別在于作為核心組分之一的重組酶來源不同，RPA 反應(yīng)的重組酶來自T4噬菌體，而RAA 反應(yīng)的重組酶來源更加廣泛（來自細菌或真菌），其成本更低[16]。近年來，RAA 技術(shù)在已被成功應(yīng)用于沙門氏菌[17]、棘球絳蟲[18]、豬流行性腹瀉病毒[19]、雞滑液囊支原體[20]等多種病原體的檢測中。本研究基于該技術(shù)建立了基因2 型PRRSV的RT-RAA 快速檢測方法。

合適的特異性引物是核酸擴增反應(yīng)的關(guān)鍵因素。PCR 反應(yīng)中引物可通過退火與模板鏈結(jié)合，而RAA 反應(yīng)中引物首先要與重組酶結(jié)合形成復(fù)合物，為保證其結(jié)合效率，引物長度一般為30～35 bp，長于PCR 引物，但較長的引物易形成二聚體或產(chǎn)生假陽性，因此通常需要設(shè)計多對引物進行篩選[21]。本研究以基因2 型PRRSV ORF6 基因為靶點，根據(jù)其保守序列設(shè)計了3 對引物，并篩選出了擴增效率較高且無雜條帶的最佳引物對，在此基礎(chǔ)上，優(yōu)化了反應(yīng)條件，在40 ℃水浴鍋恒溫孵育25 min 即可有效擴增靶序列。相比RT-LAMP方法，RT-RAA 方法引物設(shè)計更簡單，反應(yīng)溫度更低，反應(yīng)時間更短。需要注意的是，由于RT-RAA反應(yīng)體系中含較多重組酶、SSB 等蛋白質(zhì)成分，擴增產(chǎn)物須經(jīng)酚氯仿或DNA 片段純化試劑盒進行核酸純化，才能在瓊脂糖凝膠中獲得清晰的目的條帶，即便如此，相比常規(guī)的RT-PCR 方法，RT-RAA 不需要復(fù)雜的熱循環(huán)擴增儀，并且反應(yīng)時間較短，優(yōu)勢明顯。此外，RT-RAA 也可以RNA 為模板，一步法進行反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)，無需額外準備反轉(zhuǎn)錄試劑，簡化了操作過程。

本研究建立的RT-RAA 檢測方法特異性強，能有效檢出基因2 型PRRSV 不同毒株，并且和TGEV、PEDV 等其他常見豬源病毒無交叉反應(yīng)；靈敏度高，是常規(guī)RT-PCR 的10 倍。但高靈敏度很容易發(fā)生交叉污染造成假陽性，因此RT-RAA 試驗需嚴格分區(qū)進行。就本實驗室而言，反應(yīng)體系配置、陽性模板加樣、擴增反應(yīng)等各實驗區(qū)域均定期噴灑核酸清除劑，以消除潛在的陽性核酸片段污染。對39 份臨床樣品的檢測結(jié)果表明，RT-RAA 方法和熒光定量RT-PCR 方法的檢測結(jié)果完全一致，說明RT-RAA 方法具有較好的應(yīng)用價值，能夠用于臨床PRRSV 的快速檢測。